Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Zusammenfassung

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit fluoreszierenden In situ Hybridisierung (FISH), um die Replikation des Säuger-Chromosomen Timing zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht den direkten Vergleich von neu geordnet und un-neu Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle.

Zusammenfassung

Säuger-DNA-Replikation initiiert an mehreren Stellen entlang Chromosomen zu verschiedenen Zeiten während der S-Phase, nach einer zeitlichen Replikationsprogramm. Die Spezifikation der Replikation Zeitpunkt wird angenommen, dass ein dynamischer Prozess, durch Gewebe-spezifische und Entwicklungsstörungen Cues, die als Reaktion auf epigenetische Modifikationen geregelt werden. Allerdings bleibt die Regulationsmechanismen, wo und wann die DNA-Replikation initiiert zusammen Chromosomen kaum verstanden. Homologen Chromosomen in der Regel synchron replizieren, aber es gibt Ausnahmen von dieser Regel. Zum Beispiel in weiblichen Säugerzellen eines der beiden X-Chromosomen wird späten replizierende durch einen Prozess als X-Inaktivierung ¹ bekannt. Zusammen mit dieser Verzögerung bei der Replikation Timing, schätzungsweise 2-3 Stunden sein, werden die Mehrzahl der Gene transkriptionell auf einem X-Chromosom zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus regelt eine diskrete cis-wirkende Locus, als die X-Inaktivierung Zentrum bekannt, diese X-Inaktivierung, einschließlich the Induktion verzögerte Replikation Timing auf dem gesamten inaktiven X-Chromosom. Darüber hinaus können bestimmte Chromosomenveränderungen in Krebszellen und Zellen gefunden Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zeigen eine signifikante Verzögerung bei der Replikation Timing von> 3 Stunden, wirkt sich auf die gesamte Chromosom ^2,3. Neuere Arbeiten aus unserem Labor zeigt, dass Störungen von diskreten cis-wirkenden autosomal loci Ergebnis in einem extrem spät replizierende Phänotyp, die das gesamte Chromosom ⁴ beeinflusst. Weitere 'Chromosom Engineering "Studien zeigen, dass bestimmte Chromosomenumlagerungen die viele verschiedene Chromosomen Ergebnis in diesem abnormen Replikation-Timing Phänotyp, was darauf hindeutet, dass alle Säugetiere Chromosomen diskrete cis-wirkenden Loci, die die Replikation ordnungsgemäß Zeitpunkt der einzelnen Chromosomen ^{5 zu} steuern enthalten.

Hier stellen wir ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chromosomenreplikation Timing mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung kombiniert. DiesVerfahren ermöglicht einen direkten Vergleich der Replikation Timing zwischen homologen Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle, und wurde aus ⁶ angepasst. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren für die eindeutige Identifizierung von chromosomalen Umordnungen, die mit Veränderungen in der Replikation Timing, das das gesamte Chromosom beeinflusst korrelieren. Diese Methode hat Vorteile gegenüber kürzlich entwickelten Hochdurchsatz-Mikro-Array oder Sequenzierung Protokolle, die nicht zwischen Allele unterscheiden präsentieren auf neu und Chromosomen un-umgeordnet können. Darüber hinaus, weil das hier beschriebene Verfahren wertet Einzelzellen kann Ermittlung von Änderungen in Chromosomenreplikation Timing auf chromosomale Rearrangements, die nur in einer Fraktion der Zellen in einer Population sind.

Protokoll

Ein. BrdU Incorporation (Terminal Labeling)

1. Platte Zellen auf etwa 70% Konfluenz in einer 150 mm Gewebekulturplatte 24 h vor der Zugabe von BrdU.
2. Ersetzen Medien mit frischem Komplettmedium, enthaltend 20 ug / ml BrdU (Sigma) zu geeigneten Zeitpunkten vor der Ernte. Die Länge der Zeit Zellen werden in Medien mit BrdU wird mit Zelltyp und Spezies variieren, typischerweise der G2 Phase dauert zwischen 2 und 5 h (Figur 1) kultiviert.

