Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.
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Methodenartikel
Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die Rezeptor-zwischen der Plasmamembran (PM) und intrazellulären Kompartimenten erfordert einen experimentellen Ansatz mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus muss ein solcher Ansatz haben auch die Fähigkeit an Rezeptoren auf der PM von denen in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert unterscheiden. Am wichtigsten ist, Erfassen Rezeptoren in einem Vesikel erfordert herausragende Nachweisempfindlichkeit, da jedes Vesikel trägt nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren. Standard-Ansätze zur Untersuchung Rezeptortransport gehören Oberfläche Biotinylierung durch biochemische Detektion, die sowohl die erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung fehlt folgt; und Fluoreszenzmikroskopie Prüfung immunmarkierten Oberflächenrezeptoren, die chemische Fixierung von Zellen erfordert und daher keine ausreichende zeitliche Auflösung 1-6. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir und andere entwickelt und eingesetzt eine neue strategischetegie, dass ermöglicht die Visualisierung des dynamischen Einfügen von Rezeptoren in der PM mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung 7-17. Der Ansatz enthält Tagging von einem pH-sensitiven GFP, das superecliptic pHluorin 18, an den N-terminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors. Superecliptic pHluorin hat die einzigartige Eigenschaft, Fluoreszenz bei neutralem pH-Wert und nicht fluoreszierenden bei saurem pH (pH <6,0). Daher sind die markierten Rezeptoren nicht fluoreszierenden wenn sie innerhalb des Lumens des sauren intrazellulären Transport Vesikel oder endosomalen Kompartimenten, und sie werden nur leicht sichtbar, wenn an den extrazellulären neutralen pH-Umgebung ausgesetzt ist, an der äußeren Oberfläche der Uhr. Unsere Strategie konsequent ermöglicht es uns, PM Oberflächenrezeptoren von denen in intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden. Um eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösungen, sowie die Empfindlichkeit erforderlich, um dynamische Menschenhandel von Rezeptoren zu untersuchen erreichen, beschäftigten wir insgesamt internen reflektierenion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die uns um die optimale räumliche Auflösung der optischen Bildgebung (~ 170 nm) zu erreichen aktivieren, um die zeitliche Auflösung der Video-Rate-Mikroskopie (30 Bilder / sec), und die Empfindlichkeit zu erfassen Fluoreszenz eines einzelnen GFP Molekül. Durch die Abbildung pHluorin-markierten Rezeptoren unter TIRFM konnten wir direkt visualisieren einzelnen Rezeptor-Insertionen in die PM in kultivierten Neuronen waren. Dieser Ansatz kann potentiell Bildgebung einem Membranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die mit superecliptic pHluorin markiert werden könnte angewendet werden, und wird Dissektion der wichtigsten Mechanismen, die detaillierte Insertion verschiedener Membranproteine (Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter, etc.) zu ermöglichen die Uhr.
Protokoll
Ein. Vorbereiten Maus Glia Kultur für neuronale Kultur Conditioning
- T75-Flaschen sind mit Kollagenlösung (1:3 Verdünnung Purecol in ddH 2 O) beschichtet. Die Kolben werden aufgerichtet und über Nacht trocknen gelassen in einer Gewebekultur Kapuze.
- Dissektion Puffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 30 mM Dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, ohne Calcium) und Glia (DMEM mit 10% FBS, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 ergänzt ug / ml Streptomycin und Glutamax) hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Am Tag der Glia Kultur, ist die Glia Medien für mindestens 30 min in einem 37 ° C Wasserbad Dissektion Mäusehirnen erwärmt. Embryonalen oder neugeborenen Mäusen durch schnelle Enthauptung getötet. Cerebral Cortexbereiche werden unter einem Dissektionsmikroskop seziert.
- Seziert Hirngewebe in Papain-Lösung (100 ml Papain und 20 ul 1% DNase I in 2 ml Puffer Dissektion) bei 37 ° C verdaut for 20 min.
- Nach Papainverdau werden Hirngewebe mit 10 ml vorgewärmten Glia Medien gespült. Frisches Glia Medien (2 ml) wird dann zu den verdauten Hirngewebe zugegeben und die Gewebe mit einer feuer-poliertes Glas Pasteurpipette verrieben.
- Frische Medien Glia (8 ml) wird zu der dissoziierten Geweben aufgenommen. Eine Zelle 70 um-Sieb verwendet wird, um die dissoziierte Gewebesuspension filtern. Die Zellen werden dann in T75-Flaschen (in der Regel 2-3 Embryonen kann Saatgut ein T75-Kolben) ausgesät und in eine 37 ° C Zellkulturbrutschrank.
