Methodenartikel

Mit RNA-Interferenz Feeding Strategy to Screen for Genes in Body Größe der Rechtsetzung in der Nematode Beteiligte C. elegans

DOI:

10.3791/4373

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13. Februar 2013

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1Department of Science, Borough of Manhattan Community College, City Universtiy of New York (CUNY), 2Department of Biology, Queens College, The City University of New York (CUNY), 3Biochemistry Program, The Graduate Center, Queens College, The City University of New York (CUNY)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir zeigen, wie die RNAi Fütterung Technik nutzen, um knock down Zielgene und Gäste Körpergröße Phänotyp C. elegans. Dieses Verfahren könnte für eine großtechnische Bildschirm verwendet werden, um potenzielle genetische Komponenten von Interesse, wie sie beispielsweise in der Körpergröße Regulierung durch DBL-1/TGF-β Signalgebung beteiligt sind.

Zusammenfassung

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Doppel-Strang-RNA-Interferenz (RNAi) ist eine effektive Strategie, um knock down Zielgenexpression 1-3. Es wurde in viele Modellsysteme einschließlich Pflanzen, Wirbellosen und Wirbeltieren angewendet worden. Es gibt verschiedene Methoden, um RNAi in vivo 4,5 zu erreichen. Zum Beispiel kann das Ziel-Gen kann in einen RNAi Vektor transformiert werden und dann entweder dauerhaft oder transient in Zelllinien oder primäre Zellen nach Gens Knockdown Effekte zu erzielen transformiert, alternativ synthetisierte doppelsträngige Oligonukleotide aus spezifischer Zielgene (RNAi Oligos) kann transient sein transformiert, in Zelllinien oder primäre Zellen nach Zielgene Schweigen; oder synthetisierten Doppelstrang-RNA-Moleküle können in einen Organismus mikroinjiziert werden. Seit dem Fadenwurm C. elegans verwendet Bakterien als Nahrungsquelle, die Fütterung der Tiere mit Bakterien, die doppelsträngige RNA gegen Zielgene bietet eine tragfähige Strategie 6. Hier präsentieren wir eine RNAi FütterungMethode punkten Körpergröße Phänotyp. Körpergröße in C. elegans primär durch die TGF-β reguliert wird - wie Ligand DBL-1, so dass dieser Assay geeignet ist zur Identifizierung von TGF-β Signalkomponenten 7. Wir verwendeten verschiedene Stämme, darunter zwei RNAi überempfindlich Stämme, die RNAi Fütterungsversuche wiederholen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass rrf-3-Stamm gab uns die besten erwarteten RNAi Phänotyp. Die Methode ist einfach durchzuführen, reproduzierbar und leicht zu quantifizieren. Darüber hinaus minimiert unser Protokoll die Verwendung von Spezialgeräten, so ist es für kleinere Laboratorien oder jenen an überwiegend Bachelor-Institutionen.

Protokoll

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Ein. Vorbereiten RNAi Feeding Plates Tragen Zielgensequenz

  1. Bei der Verwendung von kommerziell erhältlichen RNAi-Bibliotheken (zB von Quelle BioScience LifeSciences), fahren Sie mit Schritt 1.4. Alternativ klonen Target-Gensequenzen in Vektor L4440, ein häufig verwendetes Wurm RNAi Plasmid 8, Standard-Klonen Protokoll.
  2. Verwandeln Sie das rekombinante Plasmid in Bakterienstamm HT115 (DE3), Kultur sie auf LB-Agar-Platten mit 25 ug / ml Carbenicillin und 12,5 pg / ml Tetracyclin, und wählen Sie einen einzigen Klon für die zukünftige Verwendung.
  3. Unterdessen transformieren Leervektor L4440 in Bakterienstamm HT115 als Kontrolle für die Experimente verwendet.
  4. Kultur sowohl rekombinante und leer L4440-tragenden Bakterien in 1 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin über Nacht bei 37 ° C. Tetracyclin nicht hinzugefügt wird aufgrund der Tatsache, dass es RNAi Effizienz abnimmt.
  5. Weitere 5 ml LB-Medium mit 100 ug / ml Ampicillin in die Nacht culture, für etwa 4-6 h bei 37 ° C.
  6. Seed 0,5 ml rekombinanten oder leer L4440 tragenden Bakterienkultur auf die RNAi-Wurm Platten. Beschriften Sie alle Platten mit Klon Namen.
  7. Markieren Sie die Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C bis Bakterienrasen wachsen, das sind die RNAi Platten mit oder ohne Ziel Gensequenz. Mindestens 2 Platten sollten für jede Bedingung vorbereitet werden.

