Kryoschneiden Hefe Gemeinschaften für die Prüfung Fluoreszenzmuster

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll zum Einfrieren und Kryoschneiden Hefe Gemeinden internen Muster der fluoreszierenden Zellen zu beobachten. Die Methode beruht auf Methanol-Fixierung und OCT-Einbettung, um die räumliche Verteilung der Zellen ohne Inaktivierung fluoreszierende Proteine ​​innerhalb einer Gemeinschaft bewahren.

Zusammenfassung

Mikroben leben typischerweise in den Gemeinden. Die räumliche Organisation von Zellen innerhalb einer Gemeinschaft wird angenommen, dass das Überleben und die Funktion der Reisenden ¹ auswirken. Optische Schnitte Techniken, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, haben sich bewährt zur Beobachtung räumlichen Organisation von Bakterien und Archaeen Gemeinden ^2,3. Eine Kombination von konfokale Bildgebung und physikalische Schnitte von Hefe-Kolonien hat interne Organisation von Zellen ⁴ enthüllt. Allerdings hat direkte optische Schnitte mittels konfokaler oder Zwei-Photonen-Mikroskopie war nur in der Lage, ein paar Zellschichten tief in Hefe-Kolonien zu erreichen. Diese Einschränkung ist aufgrund der starken Streuung des Lichts aus Hefezellen ⁴ wahrscheinlich.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Festsetzung und Kryoschneiden die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen in Saccharomyces cerevisiae Gemeinden zu basieren. Wir verwenden Methanol als Fixiermittelum die räumliche Verteilung der Zellen zu erhalten. Feste Gemeinden sind mit OCT-Verbindung, gefroren und kryogeschnitten in einem Kryostaten infiltriert. Fluoreszenz-Bildgebung der Abschnitte zeigt die interne Organisation der fluoreszierenden Zellen innerhalb der Gemeinschaft.

Beispiele von Hefe Communities bestehend aus Stämmen exprimierenden rot und grün fluoreszierende Proteine ​​zeigen die Potentiale des Kryoschneiden Methode, um die räumliche Verteilung der fluoreszierenden Zellen sowie die der Genexpression innerhalb Hefekolonien ^2,3 offenbaren. Obwohl unsere Fokussierung auf Saccharomyces cerevisiae Gemeinden gewesen ist, kann das gleiche Verfahren angewandt potentiell zu anderen mikrobiellen untersuchen.

Protokoll

Ein. Befestigung Hefe Gemeinschaften

1. Wachsen Hefe Gemeinden auf einem Membranfilter (zB Millipore MF Membranfilter; 2A). Dieses Protokoll entspricht einer typischen Gemeinschaft von weniger als 2x10 ⁸ Zellen auf einer 6 mm-Durchmesser-Membranfilter.
2. Mit einem Stück Whatman 541 Filterpapier, um den Boden eines 1 cm Durchmesser und (2B) abzudecken. Diese Whatman Papier als Träger, um die Gemeinschaft in späteren Stadien übertragen werden. 1 ml 100% Methanol zum Brunnen, und lassen Sie das auch in -20 ° C für die Temperatur ins Gleichgewicht.
3. Legen flüssigem N ₂ in einem Dewa....

Ergebnisse

Fluoreszenzbilder von vertikalen Querschnitten von Hefe Communities enthaltenden roten und grün-tagged wettbewerbsfähigen Populationen ⁶ sind in Abbildung 3 dargestellt. Diese Gemeinschaften bestehen aus zwei prototrophen Hefestämme und deren Wettbewerb für gemeinsam genutzte Ressourcen, einschließlich Raum, führt zu säulenartigen Strukturen ^7, wie in ihrer vertikalen Querschnitten dargestellt. Auflösungen bis hinunter zu einer einzigen Zelle kann in Querschnitten gelöst werden.

Diskussion

Das hier vorgestellte Verfahren bietet eine Möglichkeit, die innere Struktur des Hefe-Communities zu inspizieren. Das Methanol Fixierschritt macht die Hefekolonie starren ⁸ und bewahrt die Integrität der Kolonie, aber es verursacht auch Schrumpfung ^8, sollte bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt werden. Wir in der Regel sehen rund 30% Schrumpfung in Höhe von Hefe-Kolonien im Vergleich zu Kolonien direkt in OCT ohne Befestigungsmaterial ⁹ eingebettet.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
100% Methanol	JT Baker	9070-01
Tissue-Tek OCT Compound	Andwin Scientific	4583
Whatman Grade Nr. 541 Quantitative Filter Paper	Whatman	1541-047
Millipore-MF Membrane Filter	Millipore	HAWP04700
Kryostat	Leica	CM 1510 S