Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung In vivo Und einzelne Zelle Auflösung.

Zusammenfassung

Der Tumor Mikroumgebung spielt eine zentrale Rolle in Tumor Initiation, Progression, Metastase, und dem Ansprechen auf Anti-Krebs-Therapien. Dreidimensionale Co-Kultur-Systeme werden häufig verwendet, um Tumor-Stroma-Interaktionen, einschließlich ihrer Rolle in der Medikamentenentwicklung Reaktionen explizieren. Allerdings können viele der Wechselwirkungen, die in vivo im intakten Mikroumgebung auftreten, nicht vollständig in diesen werden in vitro-Einstellungen repliziert. So, hat direkte Visualisierung der dieser Prozesse in real-time geworden ein wichtiges Werkzeug in das Verständnis Tumor-Reaktionen zu Therapien und die Identifizierung der Interaktionen zwischen Krebs Zellen und dem Stroma, die diese Reaktionen beeinflussen können. Sie hier, stellen wir ein Verfahren für die Verwendung von Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskopie von lebenden, anästhesiert Mäuse, um direkt beobachten der Verteilung des Arzneimittels, Krebs Zell-Reaktionen und Veränderungen in Tumors-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung von systemischen Therapie bei Brustkrebs Modelle. Wir beschreiben Verfahren für die labeling verschiedenen Tumor Komponenten, Behandlung von Tieren für die Beobachtung therapeutische Reaktionen, und die chirurgische Prozedur zum Belichten von Tumor-Geweben für die Bildgebung up bis 40 Stunden. Die Ergebnisse aus dieser-Protokoll erhalten werden, sind time-lapse-filme,, in denen solche Prozessen als Drug Infiltration, Krebszelle Tod und stromalen Zellmigration evaluiert sie mit Bild-Analyse-Software kann werden.

Einleitung

Krebszellen und den Stromazellen Bestandteile (beide zellulären und nicht-zellulären), die bei der Aufrechterhaltung eines geeigneten Umfelds für das Tumorwachstum ^{1 Assist:} Solide Tumoren bestehen aus zwei großen Fächern zusammen. Diese Stromatumoren Bestandteile spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung, Progression und Metastasierung von vielen Arten von Krebs, einschließlich derjenigen der Brust ^2-5. Die Stromazellen Milieu beeinflusst auch therapeutische Reaktionen ^2,4,5. Somit bestimmen, wie Krebszellen zu konventionellen und neuartige Therapien ansprechen im Kontext des intakten Mikroumgebung ist, das Verständnis der Krebsbiologie und Verbesserung der derzeitigen therapeutischen Strategien wichtig. Darüber hinaus definiert, wie Krebszellen-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung der Therapie zu ändern, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Biologie des Tumors Rückfall.

Organotypischen Kokultur Systeme wurden für die Untersuchung Tumor-Stroma-Interaktionen nützlich 6, aber es ist offensichtlich, dass die derzeit verfügbaren Methoden nicht erfolgreich rekapitulieren die intakte Tumormikroumgebung in vitro, insbesondere bezüglich Gefäßfunktion und Rekrutierung von Immunzellen. Tatsächlich sind Krebszelle Reaktionen auf Therapien, die in vitro beobachtet werden oft erheblich von denen in vivo, wo der Mikroumgebung intakt ⁵ beobachtet. So kann in vivo Modelle für das Studium Tumor-Stroma-Interaktionen und deren Auswirkungen auf therapeutische Reaktion besser widerspiegeln klinisch relevanten Mechanismen ^sieben.

Die primäre Mittel des Studiums Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie in vivo haben durch Messungen der Tumorgröße und histologische Untersuchung von Gewebe aus behandelten Tieren oder Patienten gewonnen wurden. Allerdings haben Fortschritte in der Mikroskopie und Fluoreszenz-Reporter in den vergangenen zwei Jahrzehnten die Visualisierung der inter-und intrazellulären Prozesse aktiviertmit hoher Auflösung in live, narkotisierten Tieren (intravital imaging) ^8. Diese Intravitalmikroskopie Technologien haben sich als besonders wertvoll für räumlich und zeitlich sezieren die in vivo Dynamik der Tumor-Stroma-Interaktionen auf zellulärer und sub-zellulärer Auflösung ^8,9.

Prozesse, die von intravitalen Imaging wurden entwirrt umfassen Anti-Tumor-T-Zellen-Cytotoxizität ^10,11, Interaktionen zwischen T-Zellen und myeloiden Zellen ^12, die Dynamik der Veränderungen in Kollagenzusammensetzung und Organisation nach therapeutischer Behandlung ^13, Makrophagen-abhängigen Krebszelle Intravasation und Metastasierung ¹⁴ und Gefäßpermeabilität ^15.

Es gibt drei wesentliche Voraussetzungen für intravital Bildgebung. Dazu gehören eine angemessene Vorbereitung und Belichtung von Geweben für die Bildgebung, Fluoreszenzmarkierung der Gewebe-Komponenten von Interesse, und eine gepaarte Mikroskopie-Kamera system Lage des Erwerbs Bilder ^16. Die häufigsten verwendeten Strategien, um diese Anforderungen zu erfüllen sind: 1) heterotope Zubereitungen (zB Impfung am Ohr oder Auge orbital), permanent Bildgebung Fenster oder exteriorisierten Zubereitungen (zB dorsalen Hautlappen); 2) Transgene fluoreszierenden Reporter und.. fluoreszierenden Injektabilia zu etikettieren Gewebekomponenten und 3) Multiphotonen oder konfokalen Mikroskopie-Systeme mit Photovervielfacherröhren oder Charge-Coupled Device (CCD)-Kameras bzw. ⁹ gepaart. Wir verwenden eine chirurgisch präparierten Hautlappen Modell, um die Leistengegend Brustdrüse für die Bildgebung in narkotisierten Tieren, die Transgene kodieren fluoreszierenden Reporter auszudrücken aussetzen. Bilder werden über einen Zeitraum von 12 bis 40 Stunden unter Verwendung einer intensivierten CCD (ICCD)-Kamera mit einem Vier-Laser Schleuderscheibe konfokalen Mikroskopsystem ¹⁷ gepaarten erhalten. Imaging in dieser Weise hat uns erlaubt, solche Prozesse in vivo Verteilung von Medikamenten, Bühne-abhängige ch studierenemotherapeutic Reaktionen, der Art der Chemotherapie-induzierten Zelltod und myeloide Zellverhalten ^5.

