Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Nathaniel T. Remlinger; Peter D. Wearden; Thomas W. Gilbert

doi:10.3791/50059

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Methodenartikel

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

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DOI:

10.3791/50059

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6. Dezember 2012

Nathaniel T. Remlinger¹^,² , Peter D. Wearden¹^,³ , Thomas W. Gilbert¹^,²^,³^,⁴

¹McGowan Institute for Regenerative Medicine, ²Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, ³Department of Cardiothoracic Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh of UPMC, ⁴Department of Surgery, University of Pittsburgh

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Ein Verfahren, um schnell und vollständig zu entfernen zellulären Komponenten aus einer intakten Schweineherz durch retrograde Perfusion wird beschrieben. Dieses Verfahren ergibt eine ortsspezifische kardialen extrazellulären Matrix Gerüst, das das Potential für die Verwendung in einer Vielzahl von klinischen Anwendungen hat.

Zusammenfassung

Perfusion-basierte ganzen Organs Dezellularisierung hat kürzlich Interesse im Bereich des Tissue Engineering als Mittel zur ortsspezifischen extrazellulären Matrix Gerüsten erstellen, gewann unter weitgehender Erhaltung der einheimischen Architektur des Gerüsts. Bisher hat dieser Ansatz in einer Vielzahl von Organsysteme verwendet worden, einschließlich Herz, Lunge, Leber und ^1-5. Vorherige Verfahren zur Dezellularisierung Gewebe ohne eine leicht zugängliche Gefäßnetz haben bei längerer Exposition von Gewebe, Lösungen von Detergentien, Säuren oder enzymatische Behandlungen als Mittel, um die zellulären und atomare Bestandteile aus dem umgebenden extrazellulären Umgebung ^6-8 entfernen gestützt. Allerdings ist die Wirksamkeit dieser Verfahren gelenkig auf der Fähigkeit der Lösungen das Gewebe durch Diffusion eindringen. Im Gegensatz dazu Perfusion von Organen durch die natürliche Gefäßsystem wirksam reduziert den Diffusionsweg und erleichtert den Transport von decellularizatiMittel zum in das Gewebe und zellulären Komponenten aus der Gewebe. Hier beschreiben wir eine Methode, um vollständig decellularize eine intakte Schweine Herzen durch koronare retrograde Perfusion. Das Protokoll ergab ein voll dezellularisierte kardialen extrazellulären Matrix (ECM-c) Gerüst mit der dreidimensionalen Struktur des Herzens intakt. Unser Verfahren verwendet eine Reihe von Enzymen, Detergentien und Säuren mit hypertonischen und hypotonischen Spülungen gekoppelt in der Lyse und Entfernung von Zellen unterstützen. Das verwendete Protokoll eine Trypsin-Lösung, um Zellen von der Matrix durch Triton X-100 und Natriumdesoxycholat Lösungen gefolgt, um die Entfernung von Zellmaterial unterstützen lösen. Die beschriebene Protokoll verwendet auch Perfusion Geschwindigkeiten von mehr als 2 l / min für verlängerte Zeiträume. Die hohe Strömungsgeschwindigkeit, mit der Lösung Änderungen erlaubt den Transport von Agenten des Gewebes ohne Kontamination von Zelltrümmern und gekoppelt gewährleistet effektive Spülung des Gewebes. Das beschriebene Verfahren entfernt alle Kernmaterial von native porcinen Herzgewebe, die Schaffung eines ortsspezifischen kardialen ECM Gerüst, das für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden kann.