2. Chromosome Harvest of Monolayer-Zellkulturen

1. Entfernen Kulturmedien von der Platte und sammeln 10 ml in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Verbleibende Medien.
2. Spülen Zellen einmal mit 10 ml Pfeilhöhe [oder HBSS (Sigma)].
3. 5 ml 0,25% Trypsin in Pfeilhöhe (oder HBSS) an der Platte. Bei Raumtemperatur inkubieren, bis Zellen von der Platte abgelöst werden.
4. Hinzufügen trypsinisierte Zellsuspension in das Röhrchen mit dem 10 ml Medium aus Schritt 2.1.
5. Zentrifuge bei 400 × g für 10 min die Zellen zu pelletieren. Absaugen des Überstandes, so dass 0,5 ml Medium plus Zellpellet.
6. Resuspendieren Zellen gründlich durch Pipettieren mit einer Pasteurpipette.
7. 3 Tropfen hypotonen Lösung (0,075 M KCl (Sigma) erwärmt auf 37 ° C); mischen die Zellsuspension mit einer Pasteurpipette. 0,5 ml hypotonische Lösung und nochmals mit einer Pasteurpipette. Bringt Volumen hypotonischen Lösung auf 5 ml und mischen wieder. Bei 37 ° C für 20 bis 45 min, je nach Zelltyp.
8. Zentrifugation bei 400 xg für 10 min. Absaugen des Überstandes, so dass 0,5 ml Medium plus Zellpellet.
9. Zellpellet durch leichtes Ausklopfen des Rohres. Die osmotisch geschwollenen Zellen werden an dieser Stelle zerbrechlich, so sollte darauf geachtet werden, nicht die Cytoplasmamembranen stören.
10. 3 Tropfen Fixativ Carnoys (1:3 Eisessig: Methanol); Mischung durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Pasteur pipettE. 0,5 ml Fixiermittel und Mischung durch vorsichtiges Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Bringt Volumen Fixiermittelpartikel auf 5 ml und nochmals durch sanftes Pipettieren mit einer Pasteurpipette. Fixierten Zellen können im Dunkeln bei -20 ° C für mehrere Monate gelagert werden.
11. Zentrifuge und saugen wie in Schritt 2.8.
12. Zellpellet in frischem Fixativ; schätzen das Volumen des Pellets und Add ~ 10x das Volumen der Carnoys Fixativ.
13. Fügen Sie die Zellsuspension tropfenweise auf nassen, eiskalten Objektträger, halten die Folie bei einem ~ 45 °-Winkel und erlauben die Zellsuspension über die Oberfläche der Folie fließen. Legen Sie die Folie flach auf Papierhandtücher und Flut der Schieber mit Fixiermittel und an der Luft trocknen. Prüfen Dias auf die Anwesenheit von mitotischen Aufstriche mit einem inversen Mikroskop.

3. RNase Behandlung und Ethanol Dehydration

1. Platz 200 ul von 10 pg / ml RNase A (Sigma) in 2x SSC zu jeder Folie; inkubieren bei 37 & deg, C für 1 Stunde.
2. Wasch gleitet 3 mal mit 2x SSC, pH 7,0 bei Raumtemperatur für 3 min pro.
3. Dehydratisieren Dias durch eine EtOH (Sigma) (70%, 90% und 100%) bei Raumtemperatur für 3 min pro.
4. An der Luft trocknen Dias bei Raumtemperatur.