2. Kultur Worms auf den RNAi Feeding Plates

  1. Flamme sterilisieren die Spitze eines Platin Drahtwurm Wahl. Verwenden Sie den Wurm holen zu holen 6-10 vierten Larvenstadium (L4) Zwitter jedem RNAi Platte, die entweder rekombinante oder leer L4440 enthält; die Tiere werden die Bakterien als Nahrungsquelle zu nutzen.
  2. Lassen Hermaphroditen bei 20 ° C (ein Standard-Kulturbedingungen für C. elegans) über Nacht wachsen, werden sie als junge Erwachsene am nächsten Tag.
  3. Übertragen 6-10 jungen Erwachsenen in einer neuen entsprechend gekennzeichnet und vorbereitet RNAi Platte.
  4. Lassen Sie dieErwachsene legen Eier für 4-6 Stunden, dann entfernen Sie alle Erwachsenen von der Platte; dieser Schritt ist, um die Nachkommenschaft zu synchronisieren. Sobald die Mütter entfernt werden, beginnen zu zählen. Dies ist zeit Null.
  5. Die Inkubation bei 20 ° C zu lassen Tieren zu bestimmten Entwicklungsstadium wachsen; in diesem Protokoll, wählen wir junge Erwachsene für phänotypische Analyse. Für Niederschlägen, die in einem normalen Tempo zu entwickeln, ist 72-stündigen Inkubation ausreichend für die Tiere zu jungen Erwachsenen geworden. Allerdings wirken sich verschiedene Gene tierischen Entwicklung anders. Wenn RNAi verursacht Tiere mit einer anderen Rate wachsen, können junge Erwachsene wie die nicht mehr als 24 Stunden letzten L4 werden mit abgeschlossener Vulva Entwicklung und 2-6 Embryonen in die Gebärmutter (wenn fruchtbaren) identifiziert. Um andere Entwicklungsstadien zu erkennen, sollte der Prüfer Gonaden und Vulva Entwicklung als Leitfaden verwenden.

