Klinische Anwendung der<em&gt; Dornröschen</em&gt; Und künstliche Antigen präsentierenden Zellen genetisch zu verändern T Zellen aus dem peripheren und Nabelschnurblut

Zusammenfassung

T-Zellen, die einen CD19-spezifischen, chimären Antigen-Rezeptor (CAR) als Entwicklung für die Behandlung von B-Zell-Malignomen im First-in-human Gentherapieprüfungen infundiert. Wir beschreiben genetische Modifikation von T-Zellen mit Hilfe der Dornröschen (SB)-System an CD19-spezifischen CAR und selektive Anzucht auf Designer-CD19 + künstlichen Antigen-präsentierende Zellen einzuführen.

Zusammenfassung

Die Potenz von klinischem T-Zellen kann durch die Kombination mit gentherapeutischen Immuntherapie, um eine biologische Produkt mit dem Potential für superior (i) Erkennung von Tumor-assoziierten Antigenen (TAA), (ii) nach der Infusion Persistenz, (iii) konstruieren verbessert werden Potenzial für Migration auf Tumorstellen, und (iv) Fähigkeit zur Effektorfunktionen im Tumor-Mikroumgebung recyceln. Die meisten Ansätze zur genetischen Manipulation von T-Zellen für die Anwendung beim Menschen entwickelt haben Retrovirus und Lentivirus für die stabile Expression von CAR ^1-3 verwendet. Dieser Ansatz, obwohl konform mit den aktuellen Good Manufacturing Practice (GMP), kann teuer werden, da es sich auf die Herstellung und Freisetzung von klinischem rekombinanten Virus aus einer begrenzten Anzahl von Produktionsstätten verlässt. Der elektro-Übertragung von nichtviralen Plasmide ist eine attraktive Alternative zu DNA-Spezies seit Transduktion kann klinischer Güte bei etwa hergestellt werden ^1/10 die Kosten recombinant GMP-grade-Virus. Um die Effizienz der Integration, die wir angepasst Sleeping Beauty (SB) Transposon und Transposase zur Anwendung am Menschen ^4-8 verbessern. Unsere SB System verwendet zwei DNA-Plasmide, die aus einem Transposon kodierend für ein Gen von Interesse (zB ^2. Generation CD19-spezifische CAR Transgen bezeichnet CD19RCD28) und einer Transposase (zB SB11), die das Transgen in Einsätzen TA Dinukleotid wiederholt ^9-11 bestehen . Um klinisch ausreichende Zahl von T-Zellen genetisch veränderte verwenden wir K562-derived künstliche Antigen präsentierende Zellen (AAPC) (Klon # 4) modifiziert, um ein TAA (zB CD19) sowie die T-Zell-kostimulatorischen Moleküle CD86, CD137L, exprimieren ein membrangebundenen Version des Interleukin (IL) -15 (Peptid an modifiziertem IgG4 Fc-Region fusioniert) und CD64 (Fc-γ-Rezeptor-1) für das Laden von monoklonalen Antikörpern (mAb) ^12. In diesem Bericht zeigen wir die Verfahren, die in complia vorgenommen werden kannnce mit cGMP um CD19-spezifischen CAR ⁺ T-Zellen für die Anwendung beim Menschen zu erzeugen. Dies wurde durch die synchrone elektrooptischen Transfer von zwei DNA-Plasmide, ein SB Transposon (CD19RCD28) und ein Transposase SB (SB11) durch Abrufen von stabilen Integranten von den jeder Tag-7-Additionen (Stimulationszyklus) von γ-bestrahlten AAPC gefolgt erreicht (Klon # 4) in Gegenwart von löslichen rekombinanten humanen IL-2 und ^IL-21-13. Typischerweise 4 Zyklen (28 Tage kontinuierliche Kultur) durchgeführt, um klinisch ansprechenden Zahlen von T-Zellen, die stabil exprimieren, die CAR generieren. Diese Methodik zur Herstellung klinischem CD19-spezifische T-Zellen können die T-Zellen aus dem peripheren Blut (PB) oder Nabelschnurblut (UCB) abgeleitet aufgebracht werden. Weiterhin kann dieser Ansatz genutzt werden, um T-Zellen zu verschiedenen Tumorarten durch Paarung der Spezifität des eingeführten CAR mit Expression des TAA, durch den CAR erfasst, auf der AAPC erzeugen.

