Eine spezifische und schnelle Protokoll gleichzeitig zu untersuchen Funktion der rechten Herzkammer, Lungenentzündung, und die Immunantwort als Lernwerkzeug beschrieben. Video und Figuren beschreiben Physiologie und Mikrodissektion Techniken in einer organisierten Team-Ansatz, anpassungsfähig an für kleine bis große Studien verwendet werden soll.
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Methodenartikel
Rechtsventrikulären systolischen Druck Messungen in Kombination mit Harvest of Lung and Immune Gewebeproben in Mäuse
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Funktion der rechten Herz ist, um Blut durch die Lunge zu pumpen, was eine Verknüpfung rechte Herz Physiologie und pulmonalvaskulären Physiologie. Die Entzündung ist eine gemeinsame Modifizierer von Herz-und Lungenfunktion, durch Ausarbeitung Zellinfiltration, Produktion von Zytokinen und Wachstumsfaktoren, und durch Initiieren Umbauprozesse ein.
Im Vergleich zu dem linken Ventrikel, der rechte Ventrikel eine Niederdruck-Pumpe, die in einem relativ schmalen Bereich von Druckänderungen arbeitet. Erhöhte Lungenarteriendrucks sind mit erhöhten Druck in der Lunge Gefäßbett und pulmonaler Hypertonie 2 zugeordnet. Pulmonaler Hypertonie ist oft mit entzündlichen Lungenerkrankungen, z. B. chronische obstruktive Lungenerkrankung oder Autoimmunerkrankungen 3 zugeordnet. Da pulmonale Hypertonie verleiht eine schlechte Prognose für die Lebensqualität und die Lebenserwartung ist viel Forschung zum Verständnis der Mechanismen, die mig gerichtetht Ziele für pharmazeutische Interventionen 4 sein. Die größte Herausforderung für die Entwicklung von wirksamen Management-Tools für die pulmonale Hypertonie bleibt die Komplexität der gleichzeitigen Verständnis der molekularen und zellulären Veränderungen im rechten Herzen, der Lunge und des Immunsystems.
Hier präsentieren wir eine prozedurale Workflow für die schnelle und präzise Messung von Druckänderungen im rechten Herzen von Mäusen und die gleichzeitige Ernte von Proben aus Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe. Die Methode beruht auf der direkten Katheterisierung des rechten Ventrikels über die Jugularvene in enger Oberkörper Mäuse, erstmals in den späten 1990er Jahren als Surrogat Maß für Druck in den Lungenarterien 5-13 entwickelt wurde. Die organisierte Team-Ansatz ermöglicht eine sehr schnelle rechten Herzkatheter-Technik. Dies macht es möglich, die Messungen bei Mäusen, die spontan atmen Raumluft durchzuführen. Die Organisation des Work-Flow in verschiedenen Work-Bereichereduziert Zeitverzögerung und eröffnet die Möglichkeit, gleichzeitig Physiologie Experimente und Ernte Immunsystems, Herz-und Lungengewebe.
Die prozedurale Workflow hier skizzierten kann für eine Vielzahl von Labor und Studiendesigns angepasst werden, von kleinen, gezielten Experimenten bis hin zu großen Drogen-Screening-Assays. Die gleichzeitige Erfassung von Herzphysiologie Daten erweitert, um Echokardiographie 5,14-17 und Ernte von Herz, Lunge und Immunsystem Gewebe umfassen kann reduziert die Anzahl von Tieren benötigt, um Daten, die die wissenschaftliche Wissensbasis vorwärts bewegen zu erhalten. Die prozedurale Workflow präsentiert auch hier eine ideale Basis zur Erkenntnisgewinnung der Netzwerke, die Immun-, Lungen-und Herzfunktion zu verknüpfen. Die gleichen Prinzipien hier skizzierten lässt sich an andere oder zusätzliche Organe zu studieren, wie benötigt werden.
Protokoll
Ein. Vorbereitung
- Bereiten Sie die folgenden Lösungen und Rohre (Tabelle 1) wie folgt:
- Hanks-Lösung, kein Kalzium, Magnesium oder Indikators mit Penicillin (100 U / ml) / Streptomycin (100 mg / ml).
- Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 1x, kein Kalzium, kein Magnesium.
- Ethanol, 70%, 500 ml machen.
- Gepuffertem Formaldehyd, 7-10% mit PBS, 500 ml machen.
