Untersuchung der DNA Damage Checkpoint mit<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Auszüge

Zusammenfassung

Xenopus Eiextrakt ist ein nützliches Modellsystem, um die DNA-Schäden Prüfpunkt untersuchen. Dieses Protokoll ist für die Herstellung von Xenopus Ei-Extrakten und DNA-Schaden induzierenden Prüfpunkt Reagenzien. Diese Techniken sind an eine Vielzahl von DNA-schädigenden Ansätze in der Untersuchung der DNA-Schädigung Prüfpunkt Signalisierung.

Zusammenfassung

Auf einer täglichen Basis, werden die Zellen zu einer Vielzahl von endogenen und Umwelteinflüssen ausgesetzt. Um diese Beleidigungen zu bekämpfen, haben Zellen DNA damage checkpoint Signalisierung als Überwachungs-Mechanismus, um DNA-Schäden und direkte zelluläre Antworten auf DNA-Schäden spüren entwickelt. Es gibt mehrere Gruppen von Proteinen namens Sensoren, Wandlern und Effektoren in DNA damage checkpoint-Signalisierung (Abbildung 1) beteiligt. In diesem komplexen Signalwegs ist ATR (ATM und Rad3-bezogen) einer der wichtigsten Kinasen, die zu DNA-Schädigungen und Replikation Streß reagieren. Activated ATR kann phosphorylieren seine nachgelagerten Substrate wie Chk1 (Checkpoint Kinase 1). Folglich phosphoryliert und aktiviert Chk1 führt zu viele stromabwärts Wirkungen in der DNA-Schädigung Prüfpunkt einschließlich Zellzyklusarrest, Transkriptionsaktivierung, DNA-Schäden zu reparieren und Apoptose oder Seneszenz (Abbildung 1). Wenn DNA beschädigt ist, es nicht die DNA damage checkpoint Ergebnisse in UNREP aktivierenausgestrahlt Schäden und anschließend genomische Instabilität. Die Untersuchung der DNA damage checkpoint wird klären, wie Zellen genomischen Integrität zu erhalten und ein besseres Verständnis davon, wie Krankheiten, wie Krebs, zu entwickeln.

Xenopus laevis Ei Extrakte werden als starke zellfreien Extrakt Modellsystem in DNA-Schädigung Prüfpunkt Forschung entstehen. Low-Speed-Extrakt (LSE) wurde ursprünglich von der Masui Gruppe ¹ beschrieben. Die Zugabe von demembranated Spermienchromatin LSE Ergebnisse in Keimbildung, wo DNA in einem semikonservativen fashion einmal pro Zellzyklus repliziert wird.

Die ATR/Chk1-mediated Checkpoint-Signalweg ist durch DNA-Schädigung oder Replikation Stress ² ausgelöst. Zwei Methoden werden derzeit verwendet, um die DNA damage checkpoint induzieren: DNA-schädigende Ansätze und DNA-Schäden-ähnlichen Strukturen ^3. DNA-Schädigung durch Ultraviolett (UV)-Bestrahlung, γ-Bestrahlung, induziert werden Methyl methanesulfonate (MMS), Mitomycin C (MMC), 4-nitrochinolin-1-oxid (4-NQO) oder Aphidicolin ^{3, 4.} MMS ist ein Alkylierungsmittel, das DNA-Replikation hemmt und aktiviert der DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt ^4-7. UV-Bestrahlung löst auch die ATR/Chk1-dependent DNA damage checkpoint ^8. Die DNA-Schädigung nachahmende Struktur AT70 ist ein Komplex aus zwei getemperten Oligonukleotide Poly-(dA) 70 und Poly-(dT) 70. Die AT70 System wurde Bill Dunphy Labor entwickelt und wird häufig verwendet, um ATR/Chk1 Checkpoint Signalisierung ^9-12 induzieren.

Hier beschreiben wir Protokollen (1) bis zellfreie Extrakte Ei (LSE) herzustellen, (2) an Xenopus Spermienchromatinstruktur mit zwei verschiedenen DNA schädigen Ansätze (MMS und UV), (3) zu behandeln, um die DNA-Schäden-nachahmende Struktur vorzubereiten AT70, und (4) die DNA-Schädigung ATR/Chk1-mediated Prüfpunkt in LSE mit beschädigten Spermienchromatinstruktur oder einem DNA-Schaden-nachahmende Struktur auslösen.