Protokoll

Tag 0 oder vor

Ein. Isolierung von mononukleären Zellen (MNC) aus PB und UCB

1. Verdünnte PB mit gleichem Volumen und UCB mit vier Volumina PBS-EDTA.
2. Langsam Schicht verdünntem Blut (25 ml) auf Ficoll (12 ml) in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen (s) und Zentrifuge bei 400 xg für 30 - 40 min (keine Bremse).
3. Sammeln und übertragen die mononukleären Zellfraktion (Interface) mit einem Transferpipette einem frischen 50 ml Zentrifugenröhrchen.
4. Bringen Sie die Lautstärke auf 50 ml mit PBS-EDTA und zentrifugieren bei 450 xg für 10 min.
5. Überstand vorsichtig resuspendieren das Zellpellet (s) in 50 ml von Complete Culture Media (CCM) und Zentrifuge bei 400 xg für 10 min.
6. Gently resuspendieren und Pool der Zellpellets in CCM und führen Sie eine Zellzahl mit Trypanblau-Ausschluss-Verfahren (Cellometer, PBMC-Programm).
7. MNC kann nun zur Elektroporation (Nucleofection) verwendet oder kryokonserviert für zukünftige Verwendung.

Titel "> 2. Herstellung von T-Zellen für die Elektroporation an Tag 0

1. Bei Verwendung kryokonservierten MNC, schnell auftauen ausreichend Zellen für eine Vollaussteuerung Elektroporation (2 x 10 ⁸ ~ 20% Zugabe zu berücksichtigen Zellverlust während Zentrifugation und 2 h Inkubation) in 37 ° C warmes Wasserbad. Wenn frisch isolierten Verwendung MNC fahren 2,3 fort.
2. Sanft resuspendieren und übertragen Zellen einem entsprechend dimensionierten Zentrifugenröhrchen (en) enthaltenen vorgewärmten vollständiger phenolfreien RPMI Kulturmedium (PF-RPMI) und Zentrifugieren bei 200 xg für 10 min (kein Bremsen), Aspirat Überstand.
3. Resuspendieren der MNC in PF-RPMI Führen einer Zellzählung (Cellometer) und übertragen Zellen einem entsprechend dimensionierten Zellkulturgefäß (en) in einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen / ml.
4. Inkubieren in einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO ₂ Inkubator für 2 h ± 30 min.
5. Übertragen Sie die MNC um sterile Zentrifugenröhrchen (s), Spin bei 200 xg für 5 min (keine Bremsen), den Überstand aspirieren und sanft rE-suspendieren und kombinieren die Zellpellet (s) im PF-RPMI.
6. Durchführen einer Zellzahl (Cellometer) und berechnet den Volumen der Zellsuspension erforderlich (2 x 10 ⁸ MNC).
7. Übertragen Sie das berechnete Volumen in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen und Spin bei 200 xg für 10 min (keine Bremse).
8. Überstand, so dass keine Restmedien und bleibt vorsichtig durch Antippen Rohrseite wieder auszusetzen.