- Anästhesie-Lösungen:
- Avertin. Vorsichtig mit 5 ml 2-Methyl-2-Butanol bis 5 g 2,2,2-Tribromethanol. Einmal gelöst, halten Stammlösung bei Raumtemperatur im Dunkeln. Nehmen 0,25 ml der Stammlösung und verdünnen Sie es mit 10 ml 1xPBS in Glasboden Flasche. Wickeln Sie die Flasche mit Aluminiumfolie, bei 37 ° C, bis sie gelöst und dann Aliquot in 5 ml Polypropylen-Röhrchen und halten im Kühlschrank. Wärmen ein Aliquot am Morgen des Experiments.
- Barbiturate. Verdünnen Stammlösung mit PBS zu geben 2,6% Barbiturat solution. Zeigen 3-4 ml Aliquots in Polypropylenröhrchen.
- Organisieren drei Work-Bereiche (Abb. 1).
- Bereich A: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Studie Formular Studie Identifikationsnummer, Datum, Körpergewicht, Gewicht der rechten Herzens, linke Herz und Septum aufzuzeichnen; Präzisionswaage (0-50 g auf 0,01 g genau), um das Körpergewicht zu bestimmen; Mikroebene zu Herzen Gewichte bei 0,001 g genau zu bestimmen; wiegen Boote; Anästhesie-Lösungen (eindeutig gekennzeichnet), kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte mit Blut und Gewebeproben (Tabelle 1) zu sammeln; chirurgische Instrumente ( Tabelle 2, Abbildung 2) und Lösungen für die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen.
- Bereich B: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Binokular, rechts Herzkatheter mit einem Druck Steuereinheit, die mit einem Verstärker und Laptop-Computer angeschlossen ist. Der Katheter wird in platziertein Becherglas mit Wasser. Vereinbaren chirurgische Instrumente (Tabelle 2), Teile der Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in einen Wiegeschiffchen; Band (Autoklav Band ist optimal), um eine optimale Länge und Breite geschnitten und aufgereiht auf Mikroskop oder Labortisch für einfachen Zugang, Wattestäbchen und Haarentferner Lösung. Kalibrieren des Katheters zu Beginn der Studie.
- Bereich C: Ordnen Sie die folgenden Punkte: Lupe Linse; Trachealkanüle; 1 ml Spritzen; Naht abgeschnitten, um eine optimale Länge und in eine Wiegeschiffchen, kleine Dewar mit flüssigem Stickstoff; isolierten Behälter mit Eis, Rohre und 24-Well-Platte zu sammeln BAL und Gewebeproben (Tabelle 1); chirurgische Instrumente (Tabelle 2); Lösungen durchzuführen BAL und die Trachealkanüle und die Instrumente (Tabelle 1) zu reinigen.
2. Rechts Herzkatheter
- Wiegen mit der Maus über eine Präzisionswaage durch sanftes Auflegen Maus in eine Waage bHafer. Achten Sie darauf, das Tier sanft und leise zu behandeln. Notieren Gewicht. Die beschriebene Protokoll funktioniert am besten für Mäuse, die 20 g oder mehr sind, weil der Durchmesser der Jugularvene hat, um den Druck Katheters aufzunehmen, es ist möglich, kleinere Mäuse (17 g oder mehr), so lange wie die Vene katheterisieren groß genug ist.
- Betäuben die Maus durch Injektion mit Avertin je nach Körpergewicht (10 ul / g), z. B. für 20 g geben 200 ul, für 25 g geben 250 ul, 30 g geben 300 ul. Die genaue Injektionsvolumen muss angepasst je nach Mausstamm werden. Stellen Sie sicher, um das Tier schonend und leise handhaben, weil die Reaktion auf Stress des Anästhetikums verändern kann.
- Sobald die Maus sediert, am Doppel-plissierte Seidenpapier. Beachten Sie die ID-Nummer auf dem Papier. Reiben Haarentfernung Lotion in der ventralen Seite des Halses auf das Operationsfeld zu löschen. Platzieren Sie die Maus wieder auf dem Papier und warten 1-2 min.
- Entfernen Sie Haare aus dem ventralendes Halses durch sanft streichelte das Haar gegen die Richtung des Haarwuchses mit Wattestäbchen.
