Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

Zusammenfassung

Durch die Kennzeichnung die extrazellulären Domänen von Membranrezeptoren mit superecliptic pHluorin, und durch Abbilden diese Fusion Rezeptoren in kultivierten Maus Neuronen, können wir direkt visualisieren einzelnen vesikulären Insertionsereignisse der Rezeptoren in der Plasmamembran. Diese Technik wird maßgeblich bei der Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Rezeptor-Insertion in die Plasmamembran.

Zusammenfassung

Ein besseres Verständnis der Mechanismen, die Rezeptor-zwischen der Plasmamembran (PM) und intrazellulären Kompartimenten erfordert einen experimentellen Ansatz mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung. Darüber hinaus muss ein solcher Ansatz haben auch die Fähigkeit an Rezeptoren auf der PM von denen in intrazellulären Kompartimenten lokalisiert unterscheiden. Am wichtigsten ist, Erfassen Rezeptoren in einem Vesikel erfordert herausragende Nachweisempfindlichkeit, da jedes Vesikel trägt nur eine kleine Anzahl von Rezeptoren. Standard-Ansätze zur Untersuchung Rezeptortransport gehören Oberfläche Biotinylierung durch biochemische Detektion, die sowohl die erforderlichen räumlichen und zeitlichen Auflösung fehlt folgt; und Fluoreszenzmikroskopie Prüfung immunmarkierten Oberflächenrezeptoren, die chemische Fixierung von Zellen erfordert und daher keine ausreichende zeitliche Auflösung ^1-6. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir und andere entwickelt und eingesetzt eine neue strategischetegie, dass ermöglicht die Visualisierung des dynamischen Einfügen von Rezeptoren in der PM mit ausgezeichneten räumlichen und zeitlichen Auflösung ^7-17. Der Ansatz enthält Tagging von einem pH-sensitiven GFP, das superecliptic pHluorin ^18, an den N-terminalen extrazellulären Domäne des Rezeptors. Superecliptic pHluorin hat die einzigartige Eigenschaft, Fluoreszenz bei neutralem pH-Wert und nicht fluoreszierenden bei saurem pH (pH <6,0). Daher sind die markierten Rezeptoren nicht fluoreszierenden wenn sie innerhalb des Lumens des sauren intrazellulären Transport Vesikel oder endosomalen Kompartimenten, und sie werden nur leicht sichtbar, wenn an den extrazellulären neutralen pH-Umgebung ausgesetzt ist, an der äußeren Oberfläche der Uhr. Unsere Strategie konsequent ermöglicht es uns, PM Oberflächenrezeptoren von denen in intrazellulären Vesikeln zu unterscheiden. Um eine ausreichende räumliche und zeitliche Auflösungen, sowie die Empfindlichkeit erforderlich, um dynamische Menschenhandel von Rezeptoren zu untersuchen erreichen, beschäftigten wir insgesamt internen reflektierenion Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM), die uns um die optimale räumliche Auflösung der optischen Bildgebung (~ 170 nm) zu erreichen aktivieren, um die zeitliche Auflösung der Video-Rate-Mikroskopie (30 Bilder / sec), und die Empfindlichkeit zu erfassen Fluoreszenz eines einzelnen GFP Molekül. Durch die Abbildung pHluorin-markierten Rezeptoren unter TIRFM konnten wir direkt visualisieren einzelnen Rezeptor-Insertionen in die PM in kultivierten Neuronen waren. Dieser Ansatz kann potentiell Bildgebung einem Membranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die mit superecliptic pHluorin markiert werden könnte angewendet werden, und wird Dissektion der wichtigsten Mechanismen, die detaillierte Insertion verschiedener Membranproteine ​​(Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter, etc.) zu ermöglichen die Uhr.

Protokoll

Ein. Vorbereiten Maus Glia Kultur für neuronale Kultur Conditioning

1. T75-Flaschen sind mit Kollagenlösung (1:3 Verdünnung Purecol in ddH ₂ O) beschichtet. Die Kolben werden aufgerichtet und über Nacht trocknen gelassen in einer Gewebekultur Kapuze.
2. Dissektion Puffer (aCSF: 119 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl _2, 30 mM Dextrose, 25 mM HEPES, pH 7,4, ohne Calcium) und Glia (DMEM mit 10% FBS, 10 Einheiten / ml Penicillin, 10 ergänzt ug / ml Streptomycin und Glutamax) hergestellt und bei 4 ° C bis zur Verwendung.
3. Am Tag der Glia Kultur, ist die Glia Medien für mindestens 30 min in einem 37 ° C Wasserbad Dissektion Mäusehirn....

Diskussion

Aus unbekannten Gründen sind Mäuseneuronen immer schwieriger, Kultur als Rattenneuronen. Nach unserer Erfahrung funktioniert eine Mischkultur aus Neuronen und Gliazellen auch für die primäre kultivierten Maus Neuronen. Allerdings ist eine solche Mischkultur nicht geeignet für TIRF Imaging-Experimente, wie sie in dieser Art von Kultur Neuronen und ihre Prozesse auf der Oberseite des Glia-Zellen wachsen, Situierung der neuronalen Zellkörper und dendritischen Prozesse außerhalb der Reichweite der TIRF-Mikroskopie neigen. D.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz Unternehmen Katalog-Nummer Kommentare
Gereinigte Rinder-Kollagen-Lösung (Purecol)	Advanced Biomatrix	5005-B
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	GIBCO	14185-045
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep)	GIBCO	15140-122
Natriumpyruvat	GIBCO	11360-070
DMEM high glucose	GIBCO	10313-021
Fötalem Rinderserum (FBS)
GlutaMAX	GIBCO	35050-061
Papain	Worthington Biochemical Corp	LS003126
Deoxyribonuclease I aus Rinderpankreas (DNase I)	SIGMA	DN25-10MG
Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	GIBCO	14190-144
0,05% Trypsin	GIBCO	25300-054
Poly-L-Lysin Hydrobromid	SIGMA	P2636-1G
Borsäure	Fisher-Scientific	BP 168-500
Neurobasal Medium	GIBCO	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	GIBCO	17504-044
Wärme inaktive Pferdeserum	GIBCO	26050-070
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668 019
HEPES	Fisher-Scientific	BP310-500
Kultur einfügen	Millipore	PICM03050