Kapillar-Force-Lithographie für Herz-Tissue Engineering

Summary

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Herstellung von biomimetischen Herzzellkultursubstraten, die aus zwei unterschiedlichen Polymermaterialien mittels Kapillarkraftlithographie hergestellt werden. Die beschriebenen Methoden bieten eine skalierbare, kostengünstige Technik, um die Struktur und Funktion von makroskopischem Herzgewebe für in vitro und in vivo Anwendungen zu entwickeln.

Abstract

Herz-Kreislauf-Krankheit bleibt die führende Todesursache weltweit ^ein. Cardiac Tissue Engineering hält viel Versprechen, bahnbrechende medizinische Erkenntnisse mit den Zielen der Entwicklung von funktionalen Geweben für die Herzregeneration sowie in-vitro-Screening-Tests zu liefern. Allerdings hat die Fähigkeit, High-Fidelity-Modelle von Herzgewebe zu erzeugen schwierig erwiesen. Das Herz der extrazellulären Matrix (ECM) ist eine komplexe Struktur, bestehend aus beiden biochemischen und biomechanischen Signale im Bereich von der Mikro-bis Nanometerskala ^2. Lokale mechanische Belastung und der Zell-ECM-Interaktionen wurden vor kurzem als wichtige Komponenten in der Herzgewebetechnik ^3-5 anerkannt.

Ein Großteil des Herz ECM von ausgerichteten Kollagenfasern mit Durchmessern im Nanomaßstab, die Gewebearchitektur und elektromechanische Kupplung ² maßgeblich beeinflusst besteht. Leider haben nur wenige Methoden have in der Lage gewesen, die Organisation der ECM-Fasern bis in den Nanometerbereich zu imitieren. Jüngste Fortschritte in der Nano Techniken haben jedoch die Konstruktion und Herstellung von skalierbaren Gerüste, die die in vivo strukturelle Steifigkeit und Substrat Signale des ECM im Herzen ^6-9 imitieren aktiviert.

Hier die Entwicklung stellen wir zwei reproduzierbar, kostengünstig und skalierbar Nano Verfahren zur funktionellen Ausrichtung der Herzzellen mit dem biokompatiblen Polymer Poly (lactid-co-glycolid) (PLGA) ⁸ und ein Polyurethan (PU)-basierten Polymers. Diese anisotrop nanohergestellte Substrate (ANF) imitieren die zugrunde liegenden ECM gut organisiert, ausgerichtet Gewebe und kann verwendet werden, um die Rolle der Nanotopographie auf die Zellmorphologie und Funktion ^14.10 untersuchen.

Mit Hilfe eines nanostrukturierten (NP) Silizium-Master als Vorlage wird eine Polyurethan-Acrylat (PUA) Form hergestellt. Diese PUA Form wird dann verwendet, pattern die PU-oder PLGA Hydrogel über UV-unterstützte oder Lösungsmittel-vermittelte Kapillarkraft Lithographie (CFL), bzw. ^15,16. Kurz gesagt, PU-oder Pre-PLGA-Polymer-Fall auf einem Deckglas und der PUA Form wird auf die Spitze verzichtet. Für UV-unterstützte CFL, die PU wird dann mit UV-Strahlung (λ = 250-400 nm) zur Härtung ausgesetzt wird. Für Lösungsmittel-vermittelte CFL wird die PLGA mit Hitze (120 ° C) und Druck (100 kPa) eingeprägt. Nach dem Aushärten wird die Form PUA abgezogen und hinterließ eine ANF für die Zellkultur. Primärzellen wie neugeborenen Ratten Kardiomyozyten, sowie menschliche pluripotente Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen, kann auf der ANF ² gehalten werden.

Introduction

Kardiovaskuläre Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität in der Welt und stellen eine gewichtige sozioökonomische Belastung für eine bereits angespannte globale Gesundheitssystem ^1,17. Cardiac Tissue Engineering hat zwei unterschiedliche Ziele: (1), um beschädigte Herzmuskel nach einem ischämischen Kardiomyopathie Krankheit oder regenerieren oder (2), um eine High-Fidelity-Modell des Herzens für die in vitro Wirkstoff-Screening oder Krankheit Modellierung zu erstellen.