4. Vorbereitung der Probe Cocktails für BAC Plus-Chromosom-spezifischen Zentromer Enumeration Probe (CEP) oder für Whole Chromosome Paints In-situ-Hybridisierung

1. Für die BAC / CEP gleichzeitige Hybridisierung, bereiten zwei separate Sonde Cocktails für pre-Hybridisierung. Wir haben festgestellt, dass pre-Hybridisierung der BAC-und KEP-Sonden separat unter verschiedenen Stringenz Ergebnisse in weniger Hintergrund und größere Signalintensitäten. Wir haben auch gefunden, dass einzelne Fosmide kann auch anstelle von BAC-Klonen verwendet werden. Die Cocktail-Zubereitung beschrieben stellt die Volumina für eine einzelne Folie. Wenn die Bearbeitung mehrere Folien mit den gleichen Sonden erhöhen Sie einfach die Volumina appropr iately.

   * BAC DNA-Sonde Cocktail:

   11,5 ul Hybridisierungspuffer (50% Formamid (Sigma) / 2x SSC / Dextransulfat (Sigma)) 2 ul dH ₂ O

   2,5 ul BAC/Cot1 DNA in dH ₂ O (siehe unten für die Etikettierung Protokoll) 15 ul Gesamtvolumen

   * CEP-Sonde Cocktail:

   7 ul CEP Hybridisierungspuffer (65% Formamide/2x SSC / Dextransulfat) 2 ul dH ₂ O

   1 ul CEP/Cot1 DNA (gekauft prelabeled mit Spectrum Orange/Cy3/Texas Red) 10 ul Gesamtvolumen

   * Nach Denaturierung und pre-Hybridisierung (Schritt 5,1) Mix BAC Sonde mit CEP-Sonde bei einem 3:2-Verhältnis 25 ul / Dia-und Mix-Sonde Cocktails.

   OR

2. Aliquot 20 ul / slide von Whole Chromosome Paint-Sonde (Cy3/Texas Red) in ein Rohr. Gehen Sie zur Denaturierung und pre-Hybridisierung.

"> 5. Slide-und Probe-Denaturierung und In-situ-Hybridisierung

1. Denaturieren Sonde Cocktail (s) bei 75 ° C für 10 min. Bei 37 ° C prä-Hybridisierung für 30 Minuten, damit das DNA Cot1 zu repetitiven Sequenzen hybridisieren und anschließende Hybridisierung verhindern, um Chromosomen Metaphase.
2. Denaturieren Folien in Coplin Gläser in 70% Formamide/2x SSC, pH 7,0 bei 72 ° C für 3 min.
3. Unmittelbar dehydratisieren Dias durch eine EtOH (70%, 90% und 100%) in Coplin Gläser bei 4 ° C für 3 min pro.
4. Die Objektträger an der Luft bei Raumtemperatur trocknen.
5. Vorwärmen gleitet bis 45 ° C auf dem Objektträger wärmeren zu den letzten 10 min der Sonde vor hybridzation (Schritt 5.1). Mix Pre-hybridisierten Sonde Cocktails, wenn nötig, und fügen Sie 25 ul zu jeder Folie, sanft Ein Deckglas auf jeder Folie und Dichtung an allen Kanten mit Gummi Zement. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer, um Verdunstung zu verhindern.

6. Beitrag Hybridisierung Wäscht

1. Waschen Folien in Coplin Gläser 3 mal in 50% formamide/2x SSC, pH 7,0 bei 38 bis 40 ° C für 3 min pro. Die Temperatur kann zwischen den Waschvorgängen Sonden variieren. Bei hoher Hintergrund-Hybridisierung können Sie erhöhen die Temperatur der Wäschen. Umgekehrt, wenn das Signal schwach ist, und es gibt keinen Hintergrund, dann können Sie verringern die Temperatur dieser Wäschen.
2. Wash gleitet 1 Mal in PN-Puffer bei Raumtemperatur für 3 min, und die Detektion BrdU Schritt fort.