Wir stellen ein Protokoll für die intravitalen Bildgebung Krebszelle Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie und Tumor-Stroma-Interaktionen in Mausmodellen von Brustkrebs. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Einstellungen und den Tod beider Krebszellen und Stromazellen Komponenten mit einer Vielzahl von transgenen und injizierbare Fluoreszenzmarkierungen in beiden transgenen und Transplantationsmodellen für Zeiträume von bis zu 40 Stunden in einem einzigen Bildgebungssitzung verfolgen.

Protokoll

Alle Prozeduren beschrieben sind, müssen in Übereinstimmung mit den Leitlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren Tiere, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch dem lokalen Institutional Animal Care und Formate Committee durchgeführt werden.

Ein. Generieren von Maus-Mammary Tumoren for Imaging (Transgenic-oder Orthotopische)

1. Generieren Mammatumoren zur Bildgebung mittels gentechnisch Mausmodellen (zB Maus-Mammatumor-Virus Long Terminal Repeat [MMTV]-Polyoma mittleren T-Antigen [PYMT] oder die Ratte C3 (1)-Promotor angetrieben große T-Antigen (Tag) von SV40 [C3 ( 1)-Tag]-Modelle) oder orthotoper Transplantation Modelle (syngenen, allogen, oder xenogenen).
2. Etiketts Krebszellen durch Kreuzen genetisch dazu entworfen Modelle mit transgenen Reporter-Linien (zB ACTB-ECFP) oder verwenden Sie ex vivo Manipulation von primären Krebs Zellen oder Zelllinien (zB Transduktion) durch Transplantation gefolgt. Für einer Probe-Protokoll für orthotoper Transplantation, see ^18.

2. Visualisierung Komponenten der Tumor-Mikroumgebung oder Sub-zellulären Komponenten

1. Visualizing Tumor--Komponenten unter Verwendung von transgenen Etiketten. Crossbreed gentechnisch veränderten Tumor-Modellen mit transgenen Reporter Mäusen (z. B. c-fms-EGFP für myeloide Zellen oder ACTB-H2B-EGFP für Kerne) oder verwenden Sie solchen Mäusen als Empfänger von transplantierten, beschriftet Geweben. Dies ermöglicht Visualisierung von Krebszelle-stromalen Zell-Wechselwirkungen in Reaktion auf Therapie oder nuklearen Veränderungen with cell Tod assoziiert, jeweils.
2. Visualizing die Mikroumgebung Verwendung Injektabilia. Eine breite Vielfalt von Agenzien (zB fluoreszierend markierten Antikörpern oder chemischen Farbstoffen) kann verwendet, um verschiedene Komponenten des Tumors beschriften werden. Abhängig von der Halbwertszeit von dem Farbstoff und dem Ansprechen eins in-Tracking-Systems interessiert wird, kann die injizierbaren vor dem Beginn of imaging verabreicht werden oder während des Imaging-Sitzung entweder intravenös (iv.) Oder intraperitoneally (ip., Abbildung 1).

3. Mikroskope und Imaging Software

1. Microscope. Eine Vielzahl von Mikroskop-Systeme und Software kann für die Abbildung von lebenden Mäusen verwendet werden. Die am häufigsten verwendeten-Systeme sind konfokalen bzw. Mehrphotonen-Mikroskope. Wir verwenden ein Mikro-lensed Spinning-Disk-konfokalen Mikroskop (Solamere Technologies, Salt Lake City, UT) mit einer ICCD-Kamera (XR-Mega-10EX S-30, Stanford Photonics, Palo Alto, CA).
2. Imaging-Software. Wir verwenden die Open-Source--Software μManager (Vale Lab, University of California, San Francisco [UCSF]).
3. Bild Analyse. Wir verwenden Imaris (Bitplane), Volocity (PerkinElmer), und ImageJ (National Institute of Health [NIH]) für die Bildanalyse.

4. (Pre)-Behandlung von Animals for Imaging

1. Inguinalen Mammatumoren und sind nicht Bildgebung unter Verwendung unser Protokoll wenn das längsten Durchmesser misst ungefähr 8 mm oder weniger durch caliper Mess optimaleement.
2. Zum Abbilden Tiere mit einem kleinen Molekül-Hemmer, therapeutische Antikörper oder Chemotherapeutikum behandelt, beginnen Behandlung vor oder während der Bilderzeugung als für das Experiment erforderlich. Zum Beispiel erfordert Bildgebung von Droge Extravasation und Verteilung Verabreichung nach der Bebilderung initiiert worden ist (Filme 1 und 2), während Bildgebung von Zell Tod durch das chemotherapeutischen Medikaments Doxorubicin induziert wird am besten durch Starten Bildgebung 24 hr oder später nach der Arzneimittelbehandlung erobert (Filme 3 und 4).

5. Vorbereitung der Saline für die Die Aufrechterhaltung Hydration and Blood Osmolarität der Divisionen Animal während der Imaging

1. Zeichnen Sie etwa 1 ml aus 1x PBS in eine 1 ml Spritze. Propidiumiodid (PI, Invitrogen, 1 mg / ml, verdünnte 1:15) können zu dieser Lösung, die periodisch verabreicht werden wird (ip.) Während des Imaging-Sitzung zugesetzt werden. Dies wird für Bildgebung von den Kernen von toten oder sterbenden Zellen, die permeablen Zelle Membranen haben zu erlauben. PI hat eine sehr kurze half-Lebensdauer in dem Gefäßsystem und muss daher in der Imaging-Sitzung erneut verabreicht werden.
2. Befestigen Sie eine winged Infusionsset (23 Gauge, ¾ Zoll-Nadel, 12 inch tubing) zu dieser Spritze und schieben Sie den Lösung durch den Schlauch bis ein Tropfen von Salzlösung Exits die Spitze des Nadel am Ende des Schlauchs.
3. Nehmen Sie die Spritze aus dem Infusionsset, und füllen Sie ihn mit dem entsprechenden Kochsalzlösung.
4. Befestigen Sie wieder die Spritze mit dem Infusionsset, kümmert sich nicht um Blasen in die Leitung eingeführt.