Das Herz ist ein komplexes Organ, das ständig arbeiten muss, um Blut in den Körper zu versorgen. Dicht gepackte Schichtstrukturen von Kardiomyozyten und Stützgewebe werden in spiralförmigen Muster in der gesamten Herzwand ^18,19 angeordnet. Das Herz wird auch elektromechanisch in einem sehr koordiniert, effizient Blut auswerfen, um den Körper ^{20 21} gekoppelt. Mehrere große Hürden angesprochen werden, jedoch vor komplizierten Design der Natur zuverlässig in vitro rekapituliert werden.Erste, wenn auch robust Kardiomyozytendifferenzierung Methoden weiterentwickelt werden ^22, hpSC-CMs noch zeigen eher unreifen Phänotypen. Die elektromechanischen Eigenschaften und Morphologie am ehesten entsprechen fetalen Ebenen ^23. Zweitens, wenn in der traditionellen Kulturbedingungen gehalten, sowohl Stammzellen gewonnenen Herzmuskelzellen und Grund nicht, in native, gewebeartigen Strukturen zusammenzubauen. Vielmehr Zellen werden zufällig ausgerichtet und nicht die gebändert stabförmige Aussehen der Erwachsenenherzmuskel ²⁴ aufweisen.

Die extrazelluläre Matrix (ECM), mit der Umgebung interagieren Zellen spielt eine wichtige Rolle bei zahlreichen zellulären Prozessen ^11,13,25. Das ECM aus komplexen, gut definierte Molekular und topographischen Signale, die die Struktur und Funktion von Zellen ^6,26 signifikant beeinflussen. Innerhalb des Herzens, sich eng an die zugrunde liegenden zellulären Ausrichtung Nanometerbereich ECM Fasern ^2. Die Auswirkungen dieser nanotopographsche Signale auf Zell-und Gewebefunktion ist jedoch weit von vollständig verstanden. Voruntersuchungen der Nanometerskala zell Biomaterial Interaktion zeigen die potentielle Bedeutung und Auswirkung Submikrometerbereich topographischen Signale für Zellsignal ^{27, 28-30} Adhäsion, Wachstum ³¹ und Differenzierung ^32,33. Jedoch aufgrund der Schwierigkeit bei der Entwicklung von reproduzierbaren und skalierbaren nanofabricated Substrate, wie Untersuchungen konnte die Multiskalen zellulären Effekte des Komplexes in vivo ECM-Umgebung zu reproduzieren. In diesem Protokoll wird ein einfacher und kostengünstiger Nanofabrikation Technik, um Zellkultur Gerüste imitiert nativen Herz ECM Faserausrichtung erzeugen beschrieben, so dass für eine breite Palette von neuen Untersuchungen von Kardiomyozyten-Biomaterial-Interaktionen. Verstehen, wie Kardiomyozyten interagieren mit dem nanoskaligen ECM-Umfeld konnte für die Fähigkeit, das Zellverhalten zu nativem Gewebe genauer nachahmen Funktionen steuern könnention. Darüber hinaus sind Zellmonoschichten eine vereinfachte Experimentalsystem im Vergleich zu 3D-Strukturen, aber immer noch komplexen mehrzelligen Verhalten für aufschlussreiche Untersuchungen und funktionelles Screening ^2,34-36 aufweisen. Schließlich könnten solche Gerüste verwendet, um zelluläre Transplantatfunktion zu verbessern, wenn in das Herz für regenerative Zwecke ³⁷ implantiert werden.

Protocol

Alle Verfahren wurden bei Raumtemperatur (~ 23 ° C) durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Herstellung von Silicon-Master

