Durchflusszytometrische Isolation of Primary Murine Type II Alveolarepithelzellen für Funktionelle und Molekulare Studien

Zusammenfassung

Wir beschreiben die schnelle Isolierung von primären murinen Typ II Alveolarepithelzellen (AECII) mittels Durchflusszytometrie negative Selektion. Diese AECII zeigen eine hohe Rentabilität und Reinheit und sind für ein breites Spektrum von funktionellen und molekularen Untersuchungen hinsichtlich ihrer Rolle bei der respiratorischen Erkrankungen wie Autoimmun-und Infektionskrankheiten geeignet.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren hat sich der Beitrag des alveolären Typ II Epithelzellen (AECII), um verschiedene Aspekte der Immunregulation in der Lunge zunehmend anerkannt. AECII Es wurde gezeigt, der Zytokinproduktion in entzündeten Atemwegen teilzunehmen und sogar als Antigen-präsentierende Zellen sowohl Infektion und T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen ^1-8. Daher sind sie besonders interessant auch in klinischen Kontexten wie Atemwegs-Hyperreaktivität der Außen-und Selbst-Antigene sowie Infektionen, die direkt oder indirekt abzielen AECII. Allerdings bleibt unser Verständnis der detaillierten immunologische Funktionen durch alveolare Typ II Epithelzellen in der gesunden Lunge sowie bei Entzündungen serviert fragmentarisch. Viele Studien zur AECII Funktion erfolgt über Maus oder Mensch Alveolarepithelzellen Zelllinien ^9-12. Arbeiten mit Zelllinien bietet sicherlich eine Reihe von Vorteilen, wie zum Beispiel die Verfügbarkeit von großen Zahlen of Zellen für umfangreiche Analysen. Wir glauben jedoch, die Verwendung von primären murinen AECII ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle dieses Zelltyps in komplexen Prozessen wie Infektionen oder Autoimmunerkrankungen Entzündungen. Primäre murine AECII können direkt von Tieren, die an solchen Atemwegserkrankungen, das heißt, sie galten alle weiteren äußeren Faktoren eine Rolle spielen, in der analysierten Einstellung isoliert werden. Als ein Beispiel können lebensfähige AECII aus Mäusen intranasal mit Influenza A-Virus, das in erster Linie an diese Zellen zur Replikation ¹³ infiziert isoliert werden. Wichtig ist, dass durch die ex vivo Infektion AECII von gesunden Mäusen isoliert, können Untersuchungen der zellulären Reaktionen auf die Infektion montiert werden weiter ausgebaut.

Unser Protokoll für die Isolierung von primären murinen AECII auf enzymatische Verdauung des Mauslunge durch Markieren des resultierenden Zellsuspension mit Antikörpern, die für CD11c, CD11b, gefolgt F4/80 basiert,CD19, CD45 und CD16/CD32. Körnigen AECII werden dann als unmarkiertem und seitliche Streuung hoch (SSC ^hoch) Zellpopulation identifiziert und durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung ³ getrennt.

Im Vergleich zu alternativen Methoden zur Isolierung von primären Epithelzellen aus Mauslungen ergibt unserem Protokoll für die durchflusszytometrische Isolierung AECII durch negative Selektion unberührt, sehr überlebensfähig und pure AECII in relativ kurzer Zeit. Zusätzlich und im Gegensatz zu herkömmlichen Verfahren zur Isolierung durch Schwenken und Depletion von Lymphozyten durch Bindung von Antikörper-gekoppelten Magnetkügelchen ^{14, 15,} ermöglicht flusszytometrischen Zellsortierung Diskriminierung mittels Zellgröße und Granularität. Da Instrumentation für die durchflusszytometrische Zellsortierung zur Verfügung steht, kann das beschriebene Verfahren bei relativ niedrigen Kosten angewendet werden. Neben Standard-Antikörpern und Enzymen für Lungen-Zerfall, keine zusätzlichen Reagenzien wie z. B. magnetischeKügelchen benötigt. Die isolierten Zellen eignen sich für eine breite Palette von funktionellen und molekularen Studien, die in vitro Kultur und T-Zell-Stimulation Assays sowie Transkriptom-, Proteom oder Sekretom Analysen ^{3, 4} enthalten.