3. Elektroporation (Nucleofection) von MNC (Full Scale-Prozess Mit 10 Küvetten) am Tag 0

1. Pre-Inkubation einer sterilen 12-Well-Platte mit 10 Vertiefungen mit 4 ml warmem PF-RPMI in einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO _2-Inkubator.
2. Vorbereitung und Vorwärmung der Lonza Nucleofector Lösung humanen T-Zell-Kit (rekonstituiert den Anweisungen des Herstellers, www.lonza.com ) auf Umgebungstemperatur in einem Biosicherheitswerkbank (BSC).
3. Bereiten Nucleofector Lösung / DNA-Master-Mix von adding 100 ul ergänzt Nucleofector Lösung, 15 ug Transposon (supercoiled DNA Plasmid CD19RCD28/pSBSO bezeichnet) und 5 ug Transposase (supercoiled DNA Plasmid pCMV-SB11 bezeichnet) pro Reaktion / Küvette.
4. Disperse das Zellpellet (aus Stufe 2.8) durch leichtes Antippen der Seite der Zentrifugenröhre und in Nucleofection Lösung / DNA-Master-Mix (End Zellkonzentration: 2 x 10 ⁷ Zellen/100 ul) erneut zu suspendieren.
5. Transferieren es vorsichtig in 100 ul der Zellsuspension (aus Schritt 3,4) zu jedem der zehn (10) Lonza Nucleofection Küvetten, wobei darauf zu Blasen zu vermeiden.
6. Tippen Sie auf die Küvette einmal, und elektroporieren mit dem Programm U-014 (für unstimulierten T-Zellen).
7. Übertragen der Küvetten und die 12-Well-Platte (Stufe 3.1) an die BSC.
8. Ernte der elektroporierten Zellen aus jeder Küvette unter Verwendung eines feinen Spitze Amaxa Transferpipette durch Zugabe ~ 500 ul des vorgewärmten Kulturmedium aus der entsprechenden Vertiefung (12-Well-Platte in Ste hergestelltp 3,1) und gibt die Platte an einer befeuchteten 37 ° C / 5% CO ₂ Inkubator für 2 h ± 30 min.
9. Nach der 2-stündigen Inkubation, Ernte und übertragen die Zellen aus allen Vertiefungen in ein steriles Zentrifugenröhrchen.
10. Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 140 × g für 8 min, Raumtemperatur, ohne Bremse und abzusaugen und den Überstand verwerfen, so dass kein restliches Medium des Zellpellets umfasst.
11. Disperse das Zellpellet durch leichtes Klopfen an die Seite des Zentrifugenrohres und sanft in CCM resuspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erreichen.
12. Führen Zellzahl und justieren Zellkonzentration bis 10 ⁶ Zellen / ml in CCM.
13. Übertragen Zellsuspension Zellkulturflasche (s) und Platz im Inkubator über Nacht.
14. EGFP-transfizierten Zellen (5 × 10 ⁶ Zellen / Küvette mit 5 pg Amaxa Steuerung EGFP superspiralisierte Plasmid, pmaxGFP): Verfahrensschritte 2,1 bis 3,8 wurden zur Kontrolle wiederholt.

Tag 1 der ^1. und anschließendeStimulationszyklen

4. Analyse der CAR Expression mittels Durchflusszytometrie am Tag 1

1. Ernte der elektroporierten Zellen und führen eine Zellzahl mittels Trypanblau-Ausschluss-Verfahren (Hämozytometer).
2. Fleck-Zellen (1 bis 2 x 10 ⁶⁾ mit dem Antikörper spezifisch für CD3, CD4, CD8 und humanen IgG Fcy (als Maß für CAR Expression).
3. Erwerben Zellen auf FACS Calibur und analysieren die Daten mit FCS Express-Software um die Expression von CAR berechnen.
   1. Berechnen CAR ^+-Zellen in Kultur durch die Formel:
      (Anzahl der insgesamt lebensfähigen Zellen) x (% CAR ⁺ Zellen) = Anzahl der CAR ^+-Zellen

5. Herstellung AAPC (Klon # 4) an Tag 1. AAPC (Klon Nr. 4) wurden aus K562-Zellen (Parental Linie von der American Type Culture Collection erhalten) zu Co-express Gewünschter T Cell co-stimulatorisches Molekül Derived

1. Auftauen eines Aliquots von gefrorenen 100 Gy bestrahlten AAPC in einem 37 °, C Wasserbad.
2. Zellen werden zweimal durch Zentrifugieren bei 400 × g, 10 min in CCM gewaschen und gezählt unter Verwendung Cellometer (Trypanblau-Ausschluss).
3. Berechnen Anzahl der lebensfähigen AAPC zur Stimulation erforderlich:
   (Anzahl der CAR ⁺ Zellen) x 2 = Anzahl der bestrahlten AAPC erforderlich

6. AAPC-vermittelte Stimulation der CAR ⁺ T-Zellen an Tag 1 Beginn der ^1. und nachfolgende Stimulation Cycles

1. Mischen elektroporierten Zellen (exprimierenden CAR) und γ-bestrahlten AAPC (Klon # 4) in einem sterilen Behälter in einem Verhältnis von 1:2 (CAR ⁺ Zelle: lebensfähige AAPC) in CCM.
   1. Man beachte die AAPC Verhältnis für die Expression von CAR auf Durchflusszytometrie am Tag nach der Elektroporation basierend eingestellt wird.
2. Hinzufügen IL-21 (30 ng / ml) zu der Zellsuspension.
3. Aliquot in T-75 cm ^2-Kolben (s) und / oder Vue Leben Kultur Beutel in einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen / ml und zum INCUBAToder.