- Sorgfältig bestimmen die ausreichende Tiefe der Anästhesie durch Prüfen auf die Abwesenheit der Zehe Reflex: die Maus nicht, um ein Quetschen der Zehen reagieren.
- Arbeitet schnell und entspannt, sollte der Rest des rechten Herzkatheter nicht länger als 10 Minuten, 3-6 min optimal. Es ist wichtig, dass das Gewebe nicht austrocknet, da der Katheter muss in die Vene gleiten und bewegen sich in der Vene auf einer Schicht von Feuchtigkeit. Konsistenten Timing des Verfahrens ist zur Erzeugung von Daten, die zwischen den Gruppen vergleichbar sind wichtig.
- Bewegen Sie die Maus wieder auf Seidenpapier und Transfer mit Seidenpapier auf Styropor Bord. Fix Pfoten und Kopf in Ort mit Autoklaven Band.
- Machen Inzision der Haut von Mandibeln bis zum Brustbein (Brustbein).
- Sorgfältig sezieren die Schilddrüse grand nach oben zu den Unterkiefer, um die rechte Jugularvene eine freizulegennd Luftröhre.
- Ort Styropor Bord halten Sie die Maustaste unter dem Dissektionsmikroskop mit der Fokusebene bereits vor Ort und die Linse auf etwa 0,8 x Vergrößerung (totale Vergrößerung [Objektiv x Okular] ist ca. 8x.
- Sorgfältig microdissect die rechte Jugularvene durch Entfernen umliegenden Bindegewebes mit chirurgische Pinzette.
- Legen Sie zwei Stück der Naht auf der rechten Halsschlagader. Tie das Nahtmaterial am nächsten zu den Unterkiefer zum Verschließen des Blutflusses in der Vene zu einem winzigen rieseln, platzieren die Naht, die an dem Brustbein / Brustbein zu einem lockeren Knoten um die Vene am nächsten ist. Man kann die winzige Blutrinnsal verwenden, um später feststellen das Loch in der Vene, sollte dies notwendig werden.
- Atmen und zu entspannen (lockern die Muskeln im Nacken-und Unterkiefer), die Augen auf die Vene durch das Okular zu halten. Dadurch wird sichergestellt, dass Ihre Hände und Finger werden sicher bewegen, sanft und entspannt. Halten Sie die Vene mit einer Pinzette an der Seite am nächstendie Mandibeln, schnitt ein Loch in die Vene zwischen den beiden Fäden mittels Mikro-Schere mit der anderen Hand bedient. Legen Sie die Mikro-Schere, und halten diese Hand entspannt, für den Katheter spüren. Vorsichtig holen den Katheter hält ihn zwischen Daumen und Zeigefinger (Abb. 3). Legen des Katheters in das Loch der Vene.
- Gently voranzutreiben den Katheter in das rechte Herz (Abbildung 3). Beachten Sie die Kennzeichnungen in den Katheter, der einen ungefähren Index dafür, wie weit der Katheter muss eingesetzt werden geben und beobachten das Monitor. Sobald die Druckkurven angezeigt werden, vorsichtig den unteren Naht um den Katheter. Weil der Katheter eine Zugfestigkeit, die ihm eine Spule, und weil der Atmung und Herzschlag des Maus hinzuzufügen Bewegung zusätzlich Anbringung des Katheters mittels Klebeband.
- Nimm Druckmessungen für 2 Minuten für die spätere Analyse (Abbildung 4).
- Öffnen Sie die Fadenhaltemittel den Katheter, dann sanft Retrieve Katheters. Wischen Sie den Teil hinter dem Druckaufnehmer legen zurück in den Becher mit Wasser. Berühren Sie nicht die Druckaufnehmer.
- Übertragen Sie die Maus auf das Tissue-Papier zur Fläche A für die Euthanasie, Gewinnung von Blut und Milz Gewebe. Reinigen chirurgische Instrumente.
- Starten Sie den Vorgang mit dem nächsten Tier. Wenn das Timing erlaubt, injizieren die Narkose während des Wartens auf den Druckverlauf (2,15) aufzeichnen.