Protokoll

Details bezüglich erforderlichen Reagenzien und Materialien sind in der Tabelle am Ende des Protokolls unten aufgeführt. Vor Beginn der Arbeiten, bereiten 15 ml Röhrchen (eine pro Maus) mit 4 ml Dispase und Vorwärmen sie 37 ° C in einem Wasserbad. In einem Heizblock, kurz erhitzen kleinen Aliquots von 1% Low-Melt-Agarose (in Wasser) auf 95 ° C bis verflüssigt und anschließend kühlen bis 45 ° C bis zur Verwendung.

Ein. Vorbereitung der Maus Lung

1. Sacrifice der Maus durch CO ₂ Ersticken. Anmerkung: Führen Genickbruch da dies die Trachea verletzen wird, so dass im Anschluss Schritte des Protokolls, wie Installation der Lunge mit Flüssigkeit kann nicht erfolgreich durchgeführt werden. Stellen Sie sicher, Verlust von nozizeptiven Reflexen.
2. Sprühen Sie die Maus mit Ethanol und einen langen Schnitt entlang der ventralen Mittellinie des Körpers. Ziehen Sie das ventrale Fell und Haut und später auch sorgfältig geschnitten und entfernen Sie das Bauchfell.
3. Exsanguinate dieMaus, indem Sie die linke und rechte Halsschlagader (Vena jugularis) sowie die Nierenarterie (Arteria renalis). Entfernen fließt Blut mit Gewebe.
4. Sorgfältig Punktion und entfernen Sie dann die Membran, die Herz und Lunge durch Wegschneiden die Rippen aussetzen. Achten Sie besonders darauf, um die Lunge zu verletzen.
5. Mit einer 26G Kanüle und einer 10 ml-Spritze mit kalter Phosphat gepufferten Kochsalzlösung (PBS), Punktion der rechte Ventrikel des Herzens und der Lunge perfundieren mit PBS bis sie frei von Blut.
6. Schneiden und entfernen Sie die Speicheldrüsen die Luftröhre aussetzen. Auch sorgfältig schneiden die Muskeln rund um die Luftröhre.
7. Legen Sie eine 22G Verweilkanüle in die Luftröhre, entfernen Sie die Nadel und drücken Sie die Kunststoff-Katheter in Richtung der Lunge. Befestigen Sie den Katheter durch die Kopplung ein kleines Stück Garn um Luftröhre und Katheter.

2. Enzymatische Verdauung des Lungengewebes

Falls gewünscht, kann eine bronchoalveoläre Lavage Fluidprobe seinhergestellt durch Spülen der Lunge durch den Katheter in die Trachea mit PBS oder Medium eingeführt, bevor der nächste Schritt.

1. Verwendung einer 2 ml Spritze, sorgfältig instill ein maximales Volumen von 2 ml Dispase (aus 4 ml Aliquot) in die Lunge durch den Katheter, so dass alle Lappen vollständig expandiert werden. Tauschen Sie die Spritze mit einer 1 ml Spritze mit 0,5 ml des verflüssigten Agarose und auch in der Lunge zu vermitteln.
2. Lassen Sie die Spritze auf dem Katheter zum Rückfluss der Agarose zu verhindern und sofort in die Lunge mit Labor Seidenpapier und Eis. Lassen Sie das Agarosegel für ein paar Minuten.
3. Entfernen Sie das Seidenpapier, Eis, Spritze und Katheter, schneiden die Luftröhre und Verbrauchsteuern die Lunge, Herz und Thymus aus der Brust. Dann spülen die Lunge in einer Schüssel mit PBS und entfernen Sie das Herz, Thymus und die verbleibenden Luftröhre.
4. Setz die Lunge in den verbleibenden 2 ml Dispase und Inkubieren bei Raumtemperatur für 45 min.