1. Saubere Silizium-Wafer mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O ₂ / N _2-Gas.
2. Zeigen Silizium-Wafer in Spin-Coater bei Drehzahlen von 2.000-4.000 Umdrehungen pro Minute, um eine 0,3-0,5 um dicken Film zu produzieren.
3. Strukturieren der Photoresistschicht mit den richtigen Dimensionen unter Verwendung eines Photolithographiesystem
4. Vollständig eintauchen, die strukturierte Photoresist-beschichtete Siliziumwafer in einem geeigneten Volumen von Photoresistentwicklerlösung.
5. Spülen Sie die entwickelte Photoresist beschichteten Silizium-Wafer mit VE-Wasser.
6. Arrays von Sub-Mikrometer-Maßstab Rippen mit fast vertikalen Seitenwänden, tiefes reaktives Ionenätzen der freiliegenden Silizium unter Verwendung eines Ätz-System zu bilden.
7. Entfernen Sie die verbleibende Photoresist, indem die Silizium-Wafer in einem Plasmaverascher-System.
8. Schneiden Sie die Silizium wAfers mit einem Diamantschneider in die entsprechend dimensioniert Silizium-Meister für die anschließende Replik Form.

2. Herstellung von PUA-Mold von Silicon Meister

HINWEIS: Volumen auf Silizium-Master zur Nanofabrikation zugesetzt werden in Abhängigkeit von der Fläche der nano Master als auch repliziert werden, da die Viskosität des Polyurethanacrylat (PUA)-Lösung variieren.

1. Saubere Silizium-Master-Oberfläche mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O ₂ / N _2-Gas.
2. Zeigen Silizium-Master-Muster Seite nach oben in eine Petrischale.
3. Für eine Silizium-Master mit einer 2 cm x 2 cm Flächenmuster, Pipette 40 ul PUA auf die Musteroberfläche.
4. Legen Sie ein Blatt von 4 cm x 4 cm transparentem Polyester (PET) über das abgegebene PUA.
5. Drücken Sie auf die PET-Folie und die Ausbreitung der PUA unter dem Bogen über die Musterfläche mit einer Rolle oder Flachkantige Oberfläche (wie eine Karte), so dass der gesamteMuster durch die PUA-Prepolymer bedeckt.
6. Zeigen Silizium-Master, Prepolymer und PET etwa 10 cm unter einer 20 Watt (115 V) UV-Licht (λ = 365 nm) für 50 Sekunden. Um wirksam zu sein, kann das UV-Licht der Wellenlänge 310 bis 400 nm irgendwo zwischen sein. Die Intensität des Lichts 10-15 mW / cm ² an der Oberfläche des Substrats.
7. Nach dem Aushärten entfernen PET-Folie mit einer Pinzette langsam. PUA sollte auf die PET-Folie mit einer negativen des Silizium-Master Nano befestigen.
8. Cure PUA / PET Nano unter UV für mindestens 12 Stunden vor der Verwendung. Überbelichtung ist nicht ein Problem.
9. So reinigen Silizium Meister, legen Sie eine weitere Folie aus PET auf dem Master ohne Zusatz von PUA und setzen UV-Licht (λ = 365 nm) für 50 sec und PET-Folie entfernen. Dadurch werden alle nicht umgesetzten Monomere zu entfernen.
10. Spülen Silizium-Master mit 100% Ethanol oder Xylol und trocken unter O ₂ / N _2-Gas.

3a. Nanostrukturierung Polyurethan-Polymer

1. Bereiten Durchmesser von 25 mm runden Glasobjektträger, indem sie in einer Ozonbehandlungskammer für 10 min.
2. Zeigen Ozon-behandelten Glasobjektträger auf kleine PDMS-Block für einfache Handhabung.
3. Eine dünne Schicht von Oberflächenhaftvermittler mit Pinsel auf Glasobjektträger. Air trockenen Glasobjektträger für 30 min.
4. Setzen Sie den Glasobjektträger auf einem Stück Druckerpapier.
5. Lassen Sie verzichten 10 ul von Polyurethan (PU) Pre-Polymer (NOA 76) bis zur Mitte des Glasträger. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind nach der Zugabe.
6. Platz PUA Form, Muster Gesicht nach unten, auf den Glasträger. Dispergieren des PU gleichmäßig über die Oberfläche der Glasplatte durch Walzen eines Walzengummizylinder entlang der PUA Form. Druckerpapier wird Polymer Lauf absorbieren.
7. Watt UV Lampe. Polymerisation Zeitpunkt der PU ist abhängig von Leistung von UV-Quelle.
8. Entfernen Sie die Probe von UV-Lichtquelle und vorsichtig schälen die PUA-Form aus PU-beschichteten Objektträger. Die Polymerisation des PU wird als complete wenn die PUA Formschalen sauber von der Probe und die PU-Objektträger aus Glas hat eine schillernde Erscheinung.
9. Platzieren abgeschlossen Proben Exsikkator zur Lagerung solange einen Monat.

