Isolierung und Analyse von Brain-sequestered Leukozyten aus Plasmodium berghei ANKA-infizierte Mäuse

Summary

Verfahren zur Isolierung von adhärenten entzündliche Leukozyten aus dem Gehirn Blutgefäße Plasmodium berghei ANKA-infizierten Mäusen beschrieben. Das Verfahren ermöglicht die Quantifizierung sowie phänotypischen Charakterisierung von isolierten Leukozyten nach Färbung mit fluoreszierenden Antikörpern und anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie.

Abstract

Wir beschreiben ein Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von adhärenten Entzündungszellen aus Gehirn Blutgefäße von P. berghei ANKA-infizierten Mäusen. Infektion von empfänglichen Maus-Stämme mit diesen Parasiten Dehnung ergibt sich bei der Induktion von experimenteller zerebrale Malaria, eine neurologische Syndrom daß rekapituliert bestimmte wichtige Aspekte des Plasmodium falciparum-vermittelte schwerer Malaria beim Menschen ^1,2. Reifen Formen von Blut-stufigen Malaria exprimieren parasitäre Proteine ​​auf der Oberfläche der infizierten Erythrozyten, wodurch sie an vaskulären Endothelzellen binden können. Dieser Prozess induziert Hindernisse in den Blutfluss, was zu Sauerstoffmangel und Blutungen ³ und stimuliert auch die Rekrutierung von Entzündungszellen Leukozyten an den Ort der Parasit Sequestrierung.

Im Gegensatz zu anderen Infektionen, also Viren neutrotopic ^4-6, beide Malaria-Parasiten befallenen Erythrozyten (PRBC) sowie zugehörigen InflammAtory Leukozyten bleiben abgesondert innerhalb von Blutgefäßen als Infiltration des Hirnparenchym. So eine Kontamination des einsamen Leukozyten mit nicht-entzündlichen zirkulierenden Zellen, umfangreiche intrakardiale Perfusion von infizierten-Mäuse vor Organentnahme und Gewebe Verarbeitung zu vermeiden wird in diesem Verfahren erforderlich, um die Blut-Kompartiment zu entfernen. Nach Perfusion, werden geerntet und seziert Gehirne in kleine Stücke. Das Tissue-Struktur wird weiter durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase D und DNAse I gestört Die resultierende Hirnhomogenisat wird dann auf einem Percoll-Gradienten, die Trennung von brain-sequestered Leukozyten (BSL) von Myelin und andere Gewebedebris ermöglicht zentrifugiert. Isolierte Zellen werden dann gewaschen, gezählt unter Verwendung eines Hämozytometers und gefärbt mit fluoreszierenden Antikörpern für die anschließende Analyse durch Durchflusszytometrie.

Dieses Verfahren ermöglicht eine umfassende phänotypische Charakterisierung von entzündlichen Leukozyten Migration auf das Gehirn in retion auf verschiedene Stimuli, einschließlich Schlaganfall sowie viralen oder parasitären Infektionen. Das Verfahren stellt auch ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung von neuartigen anti-inflammatorische Therapien in präklinischen Tiermodellen.

