Wir beschreiben hier den Betrieb einer mikrofluidischen Vorrichtung, die eine kontinuierliche und hochauflösende mikroskopische Bildgebung einzelner knospenden Hefezellen ermöglicht während ihres kompletten replikativen und / oder chronologischer Lebensdauer.
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Methodenartikel
Kontinuierliche Hochauflösende mikroskopische Beobachtung Replikative Aging in Bäckerhefe
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Wir zeigen die Verwendung eines einfachen mikrofluidischen Einrichtung, in der einzelne Hefe-Zellen über die gesamte Lebensdauer verfolgt werden kann. Die Mikrofluidik-Chip nutzt die Größenunterschied zwischen Mutter und Tochter-Zellen mit einer Reihe von micropads. Bei Belastung werden die Zellen unter diesen micropads eingeschlossen, weil der Abstand zwischen der microPad und Deckglas ist ähnlich dem Durchmesser einer Hefezelle (3-4 um). Nach dem Ladevorgang wird Kulturmedium kontinuierlich durch den Chip, der nicht nur eine konstante und definierte Umwelt während des gesamten Experiments gespült, sondern auch spült den Schwellenländern Tochterzellen, die nicht unter den Pads aufgrund ihrer geringeren Größe zurückgehalten werden. Der Aufbau behält Mutter Zellen so effizient, dass in einem einzigen Experiment bis zu 50 einzelne Zellen in einer vollautomatisch während 5 Tagen überwacht werden oder, falls erforderlich, länger. Darüber hinaus ermöglichen die hervorragenden optischen Eigenschaften des Chips hoherAuflösung Bildgebung von Zellen während des gesamten Alterungsprozess.
Einleitung
Bäckerhefe ist ein wichtiger Modellorganismus für Alternsforschung 1. Bis vor kurzem Studium replikativen Alterung in Hefezellen ein aufwändiger Prozess erfordern eine Dissektion Verfahren, in dem jeder Keim wurde manuell aus der Mutterzelle 2,3 entfernt. Um dieses Problem zu lösen, haben wir vor kurzem einen neuen mikrofluidischen Einrichtung der Lage, einzelne Zellen Mutter während ihrer gesamten Lebensdauer 4 verfolgen.
In unserem mikrofluidischen Chips werden Hefezellen unter weichen Elastomer-basierte micropads gefangen (siehe Abbildung 1). Ein kontinuierlicher Strom des Mediums wäscht neu gebildeten Tochterzellen und stellt die Zellen mit frischen Nährstoffen. In einem einzigen Experiment, kann bis zu 50 Mutter-Zellen in einem vollautomatisch während ihrer gesamten Lebensdauer replikativen überwacht werden. Bedingt durch die hervorragenden optischen Eigenschaften des mikrofluidischen Chips, ist es möglich, gleichzeitig zu überwachen verschiedenen Aspekte der Hefezelle biology (zB mit fluoreszierenden Proteinen).
Im Vergleich zu den klassischen Dissektionsverfahren stellt die mikrofluidischen Einrichtung wesentliche Vorteile. Er sorgt für einen definierten und konstanten Umwelt während des gesamten Experiments Alterung. Es erfordert keine teure Spezialausrüstung und kann auf jedem Mikroskop mit automatischer Fokussierung und Zeitraffer-Fähigkeiten sowie Temperatur-Kontrolle zur Zellkultivierung ausgestattet ausgeführt werden. Die Produktion und den Betrieb der mikrofluidischen Chips können in wenigen Tagen erlernt werden. Darüber hinaus können die Zellen direkt aus einer exponentiell wachsenden Kultur, ein Vorteil gegenüber anderen kürzlich veröffentlichten mikrofluidischen Verfahren 5, die Biotinylierung Mutter Zellen erfordert geladen werden. Kombiniert mit einer hochauflösenden Bildgebung, die hier beschriebenen Verfahren verwendet werden, um graduelle Veränderungen zu messen in zelluläre Morphologie, Alterung Protein Expression und Lokalisation während Hefe in beispielloser Weise. Die Fähigkeit,Langzeit-Monitoring von Einzelzellen bietet auch einzigartige Möglichkeiten für Hefe-Zellzyklus-Studien.
a Diese Methode wurde kürzlich optimiert, um die Biotinylierung von dem Protokoll 16, die veröffentlicht, während dieses Manuskript war in Bewertung wurde entfernen.