3b. Nano Poly (lactid-co-glycolid)-Hydrogel

1. Erstellen Sie einen Flach PDMS-Form durch kräftiges Mischen Silikonelastomer Basis-und Silikon-Elastomer Härter in einem Verhältnis von 10:1.
2. Gießen gemischten Vorläufer PDMS-Lösung in eine Petrischale, so dass der PDMS-Vorstufe erreicht 5 mm den Rand der Schale (also so, dass die PDMS ist 5 mm dick).
3. Zeigen Petrischale und PDMS-Vorläufer in einem Exsikkator für 1 h entgast.
4. Petrischale bewegen und PDMS-Vorläufers in einem 65 ° C Ofen für mindestens 2 Stunden aushärten.
5. Nach PDMS ausgehärtet ist, verwenden Sie einen Rasierer, um die flachen PDMS in 3 cm x 3 cm quadratische Abschnitte geschnitten. Diese werden die flachen Formen PDMS später in der Strukturierungsprozess verwendet wird.
6. Saubere 25 mm Durchmesser kreisförmige Glasobjektträger durch placing in Isopropylalkohol für 30 Minuten in einem Wasserbad-Beschallungs.
7. Trocken gereinigt Glasobjektträger unter O ₂ / N _2-Gas.
8. Drop werden 100 ul PLGA-Lösung (15% w / v PLGA in Chloroform) auf Glasobjektträger.
9. Legen Sie einen flachen PDMS-Form auf der Oberseite der abgegebenen PLGA, um das Lösungsmittel zu absorbieren und zu erhalten, eine flache Oberfläche PLGA. Tragen Sie einen leichten Druck (~ 10 kPa), indem Sie einen 200 g Gewicht auf der PDMS für 5 min.
10. Langsam lösen sich flach PDMS-Form und legen Sie das Deckglas auf einer vorgewärmten Platte (120 ° C) für 5 min auf Restlösemittel zu entfernen und erhöhen die Haftung zwischen der PLGA und dem Deckglas.
11. Setzen Sie den NP PUA Form auf der Oberseite des Flach PLGA und gelten konstanten Druck (~ 100 kPa) und Hitze (120 ° C), indem Sie einen 1 kg-Gewicht auf der Oberseite des PUA-Form, während auf der Heizplatte für 15 min.
12. Entfernen Sie das Gewicht von PLGA Deckglas und lassen Sie die Substrate auf Raumtemperatur abkühlen. Sie PUA Form erst entfernen, wenn die Substrate wurdenabgekühlt.
13. Nachdem die Substrate ausreichend abgekühlt sind, vorsichtig abziehen der NP PUA Form und enthüllt die PLGA NP Substrat. Der NP PLGA Substrat sollte ein schillerndes Aussehen haben.
14. Platzieren abgeschlossen Proben Exsikkator zur Lagerung solange einen Monat.

4. Zellaussaat und Kultur

HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt die Kultur der neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRVMs) und H7 mit menschlichen embryonalen Stammzellen abgeleitete Kardiomyozyten (hES-CMs), aber andere Zellquellen verwendet werden.

