Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Markus T. Berninger; Gabriele Wexel; Ernst J. Rummeny; Andreas B. Imhoff; Martina Anton; Tobias D. Henning; Stephan Vogt

doi:10.3791/4423

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Methodenartikel

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

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DOI:

10.3791/4423

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21. Mai 2013

Markus T. Berninger¹^,² , Gabriele Wexel³ , Ernst J. Rummeny² , Andreas B. Imhoff¹ , Martina Anton³ , Tobias D. Henning^*²^,⁴ , Stephan Vogt^*¹

¹Department of Orthopaedic Sports Medicine, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ²Department of Radiology, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ³Institute of Experimental Oncology and Therapy Research, Klinikum rechts der Isar der Technischen Universität München, ⁴Department of Radiology, Uniklinik Köln

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von Fibrin-Gerinnsel-Zelle In vitro Bietet eine standardisierte Methode für die Implantation.

Zusammenfassung

Die Behandlung von osteochondralen Gelenkdefekten stellt Ärzte seit vielen Jahren vor Herausforderungen. Das verbesserte Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Gelenkknorpel und subchondraler Knochensubstanz in den letzten Jahren führte zu einer stärkeren Fokussierung auf die Wiederherstellung der gesamten osteochondralen Einheit. Im Vergleich zu knorpeligen Läsionen ist die Regeneration osteochondraler Defekte weitaus komplexer und stellt eine deutlich größere chirurgische und therapeutische Herausforderung dar. Das geschädigte Gewebe umfasst nicht nur die oberflächliche Knorpelschicht, sondern auch den subchondralen Knochen. Bei tiefen osteochondralen Schäden, wie sie beispielsweise bei der Osteochondrosis dissecans auftreten, muss die gesamte Defekttiefe ersetzt werden, um die Gelenkoberfläche wiederherzustellen¹. Geeignete therapeutische Verfahren müssen diese beiden unterschiedlichen Gewebe mit ihrem jeweils unterschiedlichen intrinsischen Heilungspotential berücksichtigen². In den letzten Jahrzehnten haben sich mehrere chirurgische Behandlungsoptionen entwickelt, die bereits klinisch etabliert sind^3–6.

Autologe oder allogene osteochondrale Transplantate bestehen aus Gelenkknorpel und subchondralem Knochen und ermöglichen den Ersatz der gesamten osteochondralen Einheit. Die Defekte werden mit zylindrischen osteochondralen Transplantaten aufgefüllt, die eine kongruente, mit hyalinem Knorpel bedeckte Oberfläche schaffen sollen ^3,7,8. Nachteile sind die begrenzte Verfügbarkeit von Transplantaten, die Morbidität an der Entnahmestelle (bei autologen Transplantaten) sowie die Inkongruenz der Oberfläche; dadurch ist der Einsatz dieses Verfahrens besonders bei großen Defekten eingeschränkt.

Neue Ansätze im Bereich des Gewebeengineerings haben vielversprechende Möglichkeiten für die regenerative osteochondrale Therapie eröffnet. Die Implantation autologer Chondrozyten markierte den ersten zellbasierten biologischen Ansatz zur Behandlung von Knorpelläsionen durchgehender Dicke und ist mittlerweile weltweit etabliert, mit guten klinischen Ergebnissen auch 10 bis 20 Jahre nach der Implantation ^9,10. Bis heute eignet sich diese Technik jedoch nicht zur Behandlung aller Läsionstypen, wie beispielsweise tiefer Defekte, die den subchondralen Knochen betreffen ¹¹.

Die Sandwich-Technik kombiniert die Knochentransplantation mit aktuellen Ansätzen des Gewebe-Engineering ^5,6. Diese Kombination scheint in der Lage zu sein, die bei osteochondralen Transplantaten allein beobachteten Einschränkungen zu überwinden. Nach autologer Knochentransplantation in den subchondralen Defektbereich wird eine mit autologen Chondrozyten besiedelte Membran darüber vernäht und erleichtert so die Anpassung der Topologie des Transplantats an die verletzte Stelle. Natürlich erfordert die vorherige Knochenrekonstruktion zusätzliche Operationszeit und oft sogar einen zusätzlichen Eingriff. Außerdem fehlen bisher Langzeitdaten ¹².

