Chromosome Replizieren Timing mit Fluorescent Kombiniert<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung

Zusammenfassung

Ein quantitatives Verfahren zur Analyse von Chromosomenreplikation Timing beschrieben. Das Verfahren nutzt BrdU Inkorporation in Kombination mit fluoreszierenden In situ Hybridisierung (FISH), um die Replikation des Säuger-Chromosomen Timing zu beurteilen. Diese Technik ermöglicht den direkten Vergleich von neu geordnet und un-neu Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle.

Zusammenfassung

Säuger-DNA-Replikation initiiert an mehreren Stellen entlang Chromosomen zu verschiedenen Zeiten während der S-Phase, nach einer zeitlichen Replikationsprogramm. Die Spezifikation der Replikation Zeitpunkt wird angenommen, dass ein dynamischer Prozess, durch Gewebe-spezifische und Entwicklungsstörungen Cues, die als Reaktion auf epigenetische Modifikationen geregelt werden. Allerdings bleibt die Regulationsmechanismen, wo und wann die DNA-Replikation initiiert zusammen Chromosomen kaum verstanden. Homologen Chromosomen in der Regel synchron replizieren, aber es gibt Ausnahmen von dieser Regel. Zum Beispiel in weiblichen Säugerzellen eines der beiden X-Chromosomen wird späten replizierende durch einen Prozess als X-Inaktivierung ¹ bekannt. Zusammen mit dieser Verzögerung bei der Replikation Timing, schätzungsweise 2-3 Stunden sein, werden die Mehrzahl der Gene transkriptionell auf einem X-Chromosom zum Schweigen gebracht. Darüber hinaus regelt eine diskrete cis-wirkende Locus, als die X-Inaktivierung Zentrum bekannt, diese X-Inaktivierung, einschließlich the Induktion verzögerte Replikation Timing auf dem gesamten inaktiven X-Chromosom. Darüber hinaus können bestimmte Chromosomenveränderungen in Krebszellen und Zellen gefunden Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zeigen eine signifikante Verzögerung bei der Replikation Timing von> 3 Stunden, wirkt sich auf die gesamte Chromosom ^2,3. Neuere Arbeiten aus unserem Labor zeigt, dass Störungen von diskreten cis-wirkenden autosomal loci Ergebnis in einem extrem spät replizierende Phänotyp, die das gesamte Chromosom ⁴ beeinflusst. Weitere 'Chromosom Engineering "Studien zeigen, dass bestimmte Chromosomenumlagerungen die viele verschiedene Chromosomen Ergebnis in diesem abnormen Replikation-Timing Phänotyp, was darauf hindeutet, dass alle Säugetiere Chromosomen diskrete cis-wirkenden Loci, die die Replikation ordnungsgemäß Zeitpunkt der einzelnen Chromosomen ^{5 zu} steuern enthalten.

Hier stellen wir ein Verfahren zur quantitativen Analyse von Chromosomenreplikation Timing mit Fluoreszenz in situ Hybridisierung kombiniert. DiesVerfahren ermöglicht einen direkten Vergleich der Replikation Timing zwischen homologen Chromosomen innerhalb der gleichen Zelle, und wurde aus ⁶ angepasst. Darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren für die eindeutige Identifizierung von chromosomalen Umordnungen, die mit Veränderungen in der Replikation Timing, das das gesamte Chromosom beeinflusst korrelieren. Diese Methode hat Vorteile gegenüber kürzlich entwickelten Hochdurchsatz-Mikro-Array oder Sequenzierung Protokolle, die nicht zwischen Allele unterscheiden präsentieren auf neu und Chromosomen un-umgeordnet können. Darüber hinaus, weil das hier beschriebene Verfahren wertet Einzelzellen kann Ermittlung von Änderungen in Chromosomenreplikation Timing auf chromosomale Rearrangements, die nur in einer Fraktion der Zellen in einer Population sind.

Protokoll

Ein. BrdU Incorporation (Terminal Labeling)

1. Platte Zellen auf etwa 70% Konfluenz in einer 150 mm Gewebekulturplatte 24 h vor der Zugabe von BrdU.
2. Ersetzen Medien mit frischem Komplettmedium, enthaltend 20 ug / ml BrdU (Sigma) zu geeigneten Zeitpunkten vor der Ernte. Die Länge der Zeit Zellen werden in Medien mit BrdU wird mit Zelltyp und Spezies variieren, typischerweise der G2 Phase dauert zwischen 2 und 5 h (Figur 1) kultiviert.