Tagen 3, 5

7. Fortsetzung Kultur der CAR ⁺ T-Zellen

1. Eine Halbe-Medienwechsel, aufzufüllen IL-21, und aufrechtzuerhalten T-Zellen bei einer Konzentration von 10 ⁶ Zellen / ml.

Tag 7

8. Ende des ersten AAPC-vermittelte Stimulation Zyklus

1. Ernten Sie die Zellen, zu zählen und für CD3, CD4, CD8 und Fcy (CAR) färben und fahren auf 10,1 fort.

9. Depletion von CD56 ^+-Zellen (in der Regel zwischen 7 und 14 Tage nach der Elektroporation)

1. Durchführen einer CD56 Depletion mit paramagnetischen Kügelchen wenn CD56 + CD3 ^neg. Lymphozyten ≥ 10%.

Stimulation Cycles # 2, # 3, und # 4 Entsprechend Tage 8 → 14, Tage 15 → 21, & Days 22 → 28

10. Rekursive Addition von AAPC T Cells Klinisch ausreichender Zahl Propagieren

1. Wiederholen Sie den stimulation Prozesses (4 mal), wie in Schritten von 4,3 bis 8,1 beschrieben.
2. Fügen IL-2 (50U/ml) zu den Kulturen, die am Tage 7, 14 und 21, und dann bei jedem Medienwechsel (drei Mal pro Woche, an einem Montag-Mittwoch-Freitag Zeitplan).
3. Kryokonservierung (Archiv) Überschuss T-Zellen, wie gebraucht.
   1. T-Zellen eingefroren mit kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank.