Das Gewebeengineering ohne zusätzliche Knochentransplantation zielt darauf ab, die komplexe Struktur und die Eigenschaften des nativen Gelenkknorpels durch das chondrogene und osteogene Potenzial der transplantierten Zellen wiederherzustellen. Allerdings wird erneut meist nur das Knorpelgewebe mehr oder weniger regeneriert. Zusätzliche osteochondrale Schäden erfordern eine spezifische weitere Behandlung. Um eine Regeneration der mehrschichtigen Struktur osteochondraler Defekte zu erreichen, könnten dreidimensionale, mit autologen/allogenen Zellen besiedelte, gewebeengineeringbasierte Produkte eine gute Regenerationskapazität bieten ¹¹.

Neben autologen Chondrozyten scheinen mesenchymale Stammzellen (MSC) eine attraktive Alternative für die Entwicklung eines vollständigen Knorpelgewebes zu sein. In zahlreichen präklinischen in vitro- und in vivo-Studien haben mesenchymale Stammzellen ein hervorragendes Geweberegenerationspotenzial gezeigt ^13,14. Der entscheidende Vorteil mesenchymaler Stammzellen, insbesondere für die Behandlung von osteochondralen Defekten, liegt darin, dass sie sich sowohl in Osteozyten als auch in Chondrozyten differenzieren können. Daher ermöglichen sie potenziell eine mehrschichtige Regeneration des Defekts.

In den letzten Jahren wurden daher mehrere Gerüste mit osteochondraler regenerativer Wirkung entwickelt und mit vielversprechenden vorläufigen Ergebnissen evaluiert ^1,15-18. Darüber hinaus hat sich Fibrinkleber als Zellträgermaterial zu einer der bevorzugten Techniken in der experimentellen Knorpelreparatur entwickelt und wurde bereits erfolgreich in mehreren Tierversuchen ^19-21 und sogar ersten humanen Studien ²² eingesetzt.

Das folgende Protokoll beschreibt eine experimentelle Methode zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus dem Knochenmark eines Kaninchens, zur anschließenden Vermehrung in Zellkultur sowie zur Herstellung eines standardisierten in vitro-Modells für Fibrin-Zell-Klumpen. Abschließend wird eine Technik zur Implantation vorab hergestellter Fibrin-Zell-Klumpen in künstliche osteochondrale Defekte des Kniegelenks des Kaninchens beschrieben.

Protokoll

A. Herstellung einer Donor Kaninchen zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (Chirurgie Zimmer)

Die Zellen werden von männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen im Alter von 4 Monaten und ca. 3 kg Körpergewicht isoliert.
Induce Narkose durch Propofol (10 mg / kg Körpergewicht iv) und opfern mit Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht iv).
Shave Fell von Hinterbeine, Rücken und Bauch mit einem elektrischen Haarschneider und absaugen Fell.
Desinfizieren Sie die rasierte Fläche gründlich mit 70% Ethanol.
Mit stumpfen Pinzette, scharfe Schere (oder Skalpell) und Knochen-Fräser für Gewebe und Bänder.
Einen Einschnitt entlang der Schädelbasis Oberfläche des Beines und Kalb.
Reflect Haut und des subkutanen Gewebes durch entweder scharf oder stumpf.
Separate Muskeln und Bänder von Schienbein und Oberschenkelknochen. Halten Schnitten als dicht am Knochen wie möglich, um eine saubere Zerlegung machen. Nicht trennen Oberschenkelknochen von Tibia zu diesem Zeitpunkt.
Cut through das Hüftgelenk, um den Kopf des Oberschenkelknochens aus der Gelenkpfanne zu trennen.
Elevate die Tibia-Femur komplex.
Verwenden Sie das Skalpell abkratzen alle verbleibenden Weichteile von den Knochen oder reiben die Knochen mit sterilen Tuch Gewebe. An diesem Punkt werden Femur und Tibia noch angeschlossen.
Entfernen Patella durch Schneiden, dann schneiden Kniegelenk Bänder zu trennen Knochen schließlich.
Spray getrennt Knochen mit 70% Ethanol, der Luft trocknen lassen und legen jeden Knochen in einen 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellkulturmedium (DMEM + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep)), um sie feucht.
Jetzt unter einem sterilen Zellkultur Laminarströmungshaube wechseln.