Protokoll

Ein. Tissue Vorbereitung und Versuchsaufbau

Ernte Schweinen Organ unmittelbar nach Euthanasie aus einem Schlachthof oder Forschungseinrichtung und spülen Sie überschüssiges Blut. Schneiden Sie die Herzen von überschüssigem Fett und Gewebe, halten die Vorhöfe und der Aorta intakt. Trim entfernt Fett, um die Lungenarterie aus der Aorta zu trennen. Wenn es irgendwelche Schnitte im Gewebe sind, entsprechend zu verwerfen.
Wickeln Sie jedes Herz einzeln in Freezer Paper und speichern alle Gewebe in einem -80 ° C Gefrierschrank für mindestens 24 Stunden, um eine vollständige Einfrieren zu gewährleisten.
Wenn Sie bereit sind für den Einsatz (in der Regel weniger als 3 Monate), Tauwetter ein intaktes gefrorenes Schweinesperma Herz in Type 1 Wasser über Nacht in einem 4-Liter-Becher bei 4 ° C getaucht
Nachdem das Herz vollständig aufgetaut ist, klopfen die Herzen trockenen, wiegen das Herz, und das Gewicht aufgezeichnet. Das Herz eines Marktes Gewicht Schwein sollte wiegen etwa 375-450 g.
Schließen Sie Größe 18 Masterflex Schlauch mit dem ¼ "Ende einer Stacheldraht Druckminderer. Legen Sie die Stacheldraht Druckminderer undSchlauch innerhalb der Aorta. Platz 2 Schlauchschellen oder sichere Kabelbinder um die Aorta, knapp unterhalb des Truncus brachiocephalicus. Der Druckminderer und Schlauch muss über der Aortenklappe bleiben, so die Koronararterien perfundiert können (Abbildung 1).
Verwenden Sie eine 30 oder 60-ml-Spritze, um den Schlauch mit Typ I Wasser zu füllen. Legen Sie den Schlauch in der Patrone eines Masterflex Schlauchpumpe in seiner ungefähren Mittelpunkt. Submerge der Zufluss Ende des Schlauches in den Boden eines 4 L-Becherglas mit 2,5 l Wasser gefüllt und sichern den Schlauch.
Legen Sie die Herzen im Becher mit Wasser gefüllt, und prime die Pumpe Luftblasen zu entfernen. Wenn Blasen beobachtet werden, die von der Aorta, wo der Schlauch eingelegt wird, kann die Aorta neu positioniert oder mit zusätzlichen Bindungen befestigt werden. Eine luftdichte Dichtung ist wichtig, um eine angemessene Druck während der Dezellularisierung Verfahrens (Abbildung 2) zu halten.
Legen Sie die 4 L Becherglas mit 3 L einer 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN3 Lösung auf Rührplatte und erwärmen auf 37 ° C bei der Vorbereitung der Dezellularisierung Prozess.

2. Tissue Spülen

Die Pumpe auf einer Strömungsgeschwindigkeit von 400 ml / min, wobei auf die korrekte Größe Schlauch ausgewählt ist. Spülen Sie das Herz mit Typ I Wasser für 15-25 min. Da die Pumpe gestartet wird, sollte das Herz anschwellen und effuse Blut aus den Herzkammern. Frische Lösung sollte alle 5-10 min substituiert sein kann, oder als bezogen auf die Menge an Blut aus dem Herzen entnommen benötigt. Wenn Blut nicht vom Herzen ausgegossen, passen die Schläuche und Klemmen wie nötig.
Stoppen Sie die Pumpe und übertragen das Herz zu einem separaten Becherglas mit 2X Phosphat gepufferten Saline (PBS). Nachdem der Schlauch in der Lösung eingetaucht ist, starten Sie die Pumpe und erhöht den Durchfluss auf 700 ml / min. Das Herz sollte in-Lösung für 15 min bleiben, verändert die Lösung alle 5 min. Jede Lösung Wandel erfordert die Pumpe vorübergehend gestoppt werden, während das Gewebe und Schläuche bewegtauf den neuen Becherglas.
Übertragen Sie das Herz I Wasser für 10 min Geben und erhöhen den Durchfluss auf 750 ml / min.