Tag 28

11. Ende des letzten AAPC-vermittelte Stimulation Zyklus: Harvest T-Zellen

1. Kryokonservierung T-Zellen für Release-Tests und Infusion.

Ergebnisse

Wir berichten, dass elektro-Transfer von DNA-Plasmiden und Vermehrung von T-Zellen auf γ-bestrahlten AAPC verwendet werden können, um klinisch-ansprechend Zahl von T-Zellen aus PB und UCB Verwendung beim Menschen abgeleitet erzeugen. Diese gentechnisch modifizierten T-Zellen exprimieren eine eingeführte CAR, der TAA CD19, unabhängig von Haupthistokompatibilitätskomplex erkennt. Die SB-abgeleiteten DNA-Plasmide zur Expression der (i) Transposon, ein ^2. Generation CAR (CD19RCD28), daß Signale, die durch CD28 und CD3-ε ^14, und (ii) Transposase, SB11 ^15, wurden zuvor ^{13, 16,17} . Die Plasmide in der aktuellen Studie wurden kommerziell von Waisman Klinische Biomanufacturing Facility (Madison, WI) hergestellt. Die AAPC (Klon # 4), von K562-Zellen (elterliche Linie von American Type Culture Collection), Co-express gewünschte T-Zell-co-stimulierende Moleküle (jeweils eingeführt Molekül ³ 90% auf der Zelloberfläche von AAPC) abgeleitet,wie zuvor beschrieben ^12. Hier zeigen wir, dass CD19-spezifische T-Zellen aus mononukleären Zellen (MNC) aus PB oder UCB Verwendung SB Umsetzung, um die CAR durch Zugabe von AAPC gefolgt numerisch zu erweitern die T-Zellen in einer CAR-abhängigen Weise (Figuren 1 einzuführen abgeleitet erzeugt werden konnte , 4) ^13,18. Zehn Küvetten (2x10 ⁷ MNC / Küvette) werden für jeden Empfänger unter Verwendung von 15 ug DNA-Plasmid (CD19RCD28/pSBSO) codiert Transposon (CAR) und 5 ug Plasmid-DNA (pCMV-SB11) codiert Transposase (SB11) elektroporiert. Die Anzahl der Küvetten können reduziert werden, wenn MNC begrenzen oder wieder für die Laborarbeit skaliert werden. Der Tag der Elektroporation wird als "Tag 0" Stimulation Zyklus # 1 definiert. Als Kontrollen für Durchflusszytometrie und Kulturbedingungen sind autologe T-Zellen Mock elektroporierten (ohne DNA-Plasmid) und numerisch auf γ-bestrahlten AAPC (Klon # 4), wurde mit OKT3 vorbelastet zu vernetzen CD3 auf T Zellen halten ausgebaut Proliferation. We routinely Beurteilung der Effizienz der Elektrotransfer und Lebensfähigkeit der T-Zellen am Tag nach der Elektroporation (Abbildung 2B). Die Expression von EGFP von Kontroll-DNA-Plasmid (bezeichnet pmaxGFP) und CAR in diesem ersten Zeitpunkt spiegelt Proteinexpression von der integrierten und episomale Plasmid. Typischerweise wird die Tage nach der Elektroporation messen wir EGFP-Expression bei ~ 60% und CAR Expression bei ~ 40% (2A) mit T-Zell-Lebensfähigkeit zwischen 40-50%. Rekursives Zugaben von γ-bestrahlten AAPC in Gegenwart von löslichen rekombinanten humanen IL-2 und IL-21 T-Zellen abzurufen stabil exprimieren CAR (CD19RCD28). CD3 ^neg. CD56 ⁺ NK-Zellen sind aus der Kultur unter Verwendung CD56-spezifischer paramagnetischen Kügelchen, wenn der Anteil dieser NK-Zellen ist ≥ 10%, und besonders, wenn der Prozentsatz von CAR auf den T-Zellen exprimiert niedrig ist abgereichert. Dies verhindert die schnelle Abreicherung Überwucherung von NK-Zellen, die mit der Fähigkeit der AAPC stört die proliferatio Sustainn der CAR ⁺ T-Zellen. Gelegentlich wird Depletion von NK-Zellen von CAR ⁺ T-Zellen in den beiden letzten Stimulationszyklen unternommen, aber dies führt ein Verlust der gewünschten Zellen durch Co-Expression von CD56 auf einem gewissen CAR ⁺ T-Zellen. Die T-Zellen wurden in einem geschlossenen System unter Verwendung funktionell Vue Leben Kulturbeutel letzten Tag 14 gewachsen. Eine Teilmenge der gentechnisch veränderten und vermehrt T-Zellen werden in der Regel am Tag 14 oder Tag 21 (Ende Stimulationszyklen Nr. 2 oder Nr. 3) der Co-Kultur auf AAPC kryokonserviert als Quelle der archivierten Material für zukünftige Analysen zu dienen und sein aufgetaut wenn unerwartete Probleme anschließend während des Herstellungsprozesses auftreten. T-Zellen sind in der Regel am oder um den 28. Tag der Kultur (Abbildung 3) geerntet, die routinemäßig ausdrückliche> 90% CAR und> 80% lebensfähig (Abbildung 2C, D). Wir haben zuvor gezeigt, dass nach vier Wochen Co-Kultur auf die durchschnittliche AAPC ausklappbaren Expansion von CD3 + T-Zellen beträgt ± 19.800 11.313 mit CA R ⁺ Ausdruck, der 90% ± 7,5 ^13. Diese T-Zellen kryokonserviert und durchlaufen in-process-und Release-Tests, die auf die Sicherheit und das therapeutische Potenzial des hergestellten Produkts informiert. Release-Tests werden in Übereinstimmung mit Clinical Laboratory Improvement Amendments (CLIA), um ein Zertifikat der Analyse vor der Infusion in Empfänger zu klinischen Studien zu generieren vorgenommen.

Abbildung 1. Schritte skizziert den Prozess elektroporieren und propagieren CAR + T-Zellen aus PB und UCB. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 2. Charakterisierung von genetisch veränderten T-Zellen aus PB. (A) Expression von EGFP am Tag 0 des ersten Stimulationszyklus, um die Effizienz des Gentransfers zu beurteilen. Expression von CD19-spezifischen CAR (CD19RCD28) als mittels Durchflusszytometrie auf CD3 beurteilt ^+, CD8 ⁺ und CD4 ⁺ T-Zellen bei (B) etwa 24 h nach der Elektroporation und (C) 28 Tage nach Co-Kultur auf AAPC. Ähnliche Expression von CAR wurde mit UCB-derived T-Zellen beobachtet. (D) Kinetik der CAR Ausdruck. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 3. Ausbreitung von PB-derived CAR+ T-Zellen. Rate von numerischen Expansion von CD3 ⁺ und CAR ⁺ T-Zellen von PB durch wiederholte Kokultur abgeleitete auf γ-bestrahlten AAPC in Gegenwart von rekombinantem humanen löslichen IL-2 und IL-21. Pfeile zeigen die oben Zugaben von γ-bestrahlten AAPC daß den Anfang jedes Zyklus Stimulation markieren. UCB-derived CAR ⁺ T-Zellen zeigen eine ähnliche Raten von numerischen Erweiterung.