- Am nächsten Tag wird die Medien von den T75-Flaschen abgesaugt. Die Kolben werden mit 10 ml PBS gespült. Frische Medien Glia (10-15 ml) wird dann zu jedem Kolben zugegeben.
- Innerhalb von 10-12 Tagen sollte Glia in den T75-Flaschen werden konfluent. Glia-Zellen werden mit PBS gespült, und mit 5 ml 0,05% Trypsin zu jedem T75 Kolben zugegeben.
- Nach Trypsin Inkubation bei 37 ° C für 5 min, Gliazellen dissoziiert und Gliazellen voneinander T75 Kolbeninhalt zweigeteiltverschiedene Kollagen-beschichteten T75-Flaschen.
- Kultur Einsätze (Millipore PICM03050) sind, indem sie in 6-Well-Platten, Beschichten mit Kollagen und lufttrocknenden über Nacht hergestellt. Glia Medien (je 2 ml) unterhalb jeder Kultur Einlage platziert.
- Glia von konfluenten T75-Flaschen mit Trypsin behandelt und auf die Kultur beimpft Einsätze (ein T75-Flasche pro 6-Well-Platte, 2 ml jeder Einsatz). Diese Gliazellen Kultur Einsätze werden zur Konditionierung der neuronalen Kulturen werden.
2. Neuronale Kultur
- Die Deckgläschen für neuronale Kultur durch Einweichen in 70% HNO 3 mindestens über Nacht gereinigt. Deckgläser werden dann mit ddH 2 O mindestens 3-mal gewaschen und getrocknet, in einem Isotemp Ofen (> 200 ° C) über Nacht.
- Gereinigt Deckgläschen in einer 6-Well-Platte, ein Deckglas pro Well platziert. Deckgläser mit Poly-L-Lysin-Lösung (2 ml, 0,1% in 100 mM Borsäure, pH = 8,5) über Nacht in einem 37 ° C Inkubator beschichtet.
- DiePoly-L-Lysin-Lösung wird von den Deckgläsern entfernt und Deckgläser werden 3 mal mit autoklaviertem ddH 2 O gewaschen Deckgläser werden dann in einem 37 ° C Inkubator über Nacht in Plattierungsmedien (Neurobasal mit 5% hitzeinaktiviertem Pferdeserum, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 pg / ml Streptomycin, Glutamax ergänzt; 2% B27 Supplement wird dem Plattierungsmedium zugegeben am Tag sie verwendet wird).
- Am folgenden Tag wurden die Plattierungsmedien wird entfernt und 2 ml frisches Plattierungsmedien mit B-27 in jede Vertiefung, die ein Deckglas aufweist zugegeben.
- Trächtigen Mäusen (E15-18) werden mit CO 2 euthanasiert und embryonalen Mäuse werden durch Dekapitation getötet. Der Hippocampus oder Striatum wird aus dem Hirngewebe seziert und in ein 15 ml konischen Röhrchen mit eiskaltem Dissektion Puffer, Kultur Neuronen im Hippocampus oder Striatum medium spiny Neuronen sind.
- Seziert Hirngewebe dissoziiert werden mit Papain, wie in den Schritten 1.4) und 1.5) beschrieben.
- Fach Dissoziation, wird die Anzahl der Zellen in jedem neuronalen Suspension mit einem Hämozytometer gezählt. Neuronen werden dann auf jeder Deckplättchens in einer Dichte von 0,4 x 10 6 Zellen pro Well einer 6-Well Platte ausgesät und kultiviert in einem 37 ° C Inkubator über Nacht (Neuronen sind DIV 0).
- Um Glia Kultur fügt zur Konditionierung der neuronalen Kulturen herzustellen, wird die Glia Medien aus den Glia Kultur Einsätze entfernt und frisches Plattierungsmedium zugegeben (2 ml in dem Einsatz und 2 ml unterhalb der Einlage).
- Am nächsten Tag (DIV 1) werden die Deckgläser mit Neuronen unter den Gliazellen Kultur Einsätze, ein Deckglas in jedem gut platziert.
- Neuronen werden mit dem halben Volumen von frischem vorgewärmten Fütterung Medien (mit B-27) alle 3-4 Tage lang gefüttert, bis sie bereit für die Transfektion und Imaging Experimente sind.
3. Transfektion
- Neuronal Transfektion erfolgt mit Lipofectamin 2000. Für jede neuronale Kultur (ein Kultur pro Deckglas), 2 ulLipofectamin 2000 und 1 ug DNA verwendet werden. Frische Neurobasalmedium ohne Aufpreis wird verwendet, um Lipofectamin und DNA verdünnen.
- DNA und Lipofectamin werden für 20 min bei Raumtemperatur nach Durchmischung inkubiert.