3. Vorbereitung der LungeZellsuspension

1. Entfernen Sie die Lunge aus dem Dispase und übertragen sie in eine Schale mit 7 ml anti-CD16/32 Antikörper (1 ug / ml Endkonzentration) in DMEM-Medium und 100 ul DNase.
2. Mit Pinzette vollständig zerfallen das Lungengewebe durch Auseinanderziehen und inkubiere für 10 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln auf einer Wippe auf 200 Umdrehungen pro Minute. Falls gewünscht, kann die Zellsuspension dann bei 4 ° C bis zum nächsten Schritt gespeichert werden.
3. Filtern Sie die Zellsuspension durch Nylon Maschen zunächst mit 100 um und anschließend mit 70 um, 48 um und 30 um Poren. Kümmern, jeden Mesh sowie den Rohren und Geschirr gründlich mit DMEM spülen, um Verlust von Zellen zu minimieren und Ausbeute. Wenn Sie Pooling Proben werden, kann dies hier durch anschließendes Hindurchführen Zellen Suspensionen aus Mäusen der einen Gruppe durch das gleiche Filter erreicht werden. Erneuern Sie den Filter im Falle von Verstopfung.
4. Abhängig von dem Volumen, das Filtrat zu übertragen, um einen oder mehrere 50 ml-Tuben undzentrifugieren für 15 min bei 160 × g und 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
5. Resuspendieren des Zellpellets in 2 ml Erythrocyten Lysepuffer (0,15 M NH ₄ Cl, 0,01 M KHCO _3, 0,1 mM EDTA, pH 7,2) und schnell beenden Lyse durch Zugabe von 13 ml DMEM-Medium. Die Lösung wird in einem 15 ml Röhrchen und Zentrifuge für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.

4. Antikörperfärbung für die durchflusszytometrische Cell-Sortierung

1. Die Zellen in 3 ml primäre Antikörper-Cocktail, in DMEM-Medium in Verdünnungen für Durchflusszytometrie hergestellt. (Antikörper wurden bisher für optimale Arbeitsbedingungen Verdünnungen durch Färben 1 x 10 ⁶ Splenozyten in einem Volumen von 100 ul titriert. Formate 3 ml der primäre Antikörper-Cocktail mit den optimalen Konzentrationen für jede der verwendeten Antikörper für Zellen aus bis zu fünf Mäusen gepoolt. Wenn mehr Mäusen zu einer Probe vereinigt werden, die Lautstärke einstellen).
2. Zum Färben, inkubiere die Zellen für 10 min im Dunkelnbei 4 ° C.
3. Waschen der Zellen durch Füllen des Rohres mit 15 ml DMEM-Medium und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.
4. Bei ungekoppelten oder biotinyliert Antikörper wurden in 4,1 verwendet: Entfernen Sie den Überstand und die Zellen in 2 - 3 ml sekundären Antikörper-Cocktail. Färbemittel für 10 min bei 4 ° C im Dunkeln.
5. Waschen der Zellen durch Füllen des Rohrs mit DMEM und Zentrifugation für 12 min bei 160 × g und 4 ° C.
6. Die Zellen in 1 ml DMEM und Vorfilter durch einen 50 um Filter in ein Rohr für die Zell-Sortierung. Optional: Zählen Sie die Zellen, um die gesamte Zellzahl in der Lunge Zellsuspension zu erhalten.

