Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Methodenartikel

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

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DOI:

10.3791/4423

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21. Mai 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von Fibrin-Gerinnsel-Zelle In vitro Bietet eine standardisierte Methode für die Implantation.

Zusammenfassung

Die Behandlung von osteochondralen Gelenkdefekten stellt Ärzte seit vielen Jahren vor Herausforderungen. Das verbesserte Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gelenkknorpel und subchondraler Knochensubstanz in den letzten Jahren führte zu einer stärkeren Fokussierung auf die Wiederherstellung der gesamten osteochondralen Einheit. Im Vergleich zu knorpeligen Läsionen ist die Regeneration osteochondraler Defekte weitaus komplexer und stellt eine deutlich größere chirurgische und therapeutische Herausforderung dar. Das geschädigte Gewebe umfasst nicht nur die oberflächliche Knorpelschicht, sondern auch den subchondralen Knochen. Bei tiefen osteochondralen Schäden, wie sie beispielsweise bei der Osteochondrosis dissecans auftreten, muss die gesamte Defekttiefe ersetzt werden, um die Gelenkoberfläche wiederherzustellen¹. Geeignete therapeutische Verfahren müssen diese beiden unterschiedlichen Gewebe mit ihrem jeweils unterschiedlichen intrinsischen Heilungspotential berücksichtigen². In den letzten Jahrzehnten haben sich mehrere chirurgische Behandlungsoptionen entwickelt, die bereits klinisch etabliert sind^3–6.

Autologe oder allogene osteochondrale Transplantate bestehen aus Gelenkknorpel und subchondralem Knochen und ermöglichen den Ersatz der gesamten osteochondralen Einheit. Die Defekte werden mit zylindrischen osteochondralen Transplantaten aufgefüllt, die eine kongruente, mit hyalinem Knorpel bedeckte Oberfläche schaffen sollen ^3,7,8. Nachteile sind die begrenzte Verfügbarkeit von Transplantaten, die Morbidität an der Entnahmestelle (bei autologen Transplantaten) sowie die Inkongruenz der Oberfläche; dadurch ist der Einsatz dieses Verfahrens besonders bei großen Defekten eingeschränkt.

Neue Ansätze im Bereich des Gewebeengineerings haben vielversprechende Möglichkeiten für die regenerative osteochondrale Therapie eröffnet. Die Implantation autologer Chondrozyten markierte den ersten zellbasierten biologischen Ansatz zur Behandlung von Knorpelläsionen durchgehender Dicke und ist mittlerweile weltweit etabliert, mit guten klinischen Ergebnissen auch 10 bis 20 Jahre nach der Implantation ^9,10. Bis heute eignet sich diese Technik jedoch nicht zur Behandlung aller Läsionstypen, wie beispielsweise tiefer Defekte, die den subchondralen Knochen betreffen ¹¹.

Die Sandwich-Technik kombiniert die Knochentransplantation mit aktuellen Ansätzen des Gewebe-Engineering ^5,6. Diese Kombination scheint in der Lage zu sein, die bei osteochondralen Transplantaten allein beobachteten Einschränkungen zu überwinden. Nach autologer Knochentransplantation in den subchondralen Defektbereich wird eine mit autologen Chondrozyten besiedelte Membran darüber vernäht und erleichtert so die Anpassung der Topologie des Transplantats an die verletzte Stelle. Natürlich erfordert die vorherige Knochenrekonstruktion zusätzliche Operationszeit und oft sogar einen zusätzlichen Eingriff. Außerdem fehlen bisher Langzeitdaten ¹².

Das Gewebeengineering ohne zusätzliche Knochentransplantation zielt darauf ab, die komplexe Struktur und die Eigenschaften des nativen Gelenkknorpels durch das chondrogene und osteogene Potenzial der transplantierten Zellen wiederherzustellen. Allerdings wird erneut meist nur das Knorpelgewebe mehr oder weniger regeneriert. Zusätzliche osteochondrale Schäden erfordern eine spezifische weitere Behandlung. Um eine Regeneration der mehrschichtigen Struktur osteochondraler Defekte zu erreichen, könnten dreidimensionale, mit autologen/allogenen Zellen besiedelte, gewebeengineeringbasierte Produkte eine gute Regenerationskapazität bieten ¹¹.

Neben autologen Chondrozyten scheinen mesenchymale Stammzellen (MSC) eine attraktive Alternative für die Entwicklung eines vollständigen Knorpelgewebes zu sein. In zahlreichen präklinischen in vitro- und in vivo-Studien haben mesenchymale Stammzellen ein hervorragendes Geweberegenerationspotenzial gezeigt ^13,14. Der entscheidende Vorteil mesenchymaler Stammzellen, insbesondere für die Behandlung von osteochondralen Defekten, liegt darin, dass sie sich sowohl in Osteozyten als auch in Chondrozyten differenzieren können. Daher ermöglichen sie potenziell eine mehrschichtige Regeneration des Defekts.

In den letzten Jahren wurden daher mehrere Gerüste mit osteochondraler regenerativer Wirkung entwickelt und mit vielversprechenden vorläufigen Ergebnissen evaluiert ^1,15-18. Darüber hinaus hat sich Fibrinkleber als Zellträgermaterial zu einer der bevorzugten Techniken in der experimentellen Knorpelreparatur entwickelt und wurde bereits erfolgreich in mehreren Tierversuchen ^19-21 und sogar ersten humanen Studien ²² eingesetzt.

Das folgende Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark eines Kaninchens, zur anschließenden Vermehrung in Zellkultur sowie zur Herstellung eines standardisierten in vitro-Modells für Fibrin-Zell-Klumpen. Abschließend wird eine Technik zur Implantation vorab hergestellter Fibrin-Zell-Klumpen in künstliche osteochondrale Defekte des Kniegelenks des Kaninchens beschrieben.

Protokoll

A. Herstellung einer Donor Kaninchen zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (Chirurgie Zimmer)

Die Zellen werden von männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen im Alter von 4 Monaten und ca. 3 kg Körpergewicht isoliert.
Induce Narkose durch Propofol (10 mg / kg Körpergewicht iv) und opfern mit Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht iv).
Shave Fell von Hinterbeine, Rücken und Bauch mit einem elektrischen Haarschneider und absaugen Fell.
Desinfizieren Sie die rasierte Fläche gründlich mit 70% Ethanol.
Mit stumpfen Pinzette, scharfe Schere (oder Skalpell) und Knochen-Fräser für Gewebe und Bänder.