6. Vorbereitung des Isoflurane Anesthesia-System

1. Fügen Sie Wasser an den Vernebler und schrauben Sie ihn an Ort und Stelle. Dies wird zu befeuchten die Gase geliefert zu dem Tier, die Verhütung Reizung der den Lungen und das Überleben verlängern von Tieren unter langen-term Anästhesie.
2. Füllen Sie den Isofluran Tank, um der obersten Zeile. VORSICHT: Isoflurane ist ein potenter Anästhetikums, die auch beeinflussen können die Forscherin. Entsprechende Vakuum-Systeme sollte be in Ort bei sicherzustellen, dass Überschuß Gasen aus des Bereichs werden entfernt wird.
3. Drehen Sie sowohl auf dem Sauerstoff Tank-und den Stickstoff-tanks und passen Sie Flow. Der Stickstoff sollte bei rund 1,0 L / min sein, während das Sauerstoff bei rund 0,2 L / min (~ 21%) sein sollte.
4. Drehen Sie auf dem (in-house) Vakuum. Das Vakuum sollte etwa 1,2 L / min betragen.
5. Bestätigen, dass das Anästhesie Zeile zur Induktionskammer offen ist, und die Leitungen zu der Chirurgie Gegend und das Mikroskop sind geschlossen.
6. Bestätigen Sie, dass die Latex-Atmung bag befestigt auf die Anästhesie-System aufgeblasen wird. Wenn der Beutel nicht aufblasen bedeutet, ersetzen Sie es.
7. Überprüfen Sie den Gummimembran auf jeder der wekzeugspritze cones Liefern Anästhesie an das Mikroskop Stufe und dem chirurgischen Plattform. Wenn der Gummi, um dünne beginnend wird, ersetzen Sie es.

7. Vorbereitung of Surgical Tools and Surgical Platform

1. Drehen Sie an einem heißen bead Sterilisators und lassen Sie es zu erreichen> 200 ° C.
2. Waschen Sie die chirurgische Werkzeuge mit Wasser und Seife(Einer Pinzette [vorzugsweise mit Zähnen] und Schere zum Durchtrennen der Haut des Tieres, einer Zange [vorzugsweise gezahnt] und Scheren für weitere Exposition des Tumors).
3. Sterilisieren Sie die chirurgischen Werkzeugen für mindestens 30 sec Daten durch die Hot bead Sterilisators (alternativ können die chirurgischen Werkzeugen können im Voraus autoklaviert werden).
4. Lassen Sie die chirurgischen Instrumente abzukühlen gleichzeitig dafür zu vermeiden Kontamination der sterilisierten Instrumente.
5. Sammeln Sie die Deckel, um einem Styropor-Versandkosten cooler. Dies wird Ihre chirurgische Plattform sein.
6. Platzieren Sie ein Stück von einem lab soaker auf der Oberseite des Styrofoam Deckel (genug, um es zu bedecken).
7. Affix eine Nase cone mit einer Linie auf die Anästhesie System an das lab soaker mit Labor-tape (1 "tape funktioniert am besten, hier). Legen Sie eine 18 G x1 ½" Nadel durch die Band in das Styrofoam Deckel auf entweder Seite der Nase cone zu halten die Nase cone an Ort und Stelle gesichert.
8. Setzen Sie beiseite betadine, sterile Gaze, zwei 70% igem Isopropanol wipes, ein MikroskopRutsche, Krazy Glue und 4 Stück von Labor-Band (½ "breit).

8. Vorbereitung der Microscope

1. Drehen Sie auf dem Mikroskop, der Kamera, und dem Computer ausgeführt Sie das Mikroskop.
2. Drehen Sie auf dem Heiz-blanket.
3. Wenn ein invertiertes Mikroskop ist verwendet werden soll, sollte eine benutzerdefinierte-made Bühne Insert mit Bildgebung-Ports entsprechend dem Ort der Leistendrüsen Milchdrüsen ausgelegt sein. Reinigen Sie die Bühne gut einzufügen mit Wasser und Seife und trocken sein. Verwenden Sie lab tape (½ "funktioniert am besten,), um cover Glas (# 1.5 Dicke) im Laufe der imaging-Ports zu sichern und reinigen Sie die gesamte Oberfläche mit 70% igem Isopropanol. Bedecken Sie den der Bühne mit steriler Gaze, um gegen Kontamination zu schützen. Platzieren Sie den der Bühne insert in der Bühne und lassen Sie es, um trockene lüften.
4. Reißen 4-6 Stücke von lab Band (1 "breit), befestigen etwa 6 cm in der Länge und sie an der Seite des Mikroskops. Diese Klebestreifen verwendet wird, um den Nasenkonus Liefern Anästhesie an das Tier zu positionieren eined befestigen Sie es an Ort und Stelle.
5. Reißen zwei mehr Stücke von tape (½ Zoll Breite), die über einen Zoll in der Länge sind. Diese werden verwendet,, um die Butterfly-Nadel Bereitstellung von PBS, um der Maus und dem Mikroskop-Objektträger verwendet werden, um den Tumor an Ort und Stelle freizulegen zu halten werden.