Abbildung 4. Schema des Herstellungsprozesses mit SB und AAPC Systemen genetisch zu verändern und zu propagieren CAR ⁺ T-Zellen von PB und UCB abgeleitet. CD19-spezifische CAR ⁺ T-Zellen wurden durch Elektro-Transfer von SB-abgeleitete Plasmide supercoiled DNA und anschließende Co-Kultur erzeugten auf K562-derived AAPC (Klon # 4) in Gegenwart of rekombinanten humanen löslichen IL-2 und IL-21. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

T Zellquelle	Transposon *	Transposase	T-Zell-Infusion	IRB #	NIH-OBA #	IND #
Autologe (Patient-derived) **	CD19RCD28	SB11	Nach autologen hämatopoetischen Stammzelltransplantation	2007-0635	0804-922	14193
Allogene (Donor-abgeleitet)	CD19RCD28	SB11	Nach allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation	2009-0525	0910-1003	14577
Allogene (Donor-abgeleitet)	CD19RCD28	SB11	Nach allogener Nabelschnurblut Transplantation	2010-0835	1001-1022	14739

* Tabelle 1. Klinische Studien unter der Schirmherrschaft der FDA am MDACC um CD19-spezifischen CAR einzuflößen ⁺ T-Zellen vermehrt auf AAPC. T-Zellen erbracht werden spezifische durch erzwungene Expression von SB Transposons, die für ein 2 ^nd Generation CAR, bezeichnet CD19RCD28, dass Signale über CD28 und CD3-ε für CD19. ** Trial in Referenz ⁵ beschrieben.