3. Dezellularisierung und Solution Perfusion

Übertragen Sie die Herzen in das Becherglas mit 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ bei 37 ° C. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 1.200 ml / min und starten Sie die Pumpe. Verwenden Sie einen Rührstab am Boden des Bechers zur Lösung im Becherglas zirkulieren platziert. Das Herz sollte im Bereich von 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN _3-Lösung bei 37 ° C für insgesamt drei Stunden bleiben. Nach 1 Stunde erhöht die Drehzahl auf 1500 ml / min. Nach einer weiteren Stunde, erhöhen die Pumpendrehzahl bis 1.800 ml / min. Das Gewebe wird langsam auf erhöhte Geschwindigkeiten Perfusion zur Konditionierung des Gewebes ausgesetzt und verhindern Ruptur der Gefäße. Das Herz wird anschwellen und fast doppelt so groß bei diesem Schritt des Protokolls. Das Gewebe verliert seine natürliche Farbe, fortschreitend von den Vorhöfen zu den Scheitelpunkt gesamten the-Protokoll (Abbildung 3).
Nach jeder Lösung Perfusion wird ein zweistufiger Spülen durchgeführt wird, um Zelltrümmer, chemischer Rest ist, und Hilfsmittel Zelllyse zu entfernen. Jedes Spülen besteht aus einem 10 min Spülen in Typ I Wasser durch eine 10 min abspülen mit 2X PBS-Lösung bei Raumtemperatur. Jede Wäsche besteht in der Entfernung von Lösung aus dem ursprünglichen Becherglas Zugabe Spüllösungen, und Zirkulieren des Perfusats in den Becher mit dem untergetauchten Herzens. Nach 0,2% Trypsin/0.05% EDTA/0.05% NaN _3-Lösung, Wasser bei perfuse 1900 ml / min und dann perfundieren 2X PBS auf 1950 ml / min.
Übertragen das Herz zu einer Lösung von 3% Triton X-100/0.05% _EDTA/0.05% NaN3 bei Raumtemperatur. Erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2.000 ml / min und perfuse Lösung für eine Stunde. Entfernen Sie die Lösung aus dem Becherglas und ersetzen mit frischer Lösung, erhöhen Sie die Drehzahl der Pumpe bis 2100 ml / min, und versorgen die frische Lösung für eine weitere Stunde und eine Hälfte, womit sich die gesamte Zeit in3% Triton X-100/0.05% EDTA/0.05% NaN ₃ bis 2,5 Stunden.
Spülen Sie das Gewebe in Typ I Wasser bei 2150 ml / min und 2X PBS bei 2180 ml / min für jeweils 10 Minuten.
Übertragen das Herz auf eine 4% Natriumdesoxycholat Lösung bei Raumtemperatur. Erhöhen der Pumpgeschwindigkeit, um 2200 ml / min und perfuse Lösung für 3 hr.
Spülen des Gewebes in Wasser bei Typ I und 2X PBS bei 2200 ml / min für 15 Minuten jeweils, Ändern der Lösungen nach 5-10 min für jede Lösung. Die beschriebenen Schritte Perfusion kann über mehrere Tage durch Durchführen der Spülschritt zweimal und Speichern des Herzens mit aufgesetzter Schlauch über Nacht bei 4 ° C gespalten werden, und eingetaucht in Typ I Wasser.
Am folgenden Tag, führen Sie eine 5 min mit Typ I Wasser spülen bei 750 ml / min, gefolgt von einer 5 min Spülen in 1X PBS bei 1.500 ml / min. Das Protokoll kann dann bei der beschriebenen Strömungsrate in der richtigen Lösung fortgesetzt.

4. Desinfektion und Endfertigung

Übertragen Sie das Herz einer 0,1% peracessigsäure / 4% Ethanol-Lösung und perfuse Lösung für 1,5 h bei 2200 ml / min.
Die Endspülungen für das Gewebe alle auf 2200 ml / min durchgeführt. Perfundieren des Gewebes mit 1X PBS für 15 min, gefolgt von zwei Waschungen in 5 min Typ I Wasser. Diese Reihe von Spülungen wird noch einmal wiederholt, um die Lösung Perfusion abzuschließen.
Schalten Sie die Pumpe aus und entfernen Sie das Herz aus der Lösung, um das Herz zu entleeren. Schneiden Sie die Bindungen aus der Aorta, entfernen Sie alle Schläuche, und legen Sie das Herz in ein leeres Becherglas für 1 Stunde abtropfen lassen. Überschüssige Flüssigkeit wird müssen regelmäßig entleert werden. Legen Sie das Herz auf eine saugfähige Unterlage vollständig entleeren das Herz (Abbildung 4).
Nachdem der größte Teil des Wassers entfernt wird, das Gewicht aufgezeichnet des kardialen extrazellulären Matrix (ECM-C). Das Herz kann erwartet werden ca. 20-25% des ursprünglichen Gewichts während der Dezellularisierung Prozess verliert.
Sezieren die rechte und linke Herzkammer, sowie die ventrikuläre Septum zur DNA quantificatiauf und histologischen Bearbeitung, um zu bestätigen komplette Dezellularisierung des Gewebes (Abbildung 5).
Einfrieren der C-ECM bei -80 ° C für mindestens 2 h vor der Lyophilisation.