9. Offenlegen von die Inguinal Mammary Gland for Imaging

1. Anästhesieren das Tier in einem Induktionsofen Kammer unter Verwendung 4% Isofluran mit 21% Sauerstoff und Balance Stickstoff (Strömungsrate bei etwa 1,0 L / min) als den Trägergas. Dies sollte zu nehmen 2-4 min.
2. Übertragen Sie die Maus, um der chirurgischen-Plattform, sobald es tief und langsam ist die Atmung, mit dem ventral zugewandten Oberfläche up. Öffnen Sie die Anästhesie-Zeile zu der chirurgischen-Plattform und schließen Sie dann das Anästhesie-Zeile zu der Induktion Kammer, in dieser Reihenfolge auf einen zu hohen Druck in der Narkose System zu vermeiden. Reduzieren Sie die Konzentration von Isofluran von 4% auf 2,5% zu diesem Zeitpunkt.
3. Überprüfen Sie die pedal withdrawal reflex, um zu bestätigen, dass das Tier genug ist, anesthetized für das chirurgische Verfahren durch Durchführen einer footpad Prise. Das Tier ist adäquat anästhesierten, wenn es nicht nicht reagiert (z. B. twitch oder curl seinem Schwanz) an den footpad Prise. Wird das Tier zu der footpad Prise zu reagieren wird, erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran.
4. Sichern Sie die Glieder des Maus, um der chirurgischen-Plattform mit Labor-tape (½ "tape funktioniert am besten für this).
5. (Optional) Sobald das Tier zu einem chirurgischen Plattform gesichert ist, kann Haar von der ventrale Oberfläche unter Verwendung eines elektronischen Akkurasierer entfernt werden. Wenn chemische-Haarentfernung ist bevorzugt,, sollte diese 24-48 hr vor dem chirurgischen Eingriff durchgeführt werden. Entfernen von Haaren vor dem chirurgischen Eingriff hilft um eine Kontaminierung des Abbildungsstelle zu verhindern, wie verirrte Haare strong und akute Immunantworten induzieren kann.
6. Desinfizieren Sie die ventral Oberfläche des Tier, das mit 70% igem Isopropanol Wischtücher und betadine.
7. Unter Verwendung des ersten Paar von sterilen Schere und Pinzette (mit Zähnen), machen Sie eine subkutane ventralen Mittellinie Inzisiondh läuft von ~ 3 mm oberhalb die Harnröhre zur Processus xiphoideus. Achten Sie darauf, zu vermeiden Punktieren oder Durchtrennen des Bauchfells.
8. Unter Verwendung des zweiten Paars von sterilen Schere und Zange (gezackt), sanft lösen die Haut, mit der Leistengegend Brustdrüse angebracht, aus der Peritonealhöhle.
9. Nehmen Sie ein Glas Mikroskop-Objektträger und positionieren Sie es gegen die Haut Klappe in der vorherigen Schritt generiert. Positionieren Sie den slide in solchen einer Weise dass der Großteil von dem Tumor wird sitzen flachen einmal sich die Maus auf der Bühne platziert wird, und es nimmt nicht mit der Mobilität von den Hinterflügeln Gliedmaßen interferieren.
10. Nachdem die Objektträger richtig positioniert ist, befestigen Sie die Folie an der äußeren Oberfläche der Haut mit Sekundenkleber (zB., Krazy Glue).

10. Positionieren Sie die Maus auf der Bühne

1. Entfernen Sie den Labor tape Sicherungselement die Gliedmaßen des Tieres zu dem chirurgischen Plattform.
2. Öffnen Sie die Anästhesie-Zeile zu dem Mikroskoptisch und schließen Sie die anesthesia-Zeile zur chirurgischen Plattform, in dieser Reihenfolge.
3. Quickly überweisen Sie den Tier zu dem Mikroskop Bühne.
4. Sobald das Tier hat worden sind, Position überführt und sichern Sie das Anästhesie-Linie und Nase cone richtig ein (Verwendung von z. B. lab tape), um sicherzustellen,, dass die Maus anästhesierten bleibt und ist in einer bequemen Position.
5. Freizulegen den Tumor so daß es auf Spitze und im Zentrum von einem der Hüllenteile glas-covered Bildgebung Ports in dem Mikroskoptisch positioniert ist.
6. Verwenden von den Okularen, überprüfen Sie, dass der Tumor korrekt positioniert ist, und sanft Bandteil nach unten weist dem Mikroskop-Objektträger. Der Objektträger sollte locker gesichert werden, so Blutfluss an das Gewebe nicht verbaut wird. Taping nach unten Sie das Mikroskop slide trägt dazu bei, imaging Artefakte, die durch des Tieres die Atmung eingeführt, zu minimieren.
7. Legen Sie die innewohnenden intraperitoneal Einklang mit geflügelten Infusionsset zu einer 1-ml-Spritze mit sterilem 1x PBS oder Kochsalzlösung (optional mit einem Farbstoff wie PI) unter # 5 hergestellt angebracht. Inject das Tier mit 100 ul, wenn die ip. Linie wird eingefügt. Von dieser Zeit Punkt, bis dem Ende des Bildgebungssitzung beginnen, injizieren Sie die Tieres mit 50 &mgr; l von Kochsalzlösung bei 1 hr Intervallen (oder 25 &mgr; l von Kochsalzlösung mit PI alle 30 Min.).
8. Um das Tier Vitalfunktionen überwachen, fügen Sie einen Oximetermeßfühler (zB MouseOx System Starr Life Sciences, Inc.) ^19.
9. Bedecken Sie den Maus mit einem Heiz-Decke, um Hypothermie zu verhindern.

11. Acquisition of Images

Die offene-Source-Software μManager (Vale Lab, UCSF) wird verwendet, um time-lapse Bildern zu erwerben. Die Rohdaten werden in Imaris (Bitplane) Software kompiliert und kann manuell von unabhängigen Beobachtern erzielt werden, oder analysiert entweder Imaris oder andere Software zur Bildanalyse (zB Volocity [PerkinElmer] oder ImageJ [NIH]).

12. Euthanasia

Am Ende des das Bild,-Sitzung (1-40 hr., abhängig vom Typ von Prozess analysiert), wird das Tier euthanasiert.

1. Die Konzentration von Isofluoran wird auf 4% erhöht.
2. Das Tier wird, bis 30 sec beobachtet nachdem es Atmung umfassend nutzt und dann aus dem Stufe entfernt.
3. Zervikale Dislokation wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass, das Tier wurde euthanasiert.

13. Repräsentative Ergebnisse

Intravitalen Bildgebung mit diesen Methode ermöglicht für die direkte Visualisierung von versch. Prozesse, einschließlich Drug-Delivery-zu Tumoren, Extravasation und Verteilung des Arzneimittels, sobald es den Tumor, Zelltod nach therapeutischen Behandlung, und Tumor-Stroma-Interaktionen in Reaktion auf Zelltod ⁵ erreicht. Um die Ankunft der einer Droge an das Tumor und seiner Verteilung im Anschluss Extravasation in Tumorgeweben beobachten,, wird das Tier eingespritzt, während Bilder werden erworbenen wobei. Obwohl mehrere Klassen von chemotherapeutics sind schwach fluoreszierende (z. B. Doxorubicin), sind viele nicht. Fluoreszent konjugierten Dextrane kann als Surrogat-Marker für Drug-Delivery-und Diffusion in Geweben verwendet werden. Abbildung 2 und Movie 1 zeigen, die Ankunft eines Fluorescein--Isothiocyanat (FITC)-konju-gierte 2 MD Dextran (Invitrogen, 1 mg / ml 1xPBS) injiziert iv. in einen Tumor eines MMTV-PYMT; ACTB-ECFP Maus.