Protokoll

Ein. LSE Vorbereitung

1. Female Fröschen (Xenopus laevis) zweimal für Eiersammlung injiziert. Die erste Injektion (Grundierung) 100 U PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) pro Frosch. Frösche muss grundiert mindestens zwei Tage vor induzierende Eiablage und grundiert Frösche sind geeignet für bis zu zwei Wochen. Um prime Frösche, injizieren PMSG subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einem 3 ml-Spritze und 27 G Nadel.
2. Um Eiablage zu induzieren, zu injizieren 500 U hCG (humanes Chorion Gonadotropin) pro grundiert frog subkutan in die dorsale Lymphsäcke mit einer 27 G Nadel. Inkubieren injizierten Frösche in separaten Eimer mit 2 Liter 1x M....

Diskussion

Es gibt mehrere Vorteile bei der Untersuchung der DNA-Schädigung unter Verwendung Prüfpunkt Xenopus Ei-Extrakten. Die Verwendung von Ei-Extrakten stellt eine große Menge von zellfreien Extrakten in Interphase des Zellzyklus synchronisiert. Die Ei-Extrakten kann leicht und kostengünstig hergestellt werden. Es ist relativ leicht zu DNA oder Chromatin beschädigen und einen Defekt in der DNA-Schädigung Checkpoint nach immunodepleting eines Zielproteins aus Eiextrakt offenbaren. Anschließend kann eine potentielle Fu.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Reagenzien
Anti-Chk1 P-S344 Antikörper	Cell Signaling	2348L
Anti-Chk1 Antikörper	Santa Cruz	SC7898
Aprotinin	MP Biomedicals	0219115880
Cycloheximid	Sigma	C7698-5G
Cytochalasin B	EMD	250233
Dithiothreitol (DTT)	VWR	JTF780-2
hCG	Sigma	CG10-10VL
L-Cystein	Sigma	C7352-1KG
Leupeptin	VWR	97063-922
Methylmethansulfonat (MMS)	Sigma	129.925-5G
Nocodazol	Sigma	M1404-2MG
PMSG	Calbiochem	367222
Probenpuffer	Sigma	S3401
Tautomycin	Wako Chemicals USA	209-12041
			Ausrüstung
Eimer für die Eiablage	Rubbermaid Commercial Products	6308
CL2 IEC Zentrifuge mit Ausschwingrotor	Thermo Scientific	004260F
HB6 Ausschwingrotor	Thermo Scientific	11860
Sorvall RC6 Plus Superspeed-Zentrifuge	Thermo Scientific	46910
UV-Crosslinker	UVP	95-0174-01
			Lösungen
1x MMR			100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0,5 mM MgSO 4, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH auf 7,8 mit 10 M NaOH
Aprotinin / Leupeptin Lager			10 mg / ml in Wasser. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -80 ° C.
Buffer X			0,2 M Sucrose, 80 mM KCl, 15 mM NaCl, 5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH auf 7,5 mit HCl
Cycloheximid Lager			10 mg / ml in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C.
Cytochalasin B Lager			5 mg / ml in DMSO. Bewahren Sie 20 ul Aliquots bei -20 ° C.
Dithiothreitol (DTT) stock			1 M in Wasser. Store 1 ml Aliquots bei -20 ° C.
ELB			0,25 M Saccharose, 1 mM DTT, 50 ug / ml Cycloheximid, 2,5 mM MgCl 2, 50 mM KCl, 10 mM HEPES, pH7.7
Nocodazol Lager			10 mg / ml in DMSO. Bewahren 5 ul Aliquots bei -80 ° C.
Energie Mixture			375 mM Creatinphosphat, 50 mM ATP und 25 mM MgCl 2. Aliquots werden bei -80 ° C gespeicherten
Nuclear Farbstofflösung			0,4 ug / ml Hoechst 33258, 25% Glycerin(V / v), in 1x PBS
Tautomycin Lager			100 uM in DMSO. Bewahren Sie 10 ul Aliquots bei -80 ° C.