Protocol

Ein. Infektion von Mäusen mit P. berghei-ANKA

1. Defrost ein Aliquot von kryokonservierten P. berghei ANKA PRBC.
2. Restrain eine zerebrale Malaria-resistente BALB / c Donor-Maus (8-12 Wochen alt) mit dem two-handed Zurückhaltung Technik. Inject Maus mit 100-200 ul PRBC mit einer 1 ml Insulinspritze (28G Nadel). Routinemäßig werden 1-2 Spender-Mäusen injiziert.
3. Am Tag 4-5 nach der Infektion (pi) zu entfernen Donor-Maus aus dem Käfig und legen Sie sie auf einer Workstation oder einem Einweg arbeiten Pad.
4. Gently zurückzuhalten Maus bis zum Ende des Schwanzes und mit einer kleinen Schere schneiden Sie die Schwanzspitze (ca. 1 mm). Alternativ könnte ein kleiner Einstich mit einem Schwanz 25 G Nadel vorgenommen werden.
5. Geben Sie einen Tropfen Blut aus der Maus Schwanzvene am Ende einer mattierten-End-Mikroskop-Objektträger.
6. Legen Sie einen zweiten Schieber (Spreader) auf einem 45 ° Winkel und es zurück in den Blutstropfen. Sobald das Blut breitet sich entlang der Kante, drücken Sie den Streuer-slide evenly auf dem Objektträger um die Blutausstrich machen. Lassen Sie den Abstrich an der Luft trocknen.
7. Fix Blutausstrichen in 100% Methanol für 30 Sekunden und dann färben Folien in frisch hergestelltem Giemsa für 10 min.
8. Spülen Blutausstrich mit fließendem Wasser für 1 min, an der Luft trocknen lassen und untersuchen Objektträger unter dem Mikroskop (100x, Öl-Immersion). Aufzählen PRBC in 1.000 Erythrozyten und berechne Prozent Parasitämie. Donor Mäuse sollten Parasitämie Ebenen zwischen 2,5-5% erreichen, bevor sie für die Infektion von Versuchstieren entlüftet werden.
9. Blutentnahme von dem Spender Maus durch retroorbitale Blutungen unter Verwendung eines Mikro-heparinisierten Hämatokrit Kapillarrohr. Alle Versuche werden in Übereinstimmung mit den Walter & Eliza Hall Institut Animal Ethics Committee Anforderungen durchgeführt. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee andere Anforderungen Blutungen Verfahren verwendet werden könnten. Aufzulösen erforderliche Blutmenge in RPMI-Medium mit einer Endkonzentration von 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml. Bedenken Sie, dasseine normale Maus Hämatokrit ~ 6x10 ⁹ roten Blutkörperchen / 1 ml.
10. Infect experimentellen C57BL / 6 Mäuse (8-12 Wochen alt) durch Einspritzen intraperitoneal (ip) 1x10 ⁶ pRBC/0.2 ml.
11. Um Parasitämie Ebenen der infizierten Mäusen beobachten die Schritte 1,3-1,8. Parasitämie sollte ermittelt alle 2-3 Tage, beginnend am Tag 2 oder 3 pi
12. Auftreten einer schweren Malaria in C57BL / 6 Mäusen manifestieren könnte als gekrümmte Erscheinung, ruffed Fell und geringe Aktivität. Einige Mäuse können in dieser Phase zu erholen, aber Progression zu Verlust der Selbstkontrolle aufrichtenden Reflex zeigt irreversible Krankheit und Tiere müssen eingeschläfert werden.

2. Intrakardiale Perfusion von Mäusen und Brain Extraction

1. Montieren einer manuellen Schwerkraft Perfusionssystem durch Befestigen eines 500 ml Reservoir zu einer Säule angebrachten Halter Anfang einer 60 cm Säule Ständer. Verbinden Kunststoffrohr am unteren Ende des Reservoirs und sichern eine Schlauchklemme zum Puffer zu steuern. Befestigen Sie Schlauch mit einer 23 G Nadel. Fill bis das Reservoir mit PBS (gehalten bei 22 ° C), öffnen Sie klemmen und ermöglichen Puffer durch den Schlauch laufen, um alle Luftblasen zu entfernen.
2. Euthanize P. berghei ANKA-infizierten Maus durch CO _{2-Inhalation.} Bestätigen Tod durch das Fehlen des Pedals, Schwingschleifer und respiratorischen Reaktionen.
3. Merken eingeschläfert Maus durch den Hinterbeinen und Vorderpfoten dorsal auf einem Styropor-Dissektion Bord in einer Plastikschale enthalten. Je nach den örtlichen Tier Ethic Committee Anforderungen Anästhesie konnte vor Beginn der intrakardialen pefusion verabreicht werden.
4. Wischen Bauchseite mit 70% Ethanol.
5. Verwenden Sie große Schere und Pinzette die Haut entlang der Mittellinie öffnen, um die Brusthöhle aussetzen. Fach und Pin Haut an den Seiten.
6. Halten das Brustbein mit feinen Pinzetten und schneiden das Diaphragma und auf beiden Seiten des Brustbeins Durchtrennen der Rippen. Achten Sie darauf, dass keine großen Blutgefäße schädigen.
7. Pin der Brustkorb von dem Brustbein lose neben dem Kopf.
8. Halten Ventrikel with feinen Pinzette vorsichtig incise rechten Vorhof mit feinen Schere.
9. Legen 23G Nadel Schwerkraft Perfusionssystem in die linke Herzkammer zur Aorta ascendens während PBS läuft. Legen Sie nur 0,5 cm der Nadelspitze.
10. Perfundieren Maus für 5 min oder bis Ablauf ist klar.
11. Unpin Maus und legen Sie sie auf ihren Bauch. Wischen Sie den Kopf mit 70% Ethanol.
12. Mit großen Schere, einen Schnitt oberhalb des zervikalen Rückenmarks Bereich.
13. Verwenden feinen Schere zu machen eine mediane caudal-rostral Schnitt beginnend an der Basis des Schädels und schälen Haut weg, um den Schädel freizulegen.
14. Halten den Kopf, legen Sie die Blätter eines kleinen Schere in jeder Augenhöhle und einen Schnitt zwischen den Umlaufbahnen.
15. Machen Sie einen Längsschnitt entlang der Pfeilnaht und sorgfältig schälen Schädel auf jeder Gehirnhälfte nach außen.
16. Mit einem Spatel, heben das Gehirn und legen Sie sie in einem 10 ml Zentrifugenröhrchen mit RPMI-Medium.

