Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe

Summary

Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.

Abstract

Wir zeigen die Verwendung eines einfachen mikrofluidischen Einrichtung, in der einzelne Hefe-Zellen über die gesamte Lebensdauer verfolgt werden kann. Die Mikrofluidik-Chip nutzt die Größenunterschied zwischen Mutter und Tochter-Zellen mit einer Reihe von micropads. Bei Belastung werden die Zellen unter diesen micropads eingeschlossen, weil der Abstand zwischen der microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (3-4 um). Nach dem Ladevorgang wird Kulturmedium kontinuierlich durch den Chip, der nicht nur eine konstante und definierte Umwelt während des gesamten Experiments gespült, sondern auch spült den Schwellenländern Tochterzellen, die nicht unter den Pads aufgrund ihrer geringeren Größe zurückgehalten werden. Der Aufbau behält Mutter Zellen so effizient, dass in einem einzigen Experiment bis zu 50 einzelne Zellen in einer vollautomatisch während 5 Tagen überwacht werden oder, falls erforderlich, länger. Darüber hinaus ermöglichen die hervorragenden optischen Eigenschaften des Chips hoherAuflösung Bildgebung von Zellen während des gesamten Alterungsprozess.

Introduction

Bäckerhefe ist ein wichtiger Modellorganismus für Alternsforschung ^1. Bis vor kurzem Studium replikativen Alterung in Hefezellen ein aufwändiger Prozess erfordern eine Dissektion Verfahren, in dem jeder Keim wurde manuell aus der Mutterzelle ^2,3 entfernt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen neuen mikrofluidischen Einrichtung der Lage, einzelne Zellen Mutter während ihrer gesamten Lebensdauer ⁴ verfolgen.

In unserem mikrofluidischen Chips werden Hefezellen unter weichen Elastomer-basierte micropads gefangen (siehe Abbildung 1). Ein kontinuierlicher Strom des Mediums wäsch....

Protocol

1. Produktion und Herstellung eines Silizium-Wafers Mold

Mikrofluidik-Chips aus einem Silizium-Wafer Form durch weiche Lithographie erzeugt. Diese Wafer kann viele Male wiederverwendet werden, um Mikrofluidik-Chips produzieren. Es ist ratsam, dass die Produktion eines entsprechenden Wafer von einer Gruppe in der Mikrofluidik spezialisiert ⁶ durchgeführt wird.

Der Wafer wird in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von Photolithographie zwei unterschiedliche Schichten mit negativer Photolack SU-8 ⁷ hergestellt. Die untere Schicht wird verwendet, um die Zelle Fangebene (SU-8 2002, Höh....

Results

In diesem Protokoll werden die Zellen in dem mikrofluidischen Chip direkt vom mittleren exponentiellen Kultur geladen. Um festzustellen, ob die Altersverteilung der Zellen in der mikrofluidischen Chips gefangen ähnlich wie der Kultur vor dem Beladen wurden die Zellen mit Weizen agglutinin konjugiert FITC (WGA-FITC) zu visualisieren Sprossnarben gefärbt. Wie in 3 zu sehen ist, ist der Einschluß von Zellen unter den micropads des mikrofluidischen Chips nicht an Zellen eines bestimmten Alters vorgespannt. .......

Discussion

Die mikrofluidischen hier beschriebene Methode ist ein wichtiges Werkzeug in Roman Altersforschung, wie es einfache und automatisierte Erzeugung von Hefe replikativen Lebensspanne Daten in Kombination mit kontinuierlichen hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Diese Attribute sind wesentliche Verbesserungen gegenüber den experimentellen Möglichkeiten der klassischen Dissektion Methode, aber es gibt ein paar Einschränkungen der Methode, die berücksichtigt werden müssen.

Beachten Sie, dass die .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomer	Mavom bv	1060040	Dieses Paket enthält PDMS-Basis und PDMS-Härter.
Petrischalen aus Glas 120/20 mm	VWR International	391-2850
Deckgläser 22x40 mm	CBN Labsuppliers BV	190002240
Tough-Tags	Sigma-Aldrich	Z359106
Aluminiumfolie
Einwegbecher
Serologische Pipette 5 ml	VWR International	612-1245
Klebeband	VWR International	819-1460
Baysilone-Paste (GE Bayer Silikone)	Sigma-Aldrich	85403-1EA
PTFE-Mikrobohrungsschlauch, 0,012" ID x 0,030" OD	Cole Parmer	EW-06417-11	Bezeichnet als dünner Schlauch
Tygon Microbore Schlauch, 0,030" ID x 0,090" OD	Cole Parmer	EW-06418-03	Bezeichnet als dicker Schlauch
Skalpell	VWR International	233-5334
50 ml Luer-Lok Spritzen	BD	300137
5 ml Spritzen, Luerspitze	VWR International	613-1599
Pinzette	VWR International	232-2132
20 Gauge Luer Stubs	Instech Solomon	LS20
Spritzenvorsatzfilter (Porengröße 0,20 μ m)	Sigma-Aldrich	16534K
Katheterstecker aus Edelstahl, 20 ga x12 mm	Instech Solomon	SP20/12
Petrischalen	VWR International	391-0892<
Benchtop UV-Ozone Cleaner	NOVA Scan	PSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite	Harvard Apparatus	70-4505
SU-8 Silizium Master Mold (Wafer)			Eigenbau; Für Details wenden Sie sich bitte an den korrespondierenden Autor
Balance	Sartorius corporation	ED4202S
Vakuumpumpe	KNF Neuberger	N022 AN.18
Exsikkator	VWR International	467-2115
Heizplatte	VWR International	460-3267
Optional: Metallhalter für Deckglas (22x40 mm)			Selbstgemacht; Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an den korrespondierenden Autor
(Fluoreszenz) Mikroskop mit 60-fachem Objektiv, Autofokus, Zeitrafferfähigkeit und vorzugsweise einem automatisierten (motorisierten XY-Steuerung) Tisch	Nikon	Eclipse Ti-E