3. Ergebnis Body Size Phänotypen der RNAi behandelt Worms

  1. Zeigen zwei Schichten von farbigen Etikettenbänder auf einem Glasträger. Machen Sie zwei derse Glasträger. Dann legen Sie eine neue Glasplatte zwischen den beiden Folien mit Klebeband. Melt 2% Agarose in Wasser; einen Tropfen in die Mitte des neuen Glasträger; drücken Sie dann die zweite Glasplatte auf der Oberseite eine dünne Schicht von 2% Agarose wie zuvor beschrieben 9 machen.
  2. Sobald Agarose verfestigt wird, entfernen Sie die obere Glasplatte; der Schlitten mit Agarose-Pad ist bereit, Würmer zu laden. Label slide mit Klon Namen.
  3. Fügen Sie 10 ul 25 mM NaN 3 zu dem Agarose-Pad; holen 30-40 Tiere in die NaN 3-Lösung, um sie zu immobilisieren; dann legte Deckglas auf der Oberseite; wiederholen sowohl für rekombinante und leer L4440 tragenden RNAi-behandelten Tieren.
  4. Bild die Würmer unter Binokular mit 2.5x Objektiv; hier benutzen wir Leica Digitalkamera mit unterstützender Software Qcapture.
  5. Zur Kalibrierung ersten Aufnehmen eines Bildes eines Standard-Mikrometer-Herrscher. Dann öffnen Sie das Bild in Image-Pro Software, die auf "Messen" klicken und wählen Sie "Kalibrierung" und wählen Sie dann"Spatial Calibration Wizard". Mit "kalibrieren das aktive Bild" gewählt haben, auf "weiter" klicken. Geben Sie den Namen für die Kalibrierung und sicherzustellen, dass die Raumbezug Einheiten Mikrometer eingestellt sind. Dann überprüfen Sie die "eine Referenz Kalibrierung" und klicken Sie auf "weiter". Klicken Sie auf "draw Bezugslinie." Ein Verweis Maßstab erscheint. Neupositionierung des Maßstabsbalken, um die Enden des Mikrometers übereinstimmen, dann zeigen, dass die Referenz 1.000 Einheiten anzeigt. Klicken Sie auf "OK", "Weiter" und "Fertigstellen".
  6. Sobald die Software kalibriert ist, öffnet sich ein Wurm Bild. Dann, unter dem Menü "Messen", wählen Sie "Kalibrierung" und klicken Sie auf "select räumliche". In dem Pull-Down-Menü wählen Sie den Dateinamen für die Mikrometerkalibriervorrichtung erstellt. Dann, unter dem Menü "Messen", wählen Sie "Messungen." In dem sich öffnenden Fenster wählen Sie die freie Zeichnen Werkzeug und eine Linie durch die Mitte des tierischen Körpers von Kopf bis Schwanz mit Computer-Maus (Abbildung 1). Die Länge wird im Fenster anzuzeigen. JetztSie haben zwei Gruppen von Daten: Rumpflänge von Tieren mit Zielgen RNAi und Kontrolltieren mit leeren L4440 Vektor behandelt wurden.
  7. Exportieren Sie die Längenmessung in eine Microsoft Excel-Datei, oder einem anderen geeigneten statistischen Software. Analyse der Daten durch die Berechnung der Mittelwert und die Standardabweichung für jede Probe. Dann vergleichen Sie Proben mittels Student-t-Test.

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Ergebnisse

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In unserer Forschung konzentrieren wir uns auf die Körpergröße der Regulierung durch die DBL-1/TGF-β Weg. Der Verlust der Funktion der DBL-1-Weg führt zu geringe Körpergröße, einschließlich einer kürzeren Körper Länge im Vergleich mit Wildtyp-Tieren 7,10,11. So Bildschirme für C. elegans Körpergröße Mutanten, imstande sind, TGF-β-Signalisierung Komponenten und Modifikatoren. DBL-1-Signalisierung wird durch eine konservierte TGF-β Signalübertragungswegs, die Zelloberflächen-Rezeptoren und intrazellulä...

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Diskussion

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In diesem Protokoll beschreiben wir unsere Methode zur Identifizierung von Körpergröße Defektmutanten von C. elegans durch RNAi Fütterung. Dieses Verfahren ist anwendbar auf die Identifizierung von TGF-β-Signalisierung Komponenten. Da diese Komponenten stark durch Evolution 15 konserviert sind, sind solche Bildschirme relevant zur Aufklärung der molekularen Mechanismen der TGF-β-Signalisierung in allen Metazoen. Eine wichtige Überlegung bei der Gestaltung eines solchen Bildschirms ist der Ausgangssta...

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Offenlegungen

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

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Wir danken James Clark für die Bereitstellung Figuren von Tieren in verschiedenen Entwicklungs-Zeitpunkten. C. elegans-Stämme in dieser Studie wurden vom Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH National Center for Research Resources (NCRR) getragen wird erhalten. Diese Arbeit wurde von CIRG 1817 vom CUNY JL und CSD unterstützt und durch NIH 1R15GM073678-01 und 1R15GM097692-01 bis CSD Wir danken Dr. William J Rice, Dr. Nathalia Holtzman und Melissa Silvestrini für Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wurde in teilweiser Erfüllung der Anforderungen für eine Promotion an der Graduate Center der City University of New York (S. Xiong) durchgeführt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
RNAi-Wurm Platten
17,7 g Worm Medium Mix
60 g Agar
Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren.
3 ml 1M IPTG (steril) und 3 ml 25 mg / ml Carbenicillin (steril), dann gießen Sie in 60 mm Petrischalen.