2. Chromosome Harvest of Monolayer-Zellkulturen

1. Entfernen Kulturmedien von der Platte und sammeln 10 ml in einem 15 ml konischen Zentrifugenröhrchen. Verble....

Ergebnisse

Ein Beispiel für die Replikation Timing-Analyse für den menschlichen Chromosoms 6 ist in Abbildung 2 dargestellt. Zellen, die eine Deletion des Gens ASAR6 ^4, bei 6q16.1 angeordnet wurden, um BrdU für 5 Stunden ausgesetzt werden, für mitotische Zellen geerntet und verarbeitet FISH mit einem Chromosom 6 Lack Sonde (Vysis) und für BrdU-Inkorporation. Beachten Sie, dass es einen signifikanten Unterschied in der BrdU Bandenmuster zwischen zwei 6 ist, ist die Übereinstimmung mit einer Verzögerung i.......

Diskussion

Die Herstellung von Chromosom ausbreitet ist ein entscheidender Schritt für die erfolgreiche Replikation-Timing-Assay beschrieben. Der Einschluss eines Colcemid Vorbehandlungsschritt vor dem hypotonische Behandlung kann in der Frequenz und Ausbreiten des mitotischen Zellen zu unterstützen. Wir typischerweise freizulegen Zellen für 1-3 h colcemdi vor der Ernte und in einer Endkonzentration von 10 ug / ml Colcemid benutzen. Jedoch kann die Einbeziehung eines Colcemid Vorbehandlungsschritt verändern die Länge der G2 und fo.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Anti-BrdU-FITC	Roche Millipore	11202593001 MAB326F	50 ug / ul
Nick Translation Kit	Abbott Molecular (Vysis)	07J00-0001
Spectrum Orange dUTP	Abbott Molecular (Vysis)	02N33-050
CEP	Abbott Molecular (Vysis)	Variiert
LSI / WCP Hybridisierungspuffer	Abbott Molecular (Vysis)	06J67-011
CEP Hybridisierungspuffer	Abbott Molecular (Vysis)	07J36-001
Chromosome paints	MetaSystems Gruppe	D-14NN-050-TR
Olympus BX61 Fluoreszenzmikroskop	Olymp	BX61TRF-1-5
Microscope Imaging-Software-System	Applied Imaging	CytoVision 3.93.1
Digital Camera	Olymp	UCMAD3
			In situ Hybridisierung REZEPTE Formamid Lösungen 70% Formamide/2x SSC 35 ml Formamid * (Sigma) 10 ml 10x SSC 5 ml d 2 H 2 0 pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) * Es ist wichtig zu Formamid bedienen, dass ist bei -20 ° C gelagert wurde Längerer Lagerung bei Raumtemperatur generiert Ameisensäure und den pH-Wert wkrank zu niedrig sein. 50% Formamide/2x SSC 25 ml Formamid (Sigma) 10 ml 10x SSC 15 ml dH 2 O pH-Wert auf 7,0 mit HCl (Sigma) 20x SSC, 4 L 702 g NaCl (Sigma) 358 g Na Citrate (Sigma) dH 2 O zu Volumen PN Buffer [0,1 M NaP0 4 0,1% NP_40 (Sigma)] Einen 0,1 M Lösung von Natriumphosphat jedes (Filter sterilisiert und speichert in 500 ml Aliquots). 0,1 M NaH 2 P0 4, 1 L 13,8 g NaH 2 P0 4 (Sigma): dH 2 O zu Volumen 0,1 M NaH 2 P0 4 1 L 14,2 g NaH 2 P0 4 (Sigma) dH 2 O auf Volumen. PN: Der pH-Wert von 0,1 M Na 2 HP0 4 bis pH 8,0 mit 0,1 M NaH 2 P0 4. Filtern sterilisieren und 1 ml NP-40. PNM 50 ml 1,25 g Fettfreie Trockenmilch (Sigma) 25 ml PN-Puffer (Rezept siehe oben) Mix für 15-20 min unter ständigem Rühren. Spin 2 mal bei 400 × g für 10 min. Verwenden Überstand, und stellen Sie sicher nicht zu ausgefallene Milchproteine ​​stören.