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Protokoll
1. Produktion und Herstellung eines Silizium-Wafers Mold
Mikrofluidik-Chips aus einem Silizium-Wafer Form durch weiche Lithographie erzeugt. Diese Wafer kann viele Male wiederverwendet werden, um Mikrofluidik-Chips produzieren. Es ist ratsam, dass die Produktion eines entsprechenden Wafer von einer Gruppe in der Mikrofluidik spezialisiert 6 durchgeführt wird.
Der Wafer wird in einem zweistufigen Verfahren unter Verwendung von Photolithographie zwei unterschiedliche Schichten mit negativer Photolack SU-8 7 hergestellt. Die untere Schicht wird verwendet, um die Zelle Fangebene (SU-8 2002, Höhe 3-4 um) zu erzeugen, während die Kanäle mit der Deckschicht (SU-8 2010, Höhe 10 um) hergestellt werden. Einen Eindruck von der Wafer-Produktion kann in Huang et al 8 gefunden werden. Die Zeichnungen der mikrofluidischen Chips können von den Autoren sowie Ratschläge, wie man einen entsprechenden Wafer erhalten erhalten werden.
- Sobald der Wafer erhalten, schneiden Sie ein Stück Tough-Tag into dünne Streifen von etwa 0,5 mm bis 3 mm mit einem Skalpell und legen Sie sie vorsichtig auf dem Wafer leicht auf der Oberseite des Kanals Struktur zwischen den Kanälen und dem Einlass microPad array (Abbildung 2A). Dies wird bei der Bildung einer großen zusätzlichen Kanal in jedem Chip, die nicht nur während Zellladung einsetzbar wäre, ist aber auch für den stabilen Betrieb der mikrofluidischen Vorrichtung wichtig.
- Bedecken Sie den Glas Petrischale mit einer doppelten Schicht aus Aluminiumfolie und legte die Scheibe in der Petrischale. Die Aluminiumfolie wird PDMS von aktiv zwischen dem Wafer und der Petrischale zu verhindern. Wenn PDMS tut Kriechen zwischen dem Wafer und dem Glas Petrischale wird der Wafer fixiert werden dauerhaft in der Petrischale. Obwohl der Wafer noch verwendbar, wird es nicht möglich sein, die Glas-Petrischale ersetzen, wenn er bricht das PDMS müssen später heraus geschnitten werden.
2. Herstellung von Mikrofluidik-Chips
- Legen Sie eine leere PlastikflascheTasse auf die Waage stellen und tarieren. Gießen Sie 40 g PDMS Basis in den Plastikbecher (für eine 12 cm Durchmesser Glas Petrischale). In PDMS Härter mit einem Einweg-Pipette in aw / w-Verhältnis von 1:10, also etwa 4 ml.
- Mischen Sie die PDMS und Härter gründlich mehrere Minuten. Dies kann mit Einweg-Kunststoff-Pipette, mit der das Härtungsmittel Pipette erfolgen. Es ist wichtig, dass das Gemisch gut vor dem Gießen auf der Oberseite des Wafers gemischt. Eine schlechte Vermischung bewirkt Teil des PDMS nicht polymerisieren.
- Gießen Sie das PDMS auf der Oberseite des Wafers im Glas Petrischale.
- Mischen von PDMS mit dem Härter wird Blasenbildung im PDMS-Gemisch führen. Diese Blasen müssen entfernt werden, bevor die PDMS polymerisiert werden. Die PDMS kann nach dem Gießen sie auf der Oberseite des Wafers, indem der Petrischale in einem Exsikkator mit einer Vakuumpumpe entgast werden. Mit diesem Setup, dauert es etwa 30 Minuten, um alle Luftblasen aus dem Gemisch zu entfernen.