7. BrdU-Erkennung

1. Block Folien mit PNM-Puffer für 10 min (200 ul / Objektträger) bei Raumtemperatur im Dunkeln.
2. Lassen Sie gleitet durch Drehen am Rand auf einem Papiertuch. Je 100 ul Anti-BrdU-FITC (50 ug / ml Roche oder Millipore) im PNM-Puffer für 30 min bei 37 ° C.
3. Waschen Folien 3 mal in PN-Puffer bei Raumtemperatur für 3 min pro.
4. AbtropfenÜberschuß PN Puffer auf gleitet nacheinander durch Einschalten Kante auf einem Papiertuch. Fügen Sie 20 ul DAPI / antifade Montage-Lösung (Invitrogen). Decken Sie die Folie mit einem Papiertuch und drücken Sie auf dem Deckglas zu verdrängen Luftblasen und überschüssige Montagelösung. Gehen Sie zur Bildanalyse.

8. Aufnehmen von Bildern und Quantifizierung BrdU Incorporation

1. Die Bilder werden mit einer Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop und Olympus CCD-Kamera, 100x Objektiv, automatischer Filter-Rad und CytoVision Software (Applied Imaging) erfasst. BrdU eingefangen wird mit einem FITC-Filter; Chromosom Farben (Texas Red, Metasystems oder Cytocell) werden BAC (Cy3) und CEP (Vysis Spectrum Orange) Sonden wurden mit einer Texas Red oder Cy3-Filter; DAPI wird mit einem DAPI Filter (siehe erfasst Abbildungen 2 und 3).
2. Einzelnen Chromosomen von Interesse sind mit BAC / CEP oder Chromosom-spezifischen Farbe Sonden (2B und 3B) identifiziert. Mit Hilfedie CytoVision Software, jedes Chromosom von Interesse ist "cut-out" von der Metaphase Ausbreitung als Ganzes wird eine Gerade durch die entlang der Länge des Chromosoms aus kurzen Arm zu langen Arm (2C und 3C) gezogen. Die CytoVision Software wird verwendet, um die Pixel-Intensität entlang der Länge jedes Chromosoms zu quantifizieren. Die CytoVision Software berechnet die Fläche durch die Pixel besetzt und quantifiziert die Intensität der Pixel von den BrdU oder DAPI Signale zu jeder isolierte Chromosom repräsentiert. Die durchschnittliche Pixelintensität von jedem Chromosom dargestellt wird dann durch den Bereich durch diejenigen Pixel besetzt, um die Gesamtzahl von Pixeln (Tabelle 1 und Abbildung 4) zu erhalten, multipliziert. Darüber hinaus ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung von der jeweils replizierende Regionen der Chromosomen. Dementsprechend gestattet die bandförmig des BrdU-Einbaus zum Nachweis von aktiv replizierenden Regionen der Chromosomen, und Unterschiede in der Replikation Timing zwischen chromosome Paare werden als Unterschiede in diesem Bandenmuster (Abbildungen 2 und 3) zu sehen. Schließlich können diese Unterschiede im Bindungsmuster zu bekannten Replikation Zündungsmaps für jedes Chromosom ^6,7, die für eine Schätzung der Replikation Zeitdifferenz zwischen homologen Chromosomen oder Chromosomen-Arme ⁴ ermöglicht verglichen werden. Zum Beispiel ist in den beiden Chromosom 6 in 3A angezeigt einen Unterschied in Bandenmuster von> 2 h, wenn die normale Timing Replikation des Chromosoms 6 ⁴ verglichen.
   Darüber hinaus wurde ein ähnliches Verfahren wie hier beschrieben wurden erfolgreich für die Untersuchung des asynchronen Replikation Timing zwischen den inaktiven und aktiven X-Chromosomen ^8,9 verwendet. Die aktiven und inaktiven X-Chromosomen wurden mit Hilfe X-Chromosom Farben. Bilder wurden aufgenommen mit Quips MFISH Software (Vysis) und die Anzahl der Pixel von den Chromosomen X besetzt und die Anzahl der Pixel, die durch Fluoreszenz-la besetztbeschriftete BrdU wurden dann unter Verwendung NIH Image ( http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html ).