3. Gewinnung von Blut und Milz Proben
- Inject Barbiturat-Lösung, 400 ul pro Maus und warten 1-2 min. Diese wird routinemäßig in unserem Labor durchgeführt, um die Möglichkeit, dass die Mäuse versehentlich aus avertin-Anästhesie erholen, während ausgeblutet zu vermeiden. Entsprechende Normierung des Versuchs wird durch Einspritzen des gleichen Dosis Barbiturat Lösung pro Maus und durch Warten dieselbe Zeitdauer vor der Ernte von Blut erreicht. Wenn durch die Institutional Animal Care zulässig und Verwenden Ausschuss undSolange die Tiere sorgfältig für die Narkosetiefe vor Ausbluten überwacht, kann dieser Schritt weggelassen werden.
- Machen Einschnitt in den Unterleib. Öffnen Sie die Schwanzvene (Vena cava) und sammeln Blut mit einer Pipette.
- Entfernen der Milz, oder ein Stück der Milz in das Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff oder in die 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer zur späteren Herstellung von Einzelzellen.
- Übertragen der Maus auf dem Papiertuch Work-Bereich C zum Sammeln von BAL-, Lungen drainierenden Lymphknoten, Lunge und Herz Geweben. Reinigen chirurgische Instrumente.
4. Sammlung von Lunge und Herz Proben
- Sezieren die Luftröhre frei von Muskel-und Bindegewebe. Platzieren Pinzette unter der Luftröhre, ziehen Faden durch. Gently erzeugen genügend strecken, um ein Loch zu schneiden. Aufrechterhaltung der sanfte Dehnung, legen Sie die Trachealkanüle mit einem leicht Drehbewegung und Nahtmaterial Kanüle into Ort. Zum Einsetzen der Trachealkanüle, stellen Sie sicher, dass die Luftröhre feucht ist, wenn nötig einen Tropfen Hanks Lösung. Während des gesamten Verfahrens, atmen, entspannen Nacken und Kiefermuskeln zu halten Handbewegungen sicher und glatt.
- Dissect öffnen den Brustkorb durch vorsichtiges Entfernen des Brustbein ab dem abdominalen Ende. Bitte nicht stören den Inhalt des Thorax, weil das macht es sehr schwer, den Lymphknoten zu finden.
- Führen bronchoalveolären Lavage (BAL) durch vorsichtiges Einführen 1 ml Hanks-Puffer, sanft drehen Sie die Spritze und abrufen BAL. 3 Mal wiederholen, in der Nähe Rohr und auf Eis stellen. Während des gesamten Verfahrens beibehalten Augen auf dem Ende der Trachealkanüle, die mit der Spritze verbindet. Blick zum Brustkorb, um die Inflation und Deflation der Lunge zu beobachten.
- Ernte Lunge Lymphknoten durch Halterippe Käfigwand mit einem Satz von Zangen, Auffinden und Abrufen des Lymphknotens mit weiteren Pinzette. Ort Lymphknoten in 24-Well-Platte. Es ist wichtig, kJetzt, wo zu suchen: ab dem Hals, der Eingang des Brustkorbs von der rechten Seite der Maus und siehe oben der Wirbelsäule (Abbildung 5).
- Ernte Herzen und auf Seidenpapier. Isolieren Sie das rechte Herz durch vorsichtiges Sezieren neben dem Septum. Transfer zum Work-Bereich A wiegen, um das Gewicht protokollieren und Platz in Eppendorf-Röhrchen, um Einfrieren in flüssigem Stickstoff einrasten.
- Zeigen Naht um den linken Lungenflügel, die Hauptbronchus zu schließen. Sezieren den linken Lungenflügel befreit, erfolgt in Eppendorf-Röhrchen und Schnellfrostmedium in flüssigem Stickstoff, oder Ort in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte mit Hanks-Lösung für eine spätere Isolierung einzelner Zellsuspensionen.
- Legen Sie ca. 0,5 ml gepufferter Formaldehydlösung durch die Trachealkanüle in die verbleibenden Lungenlappen. Nach Inflation, sezieren die Lungenlappen aus dem Thorax und Ort in 50 ml Röhrchen mit Formaldehyd-Lösung. Für eine alternative Studiendesigns, kann die Lunge mit opti aufgeblasen werdenmal schneiden Medien (OCT, 1:4 verdünnt mit PBS) und eingefroren in einer Form, die das unverwässerte Oktober für die spätere Herstellung von Gefrierschnitten. Eine andere Studie Design könnte notwendig Erhalt Snap gefrorenen Lungengewebe und einzelne Zellsuspensionen aus den Lungen. In diesem Fall ist keine Inflation notwendig: sezieren die verbleibenden Lungenlappen; Abrufen über dem Thorax und ebenfalls in den 24-Well-Platte in eine Vertiefung, die Hanks Puffer.