Im Anschluss an der Ankunft von der Droge in den Tumor, können Extravasation und Diffusion durch den Geweben abzubildenden, um sowohl die intravaskulären Halbwertszeit von einem Arzneistoff und der Verteilung des Arzneimittels ^{5 zu} bestimmen werden. Film 2 zeigt die Extravasation und Verteilung von Alexa Fluor-647-konjugierten 10 kD Dextran (Invitrogen, 1 mg / ml in 1 x PBS) injiziert iv. in eine C3 (1)-Tag-; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Maus während Bildgebung. Nach der Kompilierung der Zeit-lapse movies in Imaris (Bitplane), wird intravaskuläre ein Halb-Leben und der Verteilung des Arzneimittels quantifiziert. Um intravaskuläre ein halb-life zu messen, Wird die Durchschnittsbewertung Fluoreszenzintensität in Tumor Blutgefäße an jedem Zeitpunkt berechnet und geplottet gegen die Zeit. Drug Verteilung wird als einem Prozentzeichen Fläche pro insgesamt Tumor-Gebiet, das positive für die Droge ist quantifiziert.

Zusätzlich zu Tracking-die Kinetik der Drug-Delivery-zu Tumoren, ist es häufig wichtig zu bestimmen, how Tumoren werden auf die Therapie reagiert. Als anti-Krebstherapien erwartet, dass sie Zelltod zu induzieren, können Propidiumiodid (PI)-Färbung oder strukturelle nuklearen Veränderungen als Marker der Arzneimittel-induzierter Zelltod ⁵ verwendet werden. Abbildung 3 zeigt das Ansprechen des Tumors gegenüber dem zytotoxischen chemotherapeutischen Doxorubicin in einer MMTV -PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Maus. In diesem dreifach transgene MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Tier, ECFP Etiketten Brustkrebszellen (blau) und EGFP Etiketten myeloischen Zellen (grün). Das Tier während dieser Sitzung abgebildet wurde Doxorubicin 18 hr verabreicht, bevor imaging begann und PI wurde ip im gesamten t gelieferter Imaging-Sitzung wie oben beschrieben. Cancer-Zellen (ACTB-ECFP Etikettierung) erscheinen als blau, und toten oder sterbenden Zellen erscheinen als rote (PI Färbung). Die Zeitreihen hier präsentierten zeigt die Induktion von Doxorubicin-abhängige Zelltod Laufe der Zeit. , Um die Induktion von Zelltod in Tumoren quantifizieren, wird der gleiche Typ von Analysemethoden für die Bestimmung der Verteilung des Arzneimittels verwendet verwendet, denen eine Mengenangabe-Ausgang Prozent Fläche pro insgesamt Tumorbereich, die positiv für PI soll ist.

Imaging bei hoher Vergrößerung können liefern Informationen in Bezug auf die Art von Zelle den Tod, dass Krebs Zellen ⁵ zu unterziehen. Film 3 zeigt die Ergebnisse eines bildgebenden Experiment zur nuklearen Änderungen typischen apoptotischen Zelltod in Reaktion auf systemische Therapie mit Doxorubicin verfolgen. Ein Um Nuklei visualisieren, zu das Tier während dieser Sitzung abzubildenden Sie den ACTB-H2B-EGFP Reporter-anstelle des c-fms-EGFP Reporter-birgt, so die Kerne von Krebszellen in green sind beschriftet. Diese MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP Tier war administered Doxorubicin (8 mg / kg in 1 x PBS) ip 24 h vor dem Beginn des Films und erhielt stündlich Injektionen von 1 x PBS mit PI (Invitrogen, 1 mg / ml Lösung verdünnt 1:15). Strukturellen Veränderungen in den Kernen von Krebs Zellen können in einem apoptotischen cell nächste zu Zellen, die Nekrose (PI-positiven Zellen, das nur minimale Veränderungen in Kernmorphologie anzuzeigen) unterzogen worden sein beobachtet werden. Nuklei von apoptotischen Zellen schließlich wird rot aufgrund zu der Aufnahmelösung von PI Färbung (nicht gezeigt). Die Anzahl von nekrotischem und apoptotische Ereignissen wird manuell für jedes Mal Punkt auf PI-Positivität und Kernmorphologie basierend quantifiziert.

Chemotherapy-induzierte-Krebs Zelltod führt häufig zu in einem reaktiven Rekrutierung von Immunzellen in Tumore ^2,4,5. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel für diese stromal Reaktion auf akute Behandlung mit Doxorubicin. Der MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP tierischen abzubildenden Sie hier, wurde verabreicht Doxorubicin (8 mg / kg in 1 x PBS) ip . ungefähr 20 Stunden vor dem Beginn of imaging, und empfangenen stundensatz PI Injektionszwecke ip. für die Dauer der dem Experiment zum Zelltod zu visualisieren. Die angegebenen Zeiten repräsentieren die Anzahl der Stunden nach Doxorubicin Behandlung, und die Skala Balken repräsentiert 100 &mgr; m. In diesem Experiment, myeloide Zellen in Bereiche von Zelltod infiltrieren, wie angedeutet durch die weißen Pfeilen. Ein Um myeloischen Zellinfiltration in Tumore im Anschluss Doxorubicin Verabreichung, der gleiche Typ von Analysemethoden für die Bestimmung der Verteilung des Arzneimittels und Tumor Ansprechen auf die Chemotherapie wird verwendet,, denen eine Mengenangabe Ausgang ist Prozent Fläche pro insgesamt Tumorbereich, die positiv für EGFP ist verwendet quantifizieren.

In Zusätzlich zu Visualisierung von der Gesamtdarstellung stromal Ansprechen auf die Chemotherapie, können spezialisierte stromal Antworten auch visualisiert werden ^5. Movie 4 zeigt die Phagozytose von necrotic cell Material, das durch einer benachbarten Zelle. Die rote nuklearen Material kann gesehen wobei durch eine Zelle mit einem larg verschluckt werdene intakte grünen Zellkern,, die typisch von Makrophagen ist. Der MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; ACTB-H2B-EGFP Tier während dieser Session abgebildet verabreicht wurde Doxorubicin (8 mg / kg in 1 x PBS) ip. 24 hr vor dem Beginn des Movies an. Das Tier erhielt stündlich Injektionen von 1 x PBS enthaltenden PI (Invitrogen, 1 mg / ml Lösung verdünnt 1:15). Nuclei (ACTB-EGFP Etikettierung) erscheinen als grün, aber drehen Sie rot wie die Zelle-Nekrose-zu unterziehen.