B. Flushing von Kaninchen MSC aus Knochen und Expansion (Cell Culture Hood)

Sammle Knochen von Rohren und legen Sie sie in 150 mm-Schalen mit einer sterilen Pinzette.
Entfernen Sie beide Knochen endet mit einer sterilen Säge und bewegen, um neue Stücke 150 mm Gerichte.
Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit medium (DMEM), legen eine 18-Gauge-Nadel und stecken Sie in die Öffnung des Knochenmarks.
Dann spülen Markhöhle mit mittlerer bis das Knochenmark in die Schüssel zu spülen. Anschließend, aus dem anderen Ende spülen, wenn möglich. Falls erforderlich, absägen mehr von den Enden. Wenn Knochen brechen sollte, nur spülen Sie das Innere des Knochens.
Saugen Zellmedium Suspension in der Spritze und spülen Sie das Knochenmark so oft, bis Suspension frei schwimmenden durch das Knochenmark Hohlraum und ohne weitere Knochenmark-Klumpen erscheinen.
Sobald Knochenmark wurde aus allen Knochen gesammelt worden, die Knochenmark Klumpen, indem sie durch eine 18-Gauge-Nadel stören: füllen Spritze mit Nadel und verdrängen in Medium.
Danach, filtern die Suspension durch einen Filter in eine Zelle 50 ml Tube. Um Zellen zu verhindern, waschen Kulturschale 2x mit 10 ml Medium und zu filtern sowie.
Zentrifuge Suspension bei 500 xg für 5 min bei RT.
Überstand entfernen und resuspendieren Zelle Pellet in 10 ml Medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
Separate Blutzellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und mesenchymale Stammzellen (MSC) mit einem Biocoll Trennlösung.
Füllen Sie 5 ml Biocoll Trennlösung in einen 15-ml-Tube und vorsichtig 5 ml Zell-Suspension auf und Zentrifuge bei 800 xg für 20 min bei RT (ohne Bremse).
Mögliche Ergebnisse siehe Abbildung 1: Sein dichter als Biocoll, rote Blutkörperchen Sediment auf den Boden, während PBMC und mesenchymalen Stammzellen an der Schnittstelle zu bleiben.
Entfernen Sie vorsichtig Schnittstelle in einen 15-ml-Tube und wäscht mit 5 ml PBS.
Zentrifuge wie in Schritt 22 beschrieben, resuspendieren in 5 ml PBS und 2-3x wiederholen.
Dann wieder Zentrifuge bei 350 xg für 10 min bei RT (mit Bremse).
Resuspendieren in 10 ml Medium und zählen Zellen in einer Zählkammer.
Teller Zellen bei einer anfänglichen Aussaatdichte von ca. 5 x 10 ⁶ in 150 mm-Schalen.
Nach 2-3 Tagen wiederbewegen nicht haftenden Zellen. Möglicherweise müssen Sie mit PBS erste Spülung, um Zelltrümmer zu entfernen. In frischem Vollmedium (DMEM + 10% Fetal Calf Serum (FCS) + 1% Pen / Strep) danach.
Füttern Zellen alle 3-4 Tage (Abbildung 2).
Nach 5-10 Tagen Durchgang die Zellen für die erste Zeit.