Worm Platten
17,7 g Worm Medium Mix
0,6 g Streptomycinsulfat
60 g Agar
Hinzufügen H 2 O bis 3 Liter. Autoklavieren. Gießen Sie in 60 mm Petrischalen.

Worm Medium Mix
55 g Tris-Cl
24 g Tris-OH
310 g Bacto Peptone
800 mg Cholesterin
200 g NaCl
Gründlich mischen und achten Sie darauf, Stücke zu vermeiden, das pulverisierte Mischung kann für viele Monate vor der Verwendung gelagert werden.

2% Agarose
0,5 g Agarose
Anzeiged 25 ml dH 2 O. Hitze in der Mikrowelle bis zur Auflösung.

1M Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)
2 g IPTG
Lösen in10 ml dH 2 O

1M NaN 3
6,5 g NaN 3
Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml

25 mM NaN 3
2,5 ml 1M NaN 3
Hinzufügen dH 2 O auf 100 ml

Caenorhabditis elegans aus Caenorhabditis Genetics Center
L4440 Plasmid (trägt Ampicillinresistenzgen)
Bakterien-Stamm HT115 (DE3) (enthält IPTG induzierbaren T7-Polymerase; defizient für RNAse III-Gen (a dsRNAse), das auch für Tetracyclin-Resistenz-Gen) 16
60 mm Petrischalen
100 mm Petrischalen
14 ml Rundkolben Falcon Kulturröhrchen
Glasobjektträger
Deckgläschen
1-20 ul Pipette
20-200 ul Pipette
200-1000 ulPipette
1-200 ul Pipettenspitzen
200-1000 ul Pipettenspitzen
1,5 ml Eppendorf-Röhrchen
Platindraht Wurm Pick

Referenzen

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  1. Melnyk, C. W., Molnar, A., Baulcombe, D. C. Intercellular and systemic movement of RNA silencing signals. Embo J. 30, 3553-3563 (2011).
  2. Wall, N. R., Shi, Y. Small RNA: can RNA interference be exploited for therapy. Lancet. 362, 1401-1403 (2003).
  3. Kalantidis, K., Schumacher, H. T., Alexiadis, T., Helm, J. M. RNA silencing movement in plants. Biol. Cell. 100, 13-26 (2008).
  4. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Efficient and targeted delivery of siRNA in vivo. Febs. J. 277, 4814-4827 (2010).
  5. Amarzguioui, M., Rossi, J. J., Kim, D. Approaches for chemically synthesized siRNA and vector-mediated RNAi. FEBS Lett. 579, 5974-5981 (2005).
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  11. Liang, J., et al. The Caenorhabditis elegans schnurri homolog sma-9 mediates stage- and cell type-specific responses to DBL-1 BMP-related signaling. Development. 130, 6453-6464 (2003).
  12. Savage-Dunn, C. TGF-β signaling. WormBook. , 1-12 (2005).
  13. Simmer, F., et al. Loss of the putative RNA-directed RNA polymerase RRF-3 makes C. elegans hypersensitive to RNAi. Curr. Biol. 12, 1317-1319 (2002).
  14. Wang, D., et al. Somatic misexpression of germline P granules and enhanced RNA interference in retinoblastoma pathway mutants. Nature. 436, 593-597 (2005).
  15. De Robertis, E. M. Evo-devo: variations on ancestral themes. Cell. 132, 185-195 (2008).
  16. Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263, 103-112 (2001).

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Schlagwörter

RNA InterferenceRNAi FeedingGene KnockdownTGF beta SignalingMicroscopic ImagingLength MeasurementStudent s T testWorm Strains

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