- Sparen Sie 1 ml der Medien von unterhalb jeder Glia Kultur Einsatz und 1 ml aus dem Inneren jedes Einsatzes, und übertragen Sie die Medien zu einer konischen Rohr. Fügen Sie das gleiche Volumen der Fütterung media + B27 auf die gespeicherte Medium und Inkubation bei 37 ° C. Dieses Medium wird für die neuronale Kultur nach Transfektion verwendet.
- Nach der 20-min Lipofectamin / DNA Inkubation werden Glia Kultur fügt momentan von den 6-well Platten entfernt. Die 200 ul Lipofectamin / DNA-Gemisch wird jedem Deckglas mit Neuronen aufgenommen. Die Kultur Glia Einsätze werden dann zu jeder Vertiefung zurückgegeben, oberhalb der Neuronen. Erzeugung von Blasen unter der Membran der Kultur fügt sollte vermieden werden. Neuronen sind mit der Lipofectamin / DNA-Gemisch bei 37 ° C für 2-4 Stunden inkubiert.
- Nach the 2-4 h Inkubationszeit werden Glia Inserts wieder entfernt. Die Kulturmedien mit dem Lipofectamin / DNA-Gemisch wird aus jedem Well entfernt. Die Medien in Schritt 3.3) gespeichert wird, um Neuronen (2 ml pro Vertiefung) zugegeben. Glia Kultur Einsätze werden in jede Vertiefung zurückgeführt und die Medien von Glia jedes Einsatzes entfernt wird, und 2 ml des Mediums aus Stufe 3.3) wird in jeden Einsatz zugegeben.
- Neuronen sind für eine zusätzliche 24-72 Stunden damit Ausdruck der transfizierten cDNA vor TIRF Bildgebung auf diese Neuronen durchgeführt wird kultiviert.
4. TIRF Imaging
- Künstliche Liquor (aCSF: 119 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM Glucose, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 25 mM HEPES, pH = 7,4) wird für Live-Imaging-Experimente verwendet werden. Unsere TIRF Imaging-System ist speziell Set-up mit einem 100-mW Cyan Laser zur Anregung und eine Electron Multipliziert Charge Coupled Device (EMCCD) Kamera für einen Detektor.
- Vor der Bebilderung Experimenten wird die aCSF in einem 37 gewarnt & dzB, C Wasserbad für mindestens 30 min. Heizeinsatz für Echtzeit-Bildgebung auf dem Mikroskoptisch platziert und der Heizeinsatz, Laser und Kamera werden für mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebungsexperimenten erwärmt.
- Ein Deckglas mit transfizierten Neuronen in der Live-imaging Kammer montiert. Die vorgewärmte aCSF ist in der Kammer angeordnet, nachdem die Kammer montiert ist; dieser Schritt sollte so schnell wie möglich durchzuführen.
- Sobald die Kammer auf der Heizeinsatz auf dem Mikroskoptisch platziert wird, werden visuell unter transfizierten Neuronen epi-fluoreszierenden Bildgebungsmodus identifiziert.
- Nach gesunde transfizierten Neuronen identifiziert werden (siehe Abbildungen 1 und 2), wir führen typischerweise 1 min von Foto-bleach zu dem bereits bestehenden pHluorin Fluoreszenz auf der Plasmamembran zu beseitigen, wie pHluorin-Rezeptoren auf der Plasmamembran sehr hohe Fluoreszenz Ebenen wann haben TIRF Bildgebung ersten Mal gestartet wird, stört das mit Visualisierung einzelner insertion Veranstaltungen.
- Nach Photobleichmittel wird die Verstärkungseinstellung des Elektronen-Vervielfacher auf dem EMCCD Kamera auf Maximum gesetzt, und die Aufzeichnung wird für 1 min bei 10 Hz durchgeführt.
- Jede Aufnahme enthält 600 Bilder. Individuelle Einsetzen Ereignisse werden durch die Wiedergabe der Aufnahme wieder mit ImageJ identifiziert. Individuelle Insertionen analysiert manuell mit ImageJ.