9. Nick Übersetzung von BAC-DNA für Fluoreszenzmarkierung (Vysis)

1. Fügen Sie den folgenden Sondenmischung zu kühlenden ein Mikrozentrifugenröhrchen:
   70 ul (4 ug DNA) in dH ₂ O
   10 ul 0,2 mM dUTP-Orange oder Grün
   20 ul 0,1 mM dTTP
   20 ul 10x Nick Translation Buffer
   40 ul NT dNTPs (minus dTTP)
   40 ul nick Translation Enzym
   200 ul Gesamtvolumen
   Inkubieren bei 16 ° CO / N. Die Reaktion durch Erhitzen auf 70 ° C für 10 min. Chillen auf Eis für 5 min.
2. Fällung der DNA mit Ethanol, indem Sie die folgenden Zeilen in die Sondenmischung:
   200 ul Probenlösung
   48 ul 3 M NaOAc
   160 ul Cot1DNA (.25 g / ul)
   1.200 ul 100% EtOH
3. Bei -80 ° C für 10 min auf O / N.
4. Spin in cold bei 12.000 xg für 20 min. Abdekantieren EtOH. Waschen 1 mal mit 70% EtOH. Spin wie zuvor. Abdekantieren EtOH. Air nur bis EtOH verdunstet trocknen. Resuspendieren in 40 ul dH ₂ O für Endkonzentration von 100 ng / ul BAC-DNA.

Ergebnisse

Ein Beispiel für die Replikation Timing-Analyse für den menschlichen Chromosoms 6 ist in Abbildung 2 dargestellt. Zellen, die eine Deletion des Gens ASAR6 ^4, bei 6q16.1 angeordnet wurden, um BrdU für 5 Stunden ausgesetzt werden, für mitotische Zellen geerntet und verarbeitet FISH mit einem Chromosom 6 Lack Sonde (Vysis) und für BrdU-Inkorporation. Beachten Sie, dass es einen signifikanten Unterschied in der BrdU Bandenmuster zwischen zwei 6 ist, ist die Übereinstimmung mit einer Verzögerung i...

Diskussion

Die Herstellung von Chromosom ausbreitet ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Replikation-Timing-Assay beschrieben. Der Einschluss eines Colcemid Vorbehandlungsschritt vor dem hypotonische Behandlung kann in der Frequenz und Ausbreiten des mitotischen Zellen zu unterstützen. Wir typischerweise freizulegen Zellen für 1-3 h colcemdi vor der Ernte und in einer Endkonzentration von 10 ug / ml Colcemid benutzen. Jedoch kann die Einbeziehung eines Colcemid Vorbehandlungsschritt verändern die Länge der G2 und fo...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 ug / ul
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Variiert
LSI / WCP Hybridisierungspuffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP Hybridisierungspuffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	MetaSystems Gruppe	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop	Olymp	BX61TRF-1-5
Microscope Imaging-Software-System	Applied Imaging	CytoVision 3.93.1
Digital Camera	Olymp	UCMAD3
			In situ Hybridisierung REZEPTE Formamid Lösungen 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) * Es ist wichtig zu Formamid bedienen, dass ist bei -20 ° C gelagert wurde Längerer Lagerung bei Raumtemperatur generiert Ameisensäure und den pH-Wert wkrank zu niedrig sein. 50% Formamide/2x SSC 25 ml Formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH 2 O zu Volumen PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Einen 0,1 M Lösung von Natriumphosphat jedes (Filter sterilisiert und speichert in 500 ml Aliquots). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O zu Volumen 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O auf Volumen. PN: Der pH-Wert von 0,1 M Na 2 HP0 4 bis pH 8,0 mit 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtern sterilisieren und 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Fettfreie Trockenmilch (Sigma) 25 ml PN-Puffer (Rezept siehe oben) Mix für 15-20 min unter ständigem Rühren. Spin 2 mal bei 400 × g für 10 min. Verwenden Überstand, und stellen Sie sicher nicht zu ausgefallene Milchproteine ​​stören.