3. Isolierung von Brain-sequestered Leukozyten (BSL)

1. Arbeiten in einer Sicherheitswerkbank, Ort frisch Gehirns auf einem Edelstahl-Zellsieb (40-60 Maschenweite) in eine Petrischale mit 3-5 ml RPMI Zellkulturmedium geerntet.
2. Cut Hirngewebe in kleine Stücke schneiden.
3. Push kleine Stücke von Hirngewebe durch die Zelle unter Verwendung eines Kristalls Sieb Druckfläche.
4. Übertragen Gehirnhomogenat in ein 10 ml Röhrchen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C.
5. Das Pellet in 3 ml RPMI-Medium, das 0,05% Collagenase D und 2U/ml DNAse I.
6. Drehen Mischung wird 30 min bei Raumtemperatur. Zelltrümmer zu entfernen, indem das Gemisch durch einen 70 um Nylon Zellsieb und / oder durch Inkubation auf Eis für 5 min.
7. Lay Hirnhomogenisat auf eine 7 ml 30% Percoll Kissen und Zentrifuge bei 400 × g (ungebremst) 20 min bei Raumtemperatur.
8. Pellet in 1 ml Erythrozyten Lysepuffers und Inkubation auf Eis für 5 min auflysieren adhärenten PRBC, die nicht vom Gehirn konnte durch intrakardiale Perfusion entfernt werden.
9. 9 ml RPMI-Medium, waschen Zellen und Zentrifuge bei 250 × g für 10 min bei 4 ° C.
10. Resuspendieren BSL-enthaltende Pellet in 50-100 ul RPMI-Medium und Transfer Zellen zu einem Eppendorf-Röhrchen.
11. Verdünnte eine 5-10 ul Aliquots der Zellprobe 1:2 in Trypanblau zur Identifizierung von lebensfähigen Zellen.
12. Graf lebensfähigen Zellen unter dem Mikroskop mit einer Zählkammer. Von Tag 6 pi an, als P. berghei ANKA-infizierten Mäuse zeigen neurologische Symptome, 20.000-100.000 BSLs wiederhergestellt werden können.

4. Immunphänotypisierung der BSL durch Multicolour Durchflusszytometrie

1. Zentrifuge Zellen bei 250 xg für 10 min bei 4 ° C, den Überstand aspirieren und Pellet in 50 ul Färbepuffer (PBS, 1% fötalem Kälberserum (FCS), 2 mm EDTA).
2. Fügen Sie die 1 ul gereinigt anti-CD16/32 Antikörper (Fcblock).
3. Inkubieren Zellen für 10 min auf Eis.
4. Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
5. Die Zellen in 50 ul Färbepuffer mit vorgegebenen optimalen Verdünnungen der erforderlichen fluoreszierenden Antikörpern, dh anti-CD4, anti-CD8, anti-TCR-und Anti-NK1.1.
6. Inkubieren für 1 Stunde auf Eis.
7. Waschen der Zellen mit 1 ml der Färbung Buffer. Zentrifuge Zellen bei 250 g für 10 min bei 4 ° C und saugt den Überstand.
8. Die Zellen in 100 ul PBS.
9. Übertragen Zellen einem Durchflusszytometrie Kunststoffrohr.
10. Mit einem Durchflusszytometer, erwerben mindestens 5.000-10.000 Ereignisse. Entsprechende ungefärbten Zelle steuert und Fluorochrom Entschädigung Proben enthalten, wie benötigt werden.
11. Analyse der Ergebnisse mit Hilfe geeigneter Durchflusszytometrie Software.