Abbildung 1. Probe Kennzeichnung von verschiedenen Tumor-Komponenten unter Verwendung von transgenen-und injizierbare Etiketten Dies ist eine triple-transgenen MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Tieres, bei dem Krebszellen in blau durch die Expression des ECFP und myeloiden Zellen werden beschriftet sind in etikettierten Grün über Expression von EGFP aus einer myeloischen-spezifischer Promotor. Das Tier wurde mit Propidiumiodid injiziert (PI, rot, ~ 0.07 mg / ml in 1x PBS) währenddas abbildende Sitzung zu visualisieren Zelltod. PI Etiketten DNA aber nur überquert die Zellmembranen der toten oder sterbenden Zellen. Scale-bar = 100 &mgr; m.

Abbildung 2. Drug Extravasation und Verteilung in Tumoren Diese doppelte-transgenen MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP Tieres, bei dem Krebszellen in blau durch Expression von ECFP sind beschriftet wurde mit FITC-konjugiertem 2 MD Dextran (grün) während des Abbildungsverfahrens-Sitzung injiziert, um visualisieren, wie Drogen erreichen Tumoren nach iv Injektion (blau). Zeit nach der Bebilderung initiiert wurde angezeigt. Scale-bar = 100 &mgr; m.

Abbildung 3. Cancer Zell-Antwort auf systemische Therapie. Ein MMTV-PYMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Tier mit dem chemotherapeutischen behandelt werdenDoxorubicin vor der Bebilderung und mit PI injiziert (rot, ~ 0,07 mg / ml in 1x PBS) zu etikettieren Zelltod. Für dieses Bild ist Serie zeigt die Akkumulation von PI-Färbung im Laufe der Zeit (so durch weiße Pfeile angedeutet), als Vertreter der Induktion des Zelltods folgenden Doxorubicin Behandlung. Zeit angedeutet ist an der Zeit nach Doxorubicin Behandlung. Bilder sind f maximalen Intensität Vorsprünge von einem z-Stapels enthaltend drei Bilder in der z-Achse. Scale-bar = 100 &mgr; m.

Abbildung 4. Myeloischen Zellen Ansprechen auf die Chemotherapie in einem MMTV-PYMT; ACTB-ECFP;. C-fms-EGFP dreifach transgene Maus verabreicht Doxorubicin 20 Stunden vor der Bildgebung Das Tier erhielt hourly ip. Injektionen von PI (rot, ~ 0.07 mg / ml in 1x PBS) um tote Zellen etikettieren. Dieses Bild Serie zeigt die Akkumulation von EGFP-positive myeloischen Zellen (wie durch weiße Pfeile angedeutet) über die Zeit folgenden doxorubicin Behandlung. Diese reaktive Immunantwort wurde gezeigt, therapeutische Reaktion auf mehrere Klassen von Chemotherapien ^4,5 behindern. Zeit angedeutet ist an der Zeit nach Doxorubicin Behandlung. Bilder sind f maximalen Intensität Vorsprünge von einem z-Stapels enthaltend drei Bilder in der z-Achse. Scale-bar = 100 &mgr; m.

Movie 1. . Drug-Delivery-in einen Tumor Dies ist ein doppeltwirkender-transgenen MMTV-PYMT; ACTB-ECFP Tieres, bei dem Krebszellen in blau durch Expression von ECFP sind beschriftet. Das Tier wurde mit einem 2 MD FITC-konjugiertem Dextran (grün) während der Bildgebungssitzung injiziert zu visualisieren, wie Medikamente Tumoren erreichen nach intravenöser Injektion. Scale-bar = 100 &mgr; m. Klicken Sie auf Sie hier, um Film anzusehen .

Movie 2. Drug Infiltration in das Tumorgewebe A triple transgenen C3 (1)-Tag;. ACTB-ECFP; c-fms-EGFP Tieres, bei dem Krebszellen sind laBeled in blau durch die Expression des ECFP und myeloide Zellen in grün durch die Expression des EGFP markiert war, iv mit einem Alexa Fluor 647-konjugierten 10 kD Dextran (rot) injiziert. Das Feld der Ansicht wird sofort nach der Injektion mit Dextran gezeigt. Das Dextran anfänglich markiert der Vaskulatur, rapide Extravasate in den Tumor Gewebe, und wird schließlich up durch Makrophagen taken. Scale-bar = 100 &mgr; m. Klicken Sie auf Sie hier, um Film anzusehen .

Movie 3. Bildgebung von nuklearen Umbuchungen, die nach Chemotherapie-induzierter Zelltod Diese dreifache transgenen MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP Tier wurde mit Doxorubicin vor der Bebilderung injiziert. Kernmorphologie (grün), geändert durch Expression eines H2B-EGFP Fusionsprotein nachverfolgt, erlaubt zum direkten Visualisierung von Chemotherapie-induzierter nuklearen strukturellen Veränderungen typischen von Apoptose wie für den Zelle in der Oben rechts auf Eckstoß aus gesehen. Das Tier receIved ein Halb-hourly ip. Injektionen von PI (rot) für die Dauer der bildgebenden Sitzung zu toten und sterbenden Zellen zu markieren. Zeit angedeutet ist an der Zeit nach Doxorubicin Behandlung 24 hr. Bilder wurden erworbenen unter Verwendung eines hoher Vergrößerung Objektivlinse (40x, NA 1,1, Wasser Linse). Scale-bar = 15 &mgr; m. Klicken Sie auf Sie hier, um Film anzusehen .

Movie 4. Bildgebung von nuklearen Veränderungen und Aufnahme von tote Zelle Materials nach dem Chemotherapie-induzierter Zelltod Diese dreifache transgenen MMTV-PYMT;. ACTB-ECFP; H2B-EGFP Tier wurde mit Doxorubicin vor der Bebilderung injiziert. Kernmorphologie (grün), geändert durch Expression eines H2B-EGFP Fusionsprotein nachverfolgt, erlaubt zum direkten Visualisierung von Chemotherapie-induzierter nuklearen struktureller Veränderungen. Das Tier erhielt die Hälfte-hourly ip. Injektionen von PI (rot) für die Dauer der bildgebenden Sitzung zu toten und sterbenden Zellen zu markieren. Images erworben wurdenmit Hilfe eines hoher Vergrößerung objektive Linse (40 x, ​​NA 1,1-, Wasser-Linse). Der Mangel an weitgehenden strukturellen Veränderungen vor dem Markieren mit PI und der Änderung in der nuklearen Morphologie und Verlust von GFP-Signal indikativ ist von Nekrose-like Zelltod. Die Toten Material wird gesehen wobei up durch eine Zelle mit einem grossen Kern, was typisch von Makrophagen ist taken. Zeit angedeutet ist an der Zeit nach Doxorubicin Behandlung 24 hr. Scale-bar = 10 &mgr; m. Klicken Sie auf Sie hier, um Film anzusehen .