- Entfernen Trachealkanüle, sauber durch Spülen mit Hanks-Puffer, reinigen chirurgische Instrumente.
5. Analyse der Druckkurven aus dem rechten Herz-Katheter Generated
Die aufgezeichneten rechtsventrikulären Druckdaten werden mit Hilfe LabChart 7-Software ohne Wissen der Gruppe Identität jeder Aufnahme. Mehr als 20 Kurven werden zufällig ausgewählt und die Differenz zwischen maximaler und minimaler ventrikulären Drucks für jede Kurve gemessen (AP). Die durchschnittliche AP berechnet wird, um das Recht geben, ventricular systolischen Druck.
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Ergebnisse
Der primäre Endpunkt zum Erhalten rechte Herz Druckkurven wird durch die korrekte Position des rechten Herzens Katheters erreicht. Die Form der Druck-Zeit-Kurven ist kritisch, da die richtige Plazierung des Katheters im Inneren des rechten Ventrikels in Druckplateaus führen wird (Abbildung 4). Spiky Kurven stattdessen zeigen einen Katheter, der durch die Atmung oder Herzschlag Bewegung gegen die Wand des rechten Ventrikels bewegt wird. Um mögliche Schwierigkeiten bei der Stufe der Überleben der Tiere zu...
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Diskussion
Die experimentelle Strömung hier skizzierten ermöglicht eine schnelle und gleichzeitige Messung der rechten ventrikulären systolischen Druck und Ernte von Proben für die Analyse der Antworten in der Lunge, des Herzens und des Immunsystems bei Mäusen. Das Verfahren kombiniert Herzen Physiologie Messungen Mikrodissektion und anschließende Gewebe Ernte für Studien an lebenden Zellen, histologische Analyse oder omics-Analyse der Gewebe. Der gesamte Vorgang dauert weniger als 20 Minuten pro Maus. Wegen der Arbeit-Bereich org...
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Offenlegungen
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Danksagungen
R01HL082694 (JW);; American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG); Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) finanziert Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Reagenzien | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| desinfizierende Seife (Coverage Spray TB sowie Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethylalkohol, 200 Proof, Absolute, wasserfrei ACS / USP Grade | PHARMCO-Aaper | 111000200 | Verdünnt auf 70% mit destilliertem Wasser |
| Formaldehyd-Lösung | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Verdünnen, um eine 7-10% formaldehyde Konzentration bei einer PBS Konzentration von 1x mit PBS-Stammlösung und Wasser |
| Hanks-Lösung, kein Kalzium, Magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| Oktober | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10000 U / ml) / Streptomycin (10.000 mg / ml)-Lösung | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), kein Kalzium, kein Magnesium, 1x und 10x Lösungen | Fisher Scientific | ||
| Natrium-Pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Platten 12, 24, 96 gut | Falke | ||
| Transferpipette | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA beschichteten | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0,65 ml und 1,7 ml Mikro-Zentrifuge | VWR | ||
| Rohre 12 x 75 mm Polypropylen | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, verschiedene Größen, Polypropylen | Fisher Scientific | ||
| Instrumentarium | |||
| Pinzetten, Dumon # 5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Pinzette, gebogen extra fein graefe-0.5mm Tipps | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Pinzetten, extra fine graefe-0.5mm Tipps direkt | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Kanüle 18ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Schneiden Sie die optimale Länge, abgestumpft und außerhalb krächzte eine grobe äußere Oberfläche erstellen |
| Schere, Dissector Scheren-slim Klingen 9cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Naht für BAL, geflochtene Seidenfaden, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Naht für Rechts-Herzkatheter, geflochtene Seidenfaden, 6-0 | Teleflex Medical | 18020-60 | |
| Spritze, 1 ml | BD | 309659 | |
| Ausrüstung | |||
| Verstärker, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Modell ML866 | |
| Katheter, Druck F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Seziermikroskop | Variscope | ||
| Pinzetten, Vannas Frühjahr Scheren-2mm Klingen | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen beleuchtet Desk Lupe | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop-Computer | Asus | Modellnummer A52F i5-Prozessor, 15 Zoll | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, LabChart-Pro V.7 | AD InInstrumente |
Referenzen
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