C. Herstellung von Fibringerinnseln in vitro

Am Tag der Implantation, lassen anhaftenden Zellen aus den Kolben / Geschirr von einem 3-min Exposition gegenüber 0,25% Trypsin-EDTA. Stoppen Trypsinierung indem Vollmedium.
Verteilen Sie Zellen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.
Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Zahlen von Trypanblaufärbung.
In 50.000 Zellen / Mikrozentrifugenröhrchens und sammeln Pellets durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei RT. Bereiten Sie eine mastermix für mindestens eine weitere Gerinnsel nach Bedarf.
Zellpellet in 17 ul PBS und mischen Sie 25 ul der Fibrinogen-Komponente von TISSUCOL-Kit mit diesem 17 ul MSC Suspension.
Nehmen Sie eine sterile Platte mit Vorbohrungen (3x3.6 mm) in Übereinstimmung mit den Bohrungen in vivo (Abbildung 3).
Zuerst impfen 4 ul Thrombin-Lösung (500 IU / ml) in einem Loch, durch sofortige Zugabe von 42 ul Fibrinogen-Zell-Suspension und wieder 4 ul Thrombin-Lösung an der Spitze gefolgt. Mischen Sie nicht die Aussetzung zu vermeiden Blutgerinnung in der Pipettenspitze. Zunächst wird die 50 ul Volumen des pipettierten Fibrinogen-Zell-Suspension der Rand der vorgebohrten Löcher ohne Schmelzen aufgrund der Oberflächenspannung vorstehen. Jedoch nach vollständiger Gerinnung (nach 60 min) das Gerinnsel zusammenzieht und passt in das vorgebohrte Loch.
Entfernen Sie das Gerinnsel vorsichtig mit einem stumpfen Pinzette und in einen Mikrozentrifugenröhrchens mit PBS. Bereiten 2 Blutgerinnsel / Tier.
Nehmen Sie die Klumpen an den Operationssaal.

D. Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Induce Anästhesie, Kaninchen (NZW, männlich, 3,5-4,0 kg Körpergewicht, 5-6 Monate alt) durch iv-Injektion von Propofol (10 mg / kg Körpergewicht).
Rasur das Knie auf mit einem elektrischen Haarschneider und Vakuum das Fell betrieben werden. Alle Verfahren genannt werden, bevor in einer Operation Herstellung Raum, um eine Verunreinigung der sterilen Umgebung des Operationssaals vermeiden durchgeführt.
Nach der Intubation Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5 mg / kg / min Propofol und 0,05 mg / kg / min Fentanyl intravenös. Überwachen Anästhesie mit Kapnographie, Pulsoximetrie und Pulsfrequenz.
Desinfizieren Sie die Knie rasiert gründlich und decken den Rest der Kaninchen mit einem sterilen Verband.
Ertasten Sie die Patella und führen Sie einen Hautschnitt medial der Patella.
Öffnen Sie das Kniegelenk durch eine medial parapatellaren Arthrotomie unter sterilen Bedingungen. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden alle kleinen oberflächlichen Blutgefäße.
Anschließend verdrängt man das Patella seitlich (Abbildung 4).
Nach InSpektion des Kniegelenks für jegliche begleitende Knorpelschäden oder gemeinsamen Anomalien, erstellen Sie zwei osteochondralen Defekten (3 mm tief, Achter-Form) in der Trochleagrube mit steriler Luft Betriebsleistung Bohrer (3,6 mm Durchmesser) mit einem Stopp-Gerät (Abbildung 5).
Reinigen Sie die Mängel und spülen Sie sie mit steriler Kochsalzlösung.
Vor der Implantation füllen 20 ul Fibrinkleber in die Defekte und verteilt sie gleichmäßig auf dem Boden der fehlerhaften Stelle.
Dann implantieren Blutgerinnsel im Preßsitz in der Acht-förmigen Defekt.
Nach Gerinnung, verlagern die Kniescheibe im Trochleagrube und beugen und strecken das Knie ein paar mal.
Anschließend verdrängt man das Patella seitlich noch einmal und überprüfen Sie, ob Fibrinogen-Zell-Klumpen sind noch an Ort und Stelle.
Ersetzen Sie die Patella wieder und beenden Sie den Vorgang mit Wundverschluss in Schichten mit einzelnen Knopf Nähte (4-0 Vicryl) und eine kontinuierliche Hautnaht (4-0 Monocryl) (beide mit resorbierbares NahtmaterialMaterial).
Schließlich versiegeln die Wunde mit einem Spray Dressing wasserdampfdurchlässig.
Für die postoperative Versorgung wird die Wunde täglich für 7 Tage überprüft. Die Kaninchen erhalten zur postoperativen Analgesie Carprofen 4 mg / kg sc alle 24 h (für 4 Tage) und Buprenorphin 0,03 mg / kg sc alle 12 h (2,5 Tage). Eine Stabilisierung des Knies (z. B. Verband) ist nicht erforderlich.