Diskussion

Die Antworten von Tumoren auf systemische Therapien in vivo kann drastisch unterscheiden, die von Krebszellen in vitro, wie der Mikroumgebung sowohl die akute Reaktion und Rückfall ⁵ beeinflusst. Eines der größten Hindernisse für die Explikation in vivo Chemoresistenz Wege ist die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung. Insbesondere weil festen Tumoren ein Gleichgewicht zwischen Krebs und Stromazellen, Störungen der einen Komponente, z. B. dem Zelltod, die während Antikrebsbehandlung auftritt entwickelt werden, können in der drastischen Auswirkungen auf Gewebeorganisation führen.

Die intravitalen Bildgebungstechnik hier bereitgestellten ermöglicht die direkte Visualisierung Krebszelle-Stroma Wechselwirkungen innerhalb der Tumoren von lebenden, narkotisierten Mäusen während der Behandlung mit Anti-Krebs-Arzneimittel. Wir verwenden Schleuderscheibe konfokale Mikroskopie, die eine relative begrenzte Eindringtiefe hat (siehe ¹⁷ ), aber unsere chirurgischen und Markierungstechniken kann mit anderen Arten von Mikroskopie verwendet werden. Filme aus diesen Versuchen erfasst kann verwendet werden, um Prozesse, die Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (zB durch Infiltration eines markierten Population oder Induktion von Zelltod), Zellmotilität, Verteilung von injizierbaren (zB um Extravasation zu verfolgen), und Co-beinhalten verfolgen Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen ^5,12,17,20.

Wir routinemäßig Bild Mäuse für über 6 Stunden und auch durchgeführt Bildgebung für über 18 Stunden. Dies erfordert die Aufrechterhaltung der Mäuse kontinuierlich unter Narkose für diese lange Zeiträume. Mit der richtigen Anästhesie, überleben mehr als 90% unserer Tiere 6 Stunden und etwa 80% mehr als 18 Stunden überleben. Einzelheiten zur langfristigen Betäubung wurden bisher ¹⁹ veröffentlicht. In unserer Erfahrung sind fünf Faktoren entscheidend: die Vermeidung Hypothermie vermeiden Dehydrierung, die Aufrechterhaltung physiologischer Sauerstoffsättigung des Blutes Ebenen, usingen befeuchtet Trägergas für Isofluran und Haltung der Tiere auf der untersten Ebene der Anästhesie, an dem sie nicht zeigen Anzeichen von Schmerzen. Auf Körpertemperatur zu halten, sollten wir Mäuse unter einer Heizdecke (bei 38 ° C). Um Austrocknung zu vermeiden, spritzen wir kleine Mengen von Kochsalzlösung ip während der gesamten bildgebenden Verfahren. Um physiologische Blutsauerstoffsättigung Niveau zu halten, beginnen wir mit 21% Sauerstoff im Trägergas (anstelle der üblichen 100%). Dies ermöglicht uns, eingeatmete Sauerstoff Ebenen, wenn eine Maus zu erhöhen - Stunden in einem Experiment - zeigt eine Abnahme in die Sauerstoffsättigung des Blutes. In unserer Erfahrung, die Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoff zu diesem Zeitpunkt (z. B. 30-40%) fast immer stabilisieren wird das Tier unter Berücksichtigung Stunden zusätzliche Bildgebung. Die optimale Höhe der Anästhesie ist für die meisten Mäuse mit 1-1,5% Isofluran und Ergebnisse im Atem Raten 60-65/min und Impulsraten von 400-450/min erreicht. In unserer Imaging-Experimente, wir verwenden in erster Linie transgenen Mausmodells (MMTV-PYMT und C3 [1]-Tag), in der Tumore sind multifokalen, so dass zum Abbilden mehrerer Läsionen in verschiedenen Stadien der Tumorprogression, die parallel in mehreren x, y-Positionen während einer einzigen Bildgebungssitzung. Dies verringert Bedenken hinsichtlich Maus zu Maus Variation bezüglich Experimente bei Identifizieren Stufe-abhängige therapeutische Reaktionen abzielen, und reduziert die Anzahl von Tieren zum Abbilden erforderlich.

Die MMTV-PYMT Modell (und andere spontane Krebsentstehung Modelle) gehen durch progressive histopathologischen Stadien, die während intravital Bildgebung erkannt werden kann, obwohl die pathologische Staging des Tumors Läsionen, die während intravital Bildgebung durchgeführt werden kann, ist anders und weniger detailliert, als die histologischen Schnitten ^5,17. Im Gegensatz dazu tendieren Transplantationsmodellen bis späten Stadium Tumoren am besten widerspiegeln, wie die Krebszellen meist aus fortgeschrittenen Tumoren isoliert werden. Solche Modelle eignen sie sich zum Studium Tumor-StromaWechselwirkungen der späten Stadium Tumoren als Unterschiede in diesen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stadien.

Wir zeigen Beispiele, wie man Bild nuklearen strukturellen Veränderungen, die nach der Zelltod durch Therapie induziert auftreten. In Abwesenheit von Anti-Krebs-Behandlung, das Markierungsstrategie vielmehr zu einer Bild Zellteilung in situ verwendet werden, aufzuklären, zum Beispiel, wie Zellproliferation und Keimruhe durch die Mikroumgebung beeinflusst. In der Zukunft kann Fluoreszenzmarkierung mitochondrialen Komponenten ermöglichen, um Bild mitochondrialen Veränderungen, die während Apoptose auftreten.

Bei diesem Protokoll, haben wir auch Beispiele zum Bild Krebszelle-Immunzelle Wechselwirkungen nach der Therapie, aber andere Mikroumgebungsbedingungen Komponenten können auch visualisiert und bebilderten gezeigt. Bestehende transgenen Reporter Linien für stromalen Komponenten umfassen solche für Fibroblasten (zB., FSP1-EGFP ^17, αSMA-RFP ^21, COL1A1-EGFP ²¹⁾ oder Zellen des Gefäßsystems (zB Tie2-GFP ^22; VEGF-GFP ^23).