5. Zellsortierung

1. Mischen Sie die Zellen durch Vortexen vor Sortierung. Verwenden Sie ein 100 &mgr; m Düse für Zell-Sortierung AECII. Umhüllungsfluid Druck sowie Laseremission und Detektionswellenlängen hängen vom Instrument zum flusszytometrischen Zellsortierung sowie den Fluorochromen im antib verwendetody Färbung.
2. Gate auf den SSC ^hohen Zellen, die negativ sind für den Fluorochromen zum Färben und Sortieren in ein Röhrchen mit DMEM verwendet. Verwenden Vorwärtsstreuung Höhe (FSC-H) vs Bereich (FSC-A) und seitwärts Streuung Höhe (SSC-H) vs Bereich (SSC-A) Fenster, um alle Dubletten oder Zellverbände auszuschließen (siehe Einzelheiten der Gating-Strategie Abbildung 1 a).
3. Um die sortierten Zellen Zentrifuge für 20 min bei 280 × g und 4 ° C gesammelt
4. Resuspendieren der Zellen in Kultur-Medium oder Puffer wie für die spätere Analyse erforderlich.

Ergebnisse

Beim Sortieren Lunge Zellsuspensionen aus gesunden Mäusen isoliert, wird die Gate-AECII typischerweise für etwa 42 ± 10% ausmachen aller Ereignisse. Dieser Prozentsatz kann merklich niedriger, wenn Mäuse mit Atemwegserkrankungen wie eine virale Infektion verwendet werden, wie die anfängliche Zellsuspension wird ein erheblich höherer Anteil von Lymphozyten und anderen Immunzellen rekrutiert zu den Atemwegen enthalten. Für AECII der IAV infizierten Lunge am Tag 3 nach der Infektion isoliert konnte eine Verringerung der Hä...

Diskussion

Unser Protokoll für die Isolierung von murinen AECII durchflusszytometrisch bietet einen schnellen Weg für den Zugriff primären Zellen aus der Maus Lunge für eine ganze Reihe von funktionellen und molekulare Studien. Das beschriebene Verfahren liefert sehr überlebensfähig und reine Populationen AECII, die in ausreichender Zahl zur direkten nachfolgenden Analysen, wie RNA-Isolierung (siehe Bild 2b) und Transkriptom Studien sind. Für funktionelle Anwendungen ist es auch möglich, die Kultur isolierte Zelle...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Namen Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Verweilkanüle Introcan 22G	Braun	REF 4252098B
Dispase, 100 ml (5000 caseinolytische Einheiten)	BD Biosciences	354235	Aliquot bis 4 ml in 15 ml Tuben, bei -20 ° C
Biozym Plaque Agarose	Biozym	840101	1% w / v in H 2 O
Desoxyribonuclease I aus Rinderpankreas, 2000 Kunitz-Einheiten / Fläschchen	Sigma-Aldrich	D4263	frisch aufzulösen Gehalt von 1 Ampulle in 300 ul DMEM
DMEM	Gibco	22320-022	verwendet wie vom Hersteller (Low G vorgesehenlucose, Pyruvat, HEPES)
Zelle Siebe (100 um, 75 um)	BD Falcon	352360, 352350
Nylon-Mesh (48 um, 30 um)	Bückmann GmbH	03-48/26-1020, 03-30/18-108
CellTrics 50 um-Filter	PARTEC	04-0042-2317
Anti-Maus-CD16/CD32	BioLegend	101302	Klon 93; gereinigten
Anti-Maus-F4/80	BioLegend	123116	Klon BM8; APC gekoppelten
Anti-Maus-CD11b	BioLegend	101208	Klon M1/70; PE gekoppelten
Anti-Maus-CD11c	BioLegend	117310	Klon N418; APC gekoppelten
Anti-Maus-CD45	BioLegend	103102	Klon 30-F11; gereinigten
Anti-Maus-CD19	eBioscience	12-0193-83	eBio 1D3; PE gekoppelten
polyklonalen Ziegen-Anti-Ratten-IgG	BD Pharmingen	550767	polyklonale, PE gekoppelten
			Antikörper gekoppelt alternative Fluorochromen verwendet werden, abhängig von dem Durchflusszytometer und Lasern zur Verfügung.