1. Bringen Sie die Deckgläser ANF (PU oder PLGA) zu einem 35-mm-Gewebekulturschale Polystyrol. Je 20 ul Norland Optical Adhesive (NOA83H) an den Boden der Schale und vorsichtig platzieren Sie die ANF Deckglas auf der NOA. Lassen Leim, um sich auszubreiten und decken gesamte Deckboden. Cure NOA indem Gericht für 10 min UV.
2. Sterilisieren ANF durch Spülen mit 2 ml 70% ige wässrige Ethanollösung für 5 Minuten, zweimal. E entfernenthanol durch Aspiration. Lassen ANF vollständig an der Luft trocknen für ca. 1 Stunde unter der UV-Sterilisationslampe (λ = 200-290 nm) in der biologischen Sicherheitsschrank.
3. Zelladhäsion wird durch Beschichten der in Fibronektin ANF Nacht verbessert. Verdünnen Fibronektin in DI Wasser auf 5 ug / ml. Pipette 2 ml Fibronektin-Lösung in die Schüssel. Legen im Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO ₂ über Nacht (mindestens 6 h).
4. Erhalten NRVMs, hES-CMs oder andere Herzzellen von Interesse nach den bisherigen Protokollen ^22.
5. Zentrifuge Zellprobe bei 1.000 UpM für 3 Minuten, um die Zellen zu pelletieren.
6. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand durch Aspiration. Stellen Sie sicher, dass das Pellet nicht zu stören.
7. Die Zellen in geeigneten Kulturmedien in einer Konzentration von 4,6 × 10 ⁶ Zellen / ml.
8. Beim Pipettieren von 200 ul Zellsuspension auf sterilisiert ANF. Stellen Sie sicher, Zellsuspension auf dem Deckglas bleibt.
9. Platzieren Zellen bei 37 ° C und 5%CO ₂ für 4 Stunden, damit Zellen auf ANF befestigen.
10. 2 ml warmes Kulturmedien unter den gleichen Bedingungen austeilen und ersetzen Zellen im Inkubator.
11. Nach 24 Stunden zu entfernen Medien und waschen mit 2 ml DPBS zweimal, um überschüssige Zellen zu entfernen.
12. 2 ml warmes Kulturmedien unter den gleichen Bedingungen austeilen und ersetzen Zellen im Inkubator. Kultur die Zellen bis zur Konfluenz. Ersetzen Medien jeden zweiten Tag.

Results

Fig. 1 ist eine schematische Übersicht des Herstellungsverfahrens für die beiden Herstellungsverfahren. Durch die Beugung des Lichts durch die nanoskaligen Topographie verursacht werden, sollten Nanostrukturierung in einem schillernden Oberfläche zu der ANF führen. Abbildung 2 zeigt diese irisierende Oberfläche auf einer gut strukturierten 25 mm NP-PU-Deckglas (2A) mit 800 nm Kamm und Nut Breite (Figur 2B). Die schillernde Erscheinung des ANF etwas abhä...

Discussion

Funktionell reifen Herzgewebe fehlen sowohl in vivo und in-vitro-Anwendungen von Herzgewebe Technik. Die hier beschriebenen Methoden sind CFL Nanofabrikation robuste Techniken zur Erreichung zelluläre Ausrichtung und Einfluss makroskopischen Gewebefunktion aufgrund der Skalierbarkeit des Systems. Große Flächen können einfach strukturiert und für die Zellkultur eingesetzt werden. Makroskopische zelluläre Ausrichtung ist notwendig, um biomimetische, funktionelles Gewebe, da sie sowohl mechanische und ele...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibronektin	BD Biosciences	354008
NOA 76	Norland Products, Inc.	7606B
Oberflächenhaftungspromotor (Glasgrundierung)	Minuta Tech
PUA	Minuta Tech	MINS-311RM
Soft Rubber Roller Speedball
Silicon Wafers	NOVA Electronic Materials	FA01-9900
Photoresist	Shipley	SPRT510
Photoresist Entwickler	Shipley	MF320
Elektronenstrahl-Lithographie-System	JEOL	JBX-9300FS
Ätzsystem	Surface Technology Systems	NP10 8UJ
Plasma-Asher-System	BMR Technology Co.	DSF-200
Ozon-Härtungssystem	Minuta Tech	MT-UV-O- 08
Fusion Cure System	Minuta Tech	MT-UV-A 11
NOA 83H	Norland Products, Inc.	8301
Spin Coater	Laurel Technology	WS-400-6NPP
Skyrol PET Folie	SKC Co., Ltd.	23038-59-9
25 mm Objektträger	Corning	2948
Sylgard 184 Silikonelastomer Kit	Dow Corning	6/5/2553
Poly(D,L-Lactid-co-glycolid)	Sigma-Aldrich	P2191-1G
Chloroform	Sigma-Aldrich	372978-1L
500 g Gewichte	Global Insustrial	T9FB503120
Isopropylalkohol	EMD Millipore	PX1835-2
Heizplatte	Corning	PC-420D
Ultraschallgerät	Branson	B2510MTH