- Polymerisieren the PDMS, indem Sie die Petrischale mit dem Wafer auf einer Heizplatte bei 120 ° C für 1 Stunde und dann bei 65 ° C für eine weitere Stunde.
- Entfernen Sie die Alufolie zusammen mit dem Wafer und polymerisiert PDMS aus dem Glas Petrischale. Peel off der Aluminiumfolie und der dünnen Schicht aus polymerisierten Rest PDMS von der Rückseite des Wafers. Die Schicht aus PDMS auf dem Wafer kann dann vom Wafer nach oben heraus sorgfältig abgetrennt werden.
- Legen Sie die PDMS-Schicht auf den Kopf (mit den Kanälen nach oben) auf der Bank und schneiden Sie die Single-Chip-Designs auf der PDMS vorsichtig mit einem Skalpell aufgedruckt. Versuchen bis etwa 3 mm von PDMS an den Rändern der Kanäle zu halten, um die Befestigung des Chips auf dem Deckglas später zu verbessern.
- Lochung in der PDMS an den Enden der Eingangs-, Ausgangs-und Seitenkanal (2A), indem Sie einen 20 Messgerät Luer Stub den ganzen Weg durch das PDMS in einer geraden Weise.
Achten Sie darauf, die PDMS-Chipliegt noch kopfüber auf der Bank, während Stanzen der Löcher. Dies verhindert PDMS Kleben an der Innenseite des Kanals, die Blockierung des Kanals führen kann.
- Nach dem Stanzen jedes Loch, entfernen Sie die Spalte von PDMS in der Luer Stub mit einer Pinzette, bevor Sie die Stub wieder heraus. Die PDMS Spalte sonst bleiben hinter und blockieren die gerade gestanzte Loch.
- Reinigen Sie die Oberflächen des Chips von Staubpartikeln und Rest PDMS indem Klebeband drauf und sofort Entfernen des Bandes wieder. Ebenso reinigen das Deckglas auf dem der Chip angebracht werden.
- Platzieren Sie den Chip gereinigt und Deckglas unter der UV-Lampe der Benchtop UV-Ozon-Reiniger. Die Seiten, die miteinander verbunden werden sollen, müssen vor der Lampe.
- Setzen Sie die PDMS und Deckglas dem UV-Licht für 6-8 min und direkt danach setzen Sie den Chip auf dem Deckglas, indem die freiliegenden Flächen auf der jeweils anderen.
- Sanft um die Seiten des Chips tippenum die Befestigung des PDMS auf dem Deckglas zu fördern und mögliche Luftblasen zu entfernen. Nicht auf der Oberseite des Kanals Struktur tippen, da dies kann dazu führen, die micropads auf dem Deckglas angebracht sowie zu bekommen.
- Legen Sie die neu gemacht mikrofluidischen Setup auf einer Heizplatte bei 100 ° C für 60 min. Testen Sie die Stärke der Bindung zwischen dem Deckglas und PDMS-Chip, indem Sie versuchen, heben die Kanten des PDMS-Chip leicht. Wenn der PDMS-Block nicht aus der Glasoberfläche angehoben werden, ist die Verbindung erfolgreich und der Chip ist betriebsbereit.
3. Vorbereiten der Chip für Handy geladen
Der Ausfall einer Mikrofluidik-Vorrichtung kann somit zu Leckage von Medium in das Mikroskop. Um dies zu vermeiden, ist es, um eine beratende Halter aus Metall zu verwenden und / oder dichten die Seiten des Chips, wo die PDMS erfüllt das Glas mit Nagellack oder Epoxid-Kleber. Dies verhindert das Auslaufen des Mediums bei der PDMS-Chip ist nicht gut genug, um das Deckglas geklebt. Auch die SchläucheVerbindungen kann um die Ansatzstellen in ähnlicher Weise befestigt werden, um eine Leckage von Medium zu vermeiden. Ein hausgemachtes Wasser-Sensor, schaltet die Spritzenpumpe im Falle einer Leckage kann als zusätzliche Sicherheitsmaßnahme verwendet werden