Intravital Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Interaktionen und Prozesse, die in vivo nach Verabreichung der Chemotherapie auftreten. Mit der Technologie, die derzeit verfügbar sind, haben wir große Fortschritte im Verständnis, wie myeloischen Zellen beeinflussen therapeutische Reaktion gemacht, aber weil der Tumor-Mikroumgebung ist so komplex, große Fortschritte sind erforderlich, um beginnen zu mechanistisch tief in die zugrunde liegenden Prozesse umwelt-vermittelten Resistenz. Einer der wichtigsten Fortschritte noch erforderlich ist die Identifizierung besser Marker für spezifische Zellpopulationen. Die Bedeutung einer besseren Marker ist mit zwei der herausragenden Stromazellen Komponenten des Brusttumor Mikroumgebung, Fibroblasten und Immunzellen veranschaulicht. α-smooth muscle actin (αSMA) wird häufig verwendet, um zu identifizierenFibroblasten, aber das Protein auch von vaskulären glatten Muskelzellen und Myoepithelzellen ²⁴ exprimiert. So, obwohl αSMA-GFP-Reporter Mäusen vorhanden sind, die Bestimmung der spezifischen Zelltyp ist folgende während einer intravital Imaging-Experiment ist eine Herausforderung. Ebenso wird ein einzelner fluoreszierender Marker, wie zB EGFP unter der c-fms-Promotors exprimiert kennzeichnen häufig mehrere Subpopulationen von Immunzellen ^12,17. Obwohl also ein idealer möchten eine einzelne Markierung zu verwenden, um einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren die Komplexität der zugrunde liegenden Biologie eine große Herausforderung bei der Verwendung dieses Ansatzes.

Eine Teillösung für dieses Problem ist die injizierbare Etiketten verwenden, um weiter zu differenzieren Subpopulationen von Zellen, die den gleichen fluoreszierenden Reporter. Beispielsweise werden fluoreszierende Dextrane von Makrophagen aufgenommen und können die Makrophagen Subpopulationen, die durch die c-fms-EGFP und FSP1-EGFP transgenen Reportermäuse markiert sind zu markieren ^{17. Antikörper, konjugiert an fluoreszierenden Sonden wurden ebenfalls verwendet, um spezifische Subpopulationen (zB die Gr1-positiven Population von myeloiden Zellen durch die c-fms-EGFP-Reporter 17 beschriftet) identifizieren.}

Anders als Tumor-Antwort-Kurven durch Dickenmessung, die wenig mechanistische Informationen oder warum Tumore reagieren auf das verabreichte therapeutische oder histologische Reihe von Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten, die große Kohorten Tiere benötigen geerntet wurden bereitzustellen erzeugt, stellt unsere Technik direkte, quantifizierbare Daten auf der Dynamik des Zelltods und auf die Wechselwirkungen von Stromazellen mit Krebszellen in kleinen Kohorten. Damit ist der Vorteil der Verwendung des Verfahrens hier berichtet, dass sie dynamische Informationen Medikament Reaktionen liefert im Kontext eines intakten Tumormikroumgebung in Echtzeit. Solche Informationen können wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Prozesse, die therapeutische Reaktionen fahren ⁵ führen ^</ Sup>.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Reagens
MMTV-PYMT Mäusen	Jackson Laboratory	2374
C3 (1)-Tag Mäusen	Jackson Laboratory	13591
ACTB-ECFP Mäusen	Jackson Laboratory	3773
ACTB-H2B-EGFP Mäusen	Jackson Laboratory	5418
1 x PBS	Made in-house
2 MD Dextran, Fluorescein-konjugierte	Invitrogen	D-7137	Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS
10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-konjugierten	Invitrogen	D-22914	Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS
Doxorubicin-Hydrochlorid	Sigma-Aldrich	44583	Rekonstituieren in dH 2 O und bei 4 ° C, in 1 x PBS verdünnen
Isothesia (Isofluran)	Butler Animal Health Versorgung	029450	250 ml
Propidiumiodid	Invitrogen	P3566	1 mg / ml; verdünnter 1:15 in 1 x PBS
Stickstoff
Sauerstoff
			Ausrüstung
18G x 1 ½ "regelmäßigen Kegel Nadel	BD	305196
μManager	Vale Lab, UCSF	www.micro-manager.org	Open-Source-Software
Alkoholtupfer	BD	326895	70% igem Alkohol-Tupfer
Anästhesie-System	Molecular Imaging Products, Co.
Deckglas	Corning	2940-245	Nr. 1 ½, 24x50 mm; desinfizieren mit 70% Isopropanol Wischtücher
Curity Gaze Schwämme (steril)	Kendall	6939
Glasobjektträger	Corning	2948-75x25	Vorgereinigt, wenn nicht vorgereinigt, mit 70% Isopropanol Tücher desinfizieren
Gehärtete feinen Schere	Fine Science Tools	14090-11	2 Paar, Edelstahl, scharf-spitz, gerade Spitze, 26 mm Schneide, 11 cm Länge
Heizdecke	Gaymar Industries
Hot bead Sterilisator	Fine Science Tools	18000-45	Schalten etwa 30 min vor der Benutzung; sterilisieren Werkzeuge bei> 200 ° C für 30 Sek.
Imaris	Bitplane	www.bitplane.com
Krazy Glue	Elmer-Produkte	KG484
Labor Band (½ ")
Labor Band (1 ")
Deckela Styropor Versand kühler			Dies wird als das chirurgische Plattform verwendet werden
Micro Dissektionszange	Roboz	RS-5153	1x2 Zähne, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke, 4 "Länge
Micro Dissektionszange	Roboz	RS-5135	Serrated, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke; 4 "Länge
Mikroskop			Spinning-Disk-konfokalen XYZ Piezo Bühne, epifluourescence capablility 17,25
Mikroskoptisch Einsatz	Applied Scientific Instrumentation		Benutzerdefinierte hergestellt, mit zwei runden Imaging-Ports
MouseOx Oximeter, Software und Sensoren	STARR Life Sciences	www.starrlifesciences.com
Nalgene Super-Versi-Dry Lab Soakers	Thermo Scientific	74218-00	Cut in Vierteln zum Auskleiden chirurgische Plattform
Nebulizer	Salter Labs	8901	Verwendet werden, um Gase zu befeuchten; beugt Irritationen des Lungengewebes
Slip-Spitze Einweg Tuberkulinspritze (1 ml)	BD	309659
Surflo geflügelten Infusionsset	Terumo	SV-23BLK	23G x ¾ "ultra dünnen Nadel, 12" Schlauch
Betadine Spray	Purdue Pharma	BASP3H