Diskussion

Transposon und Transposase Systeme, wie aus piggyBac ^12,19 und SB ^18,20-22, sind nicht-viralen Ansätze zur Gentherapie, die eine Alternative zu viralen-vermittelte Transduktion von klinischer Qualität CAR ⁺ T-Zellen sind. Der SB wurde als Gentransfer-System auf sein Potential für die humane Gentherapie ^1,6,23, zu wählen. Wir entwickelten die duale Technologien von SB Umsetzung (eine CAR einzuführen) und rekursive Addition von γ-bestrahlten AAPC (mit genetisch veränderten T-Zellen abzurufen stabil exprimieren eine CAR) als Plattform Technologien bei der Herstellung von TAA-spezifischen T-Zellen in Übereinstimmung dienen cGMP für Phase I / II-Studien (Abbildung 4). Nach 28 Tagen (vier 7-tägigen Stimulationszyklen) der Co-Kultur auf γ-bestrahlten AAPC sind wir typischerweise in der Lage, um mindestens ~ ¹⁰ 10 genetisch modifizierte T-Zellen geeignet zur Verwendung beim Menschen. Bei Bedarf können zusätzliche Stimulationszyklen t durchgeführt werdeno erzeugen eine größere Anzahl von gentechnisch veränderten T-Zellen. Außerdem, wenn weniger CAR ⁺ T-Zellen benötigt werden, kann der Ansatz zur Elektroporation und Vermehrung zurückgefahren mit weniger Küvetten und Vortrag nur ein Sub-Satz der numerisch expandierten T-Zellen für nachfolgende Runden der Proliferation auf AAPC am Anfang jedes werden Stimulation Zyklus. Die Mehrheit der Elektroporation und vermehrt T-Zellen zur Herstellung einer Infusionslösung stabil exprimieren, die CAR geerntet. Der Auswuchs von CD4 ⁺ und CD8 ⁺ T-Zellen, die unsere 2 ^nd Generation CAR umfassen Zellen mit einem Speicher / naiven Phänotyp und weisen drei Markenzeichen der re-directed Spezifität. Erstens werden die genetisch veränderten T-Zellen spezifisch zu lysieren CD19 ⁺ Targets zweitens IFN-γ zu produzieren als Reaktion auf CD19 ^{+-Zellen-Stimulator} und drittens, proliferieren als Antwort auf CD19 ⁺ Feeder-Zellen, alle in einer CAR-abhängigen Weise ^13,18. Unser Ansatz zur integraß ein CAR Transgens durch Elektrotransfer von nicht-viralen DNA-Plasmiden vom SB-System kann in ruhenden T-Zellen aus primären PB und UCB abgeleitet erfolgen. Wir und andere haben K562-Zellen genetisch modifiziert werden, um zu dienen als AAPC effizient fortpflanzen zu klinisch-ausreichende Zahl von T-Zellen zur Infusion ^24,25. Die AAPC und Gewebekultur Umgebung (z. B. die Zugabe von IL-21) wurden modifiziert worden zu erzeugen patienten-und CD19-spezifische T-Zellen für Infusion nach hämatopoetischen Stammzell-Transplantation (Tabelle 1) ^13,18-Donor stammt. Wir können CAR + T-Zellen aus PB einfach durch Venenpunktion erhalten, vermeidet Kosten, Beschwerden und Unannehmlichkeiten zu erhalten MNC von PB durch Apherese. Die Fähigkeit, eine große Anzahl von CAR ⁺ T-Zellen aus einer kleinen Anzahl von MNC ist besonders attraktiv für die Infusion von T-Zellen nach Transplantation allogener UCB. Die geringe Größe und Anonymität des Neugeborenen Spenders ausschließt re-Zugriff auf diese einzelnen zu einem späteren Zeitpunkt, und nur eine begrenzte Anzahl von geernteten MNC sind als Ausgangsmaterial für T-Zell-Herstellung zu vermeiden stören Hämatopoese. Weitere Fortschritte des Herstellungsprozesses sind derzeit im Gange, um einen hohen Durchsatz Elektroporation Gerät mit einem vollständig geschlossenen WAVE Bioreaktor gekoppelt Handling zu minimieren sind. In Summe werden die SB und AAPC ansprechend Plattformen an CD19-spezifischen CAR ⁺ T-Zellen, die geeignet ist, eine große Anzahl von genetisch veränderten T-Zellen, die alternative Zelloberflächen-TAA unter Berücksichtigung der cGMP erkennen kann generiert werden kann erzeugen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenzien	Verkäufer	Katalog-Nummer
			Reagenzien
DNA-Plasmid GFP (pmaxGFP)	Lonza	VPA-1002 (Set)
PBS	Sigma	D8537
CliniMACS PBS-EDTA	Miltenyi Biotec	70026
HyQ RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30096.01
Phenol Kostenlose RPMI-1640	Thermo Scientific	SH30605.01
Hyclone Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific	SH3007003HI
GlutaMAX(100x)	Gibco	3505-061
Ficoll-Paque	GE Healthcare Biosciences	17-1440-02
Rekombinantes menschliches IL-21	PeproTech	AF-200-21
Rekombinantes humanes IL-2 (Proleukin)	Novartis	NDC 65483-116-07
Humane T-Zell-Kit (Nucleofector Solution)	Lonza	VPA-1002
CliniMACS CD56 Reagent	Miltenyi	70206
FITC-konjugiertem Maus-mAk gegen humanes CD3	BD Biosciences	349201
APC-konjugiertem Maus-mAk gegen humanes CD4	BD Biosciences	340443
PerCPCy5.5-konjugiertenMaus-mAk gegen humanes CD8	BD Biosciences	341051
PE-konjugierten F (ab ') 2-Fragment Ziegen-Antikörper gegen humanes Fcy	Invitrogen	H10104
Natriumazid	Sigma	S2002
			Disposables
12-Well-Platte	Corning	3513
T-75 cm 2-Kolben	Corning	430641
Kulturbeutel	Vue Leben	290C; 750C
50 ml Zentrifugenröhrchen	BD Biosciences	352098
			Ausrüstung
Amaxa Nuceleofector II	Lonza	AAB-1001
Cellometer	Nexcelom Bioscience	Cellometer Vision-
Sorvall Legend RT zentrifugieren	Sorvall	75004377
BD FACS Calibur	BD Biosciences	342975
Kontrollierter Geschwindigkeit Gefrierschrank	Planer	Kryo 750
Irradiator	CIS bio international	IBL-437 C # 09433
			Expression von Molekülen (Endogene und Eingeführt) Cell Line Common Name Zelltyp Moleküle exprimiert CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 Clone 4 K562 CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP mit Membran coexprimierten gebunden IL-15 Komplette Nährmedien (CCM) (bei ​​4 ° C für bis zu 30 Tage) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% GlutaMAX Durchflusszytometrie Buffer (bei ​​4 ° C für bis zu 30 Tage) PBS 2% FBS 0,1% Natriumazid