Results

Die Ergebnisse in Abb.. 2 zeigen Prozentsätze und absolute Zahl der verschiedenen BSL Populationen aus Gehirnen von perfundierten oder unperfused Malaria-infizierten und naiven Kontrollmäusen erholt. Isolated BSL wurden mit PE-anti-NK1.1 und APC-anti-TCR-β-Antikörper gefärbt, wie im Protokoll Text angezeigt. Übereinstimmend mit früheren Resultaten ^7-9, bestehend αβTCR ⁺ T-Zellen einen hohen Anteil an der BSL Pool in Gehirnen von perfundierten Malaria-infizierte Mäuse (6 Tage pi). Diese Population z...

Discussion

Die Isolierung und Analyse der BSL ist eine Methode, Charakterisierung und Quantifizierung von Entzündungszellen die Migration auf das Gehirn als Reaktion auf Gewebeverletzung oder Infektion in experimentellen Mausmodellen können. Die Einführung eines intrakardialen Perfusion Schritt zur Entfernung des Organs Blutabteil vor Extraktion und anschließende Zellisolation ist nützlich, um eine Kontamination von entzündlichen Zellen mit nicht-entzündliche zirkulierenden Leukozyten zu verhindern. Dies könnte nicht eine wesentli...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
			Lösungen und Puffer
Giemsas azur Eosin-Methylenblau-Lösung	Merck Millipore	1.09204.0500	1:10-Verdünnung in destilliertem Wasser
RPMI-Medium			Maus Tonus
Maus Tonus PBS			20 mM Natriumphosphat, 0,149 NaCl, pH 7,3
0,4% Trypanblau	Sigma Aldrich	T-8154	1:2 Verdünnung
Collagenase D	Worthington Biochemical
DeoxyribonuClease (DNAse) I	Sigma Aldrich	D4263-5VL	Von Rinderpankreas
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01	30% ige Lösung in PBS
Ultrapure Tris	Invitrogen	15505-020
Ammoniumchlorid (NH 4 Cl)	AnalaR	10017
Red Cell Lysis Buffer			17 mM Tris, 14Nm NH 4 Cl, pH 7,2
FCS	Gibco	1009
EDTA Dinatriumsalz	Merck	10093.5V	0,1 M, pH 7,2
			Antikörper und Konjugate
Anti-Maus-CD16/CD32 (Fc Block), Klon 2.4G2	BD Pharmingen	553142	1 ul in 50 ul Färbepuffer (0.5mg/50 ml)
FITC-anti-Maus-CD4, Klon H129.19	BD Pharmingen	553651
PE-anti-Maus-NK1.1, Klon PK136	BD Pharmingen	553165
PerCPCy5.5-Anti-Maus-CD8, Klon 53-6-7	BD Pharmingen	551162
APC-anti-Maus-TCR-β, Klon H57-597	BD Pharmingen	553174
PE-anti-Maus-CXCR3, Klon 220.803	R & D Systems	FAB1685P
Biotinyliertem Anti-Maus-CCR5, Klon C34-3448	BD Pharmingen	559922
Streptavidin-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	551419
			Ausrüstung und Material
SuperFrost Mikroskopobjektträger	Lomb Menzel-Gläser
Dissection Zangen, Scheren	REDA Instrumente
500 ml PBS Reservoir	Nalgene
Gummischlauch
23G Nadel	BD PrecisionGlide	302008
Zelldissoziationslösung Kit mit Metallsieb	Sigma Aldrich	CD-1
70 um Nylon Zellsieb	BD Falcon	352350
Hemocytometer	GmbH Neubauer	717810
Durchflusszytometrie	BD Falcon	352008