5. Repräsentative Ergebnisse
Konsequente neuronalen Kultur ist der Schlüssel zu einer erfolgreichen Live-Imaging-Experimente. Abbildung 1 zeigt mit der Maus Hippocampusneuronen kultiviert mit unserem Protokoll von DIV 11 bis 18 Div. Es ist klar, aus den Bildern, dass die Neuronen haben umfangreiche Prozesse entwickelt und dass die dendritischen Prozesse dicht mit dendritischen Dornen, Anzeichen dafür, dass diese Neuronen gesund Kultur sind abgedeckt. Unsere Kultur Protokoll könnte auch für andere Arten von Neuronen im Gehirn verwendet werden. Zum Beispiel haben wir vor kurzem verwendet dieses Protokoll zu Kulturstriatalen medium spiny Neuronen in einer Studie zu Dopamin D2-Rezeptor (DRD2) Insertion in kultivierten Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums 9 zu untersuchen. Abbildung 2 zeigt mit der Maus mittelgroßen Projektionsneuronen des Striatums kultiviert mit unserem Protokoll bei DIV 8. Wir haben auch erfolgreich TIRF Bildgebung superecliptic pHluorin-tagged DRD2s in dieser Art von Neuron ausgeführt. Abbildung 3 zeigt die Expression von pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) in einem Medium spiny Neurons und Visualisierung der pH-DRD2 Insertion in diesem Neuron.
Abbildung 1. Maus Hippocampus Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. DIV: Tag in vitro, dem Tag der Kultur wird als DIV 0 betrachtet. Aus den Bildern, ist es offensichtlich, dass Hippocampusneuronen reife bei dieser Art der Kultur zwischen 11 und DIV DIV 15. Bei DIV 11 und 13, werden neuronalen Dendriten mit filipodia und unreif Stacheln bedeckt. Bei DIV 15 und18 werden neuronalen Dendriten mit großen Stacheln bedeckt, einen Hinweis auf reifer Neuronen. Linke Panels: niedrigste Vergrößerungsbildern der Maus Hippocampusneuronen in verschiedenen Altersstufen. Rechts-Panels: hoher Vergrößerung Bilder (Zoom auf neuronalen Dendriten der linken Seite) der neuronalen dendritischen Prozesse mit dendritischen Dornen in verschiedenen Altersstufen.
Abbildung 2. Maus striatalen medium spiny neuron Kultur über die Schnittstelle Kultur-Methode. Neuronen in den Bildern sind DIV 8.
Abbildung 3. Eine Maus striatalen medium spiny neuron mit super Ekliptik pHluorin-markierten Dopamin-D2-Rezeptor (pH-DRD2) transfiziert. Bild auf der linken Seite ist Maximum Intensity Projection einer Zeitraffer-Aufnahme (600 Bilder, 100 ms pro Bild). Weiß Pfeilspitzen zeigen einzelne vesikulären Einfügen von pH-DRD2. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen in der xy Dimension verliert aber die Zeitinformation. Bild auf der rechten Seite zeigt yt Maximum Intensity Projection, bei dem die xyt Stapels um 90 Grad um die y-Achse ist, und die maximale Pixel auf jeder x-Achsen-Linie ist auf ein einzelnes y-Achsen-Pixels projiziert. Dieses Bild bleibt Einsetzen Informationen entlang der yt Achse, sondern verliert die x-Achse Informationen.
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Diskussion
Aus unbekannten Gründen sind Mäuseneuronen immer schwieriger, Kultur als Rattenneuronen. Nach unserer Erfahrung funktioniert eine Mischkultur aus Neuronen und Gliazellen auch für die primäre kultivierten Maus Neuronen. Allerdings ist eine solche Mischkultur nicht geeignet für TIRF Imaging-Experimente, wie sie in dieser Art von Kultur Neuronen und ihre Prozesse auf der Oberseite des Glia-Zellen wachsen, Situierung der neuronalen Zellkörper und dendritischen Prozesse außerhalb der Reichweite der TIRF-Mikroskopie neigen. D...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von The Jackson Laboratory unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz Unternehmen Katalog-Nummer Kommentare | |||
| Gereinigte Rinder-Kollagen-Lösung (Purecol) | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | GIBCO | 14185-045 | |
| Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
| Natriumpyruvat | GIBCO | 11360-070 | |
| DMEM high glucose | GIBCO | 10313-021 | |
| Fötalem Rinderserum (FBS) | |||
| GlutaMAX | GIBCO | 35050-061 | |
| Papain | Worthington Biochemical Corp | LS003126 | |
| Deoxyribonuclease I aus Rinderpankreas (DNase I) | SIGMA | DN25-10MG | |
| Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | GIBCO | 14190-144 | |
| 0,05% Trypsin | GIBCO | 25300-054 | |
| Poly-L-Lysin Hydrobromid | SIGMA | P2636-1G | |
| Borsäure | Fisher-Scientific | BP 168-500 | |
| Neurobasal Medium | GIBCO | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | GIBCO | 17504-044 | |
| Wärme inaktive Pferdeserum | GIBCO | 26050-070 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 019 | |
| HEPES | Fisher-Scientific | BP310-500 | |
| Kultur einfügen | Millipore | PICM03050 |
Referenzen
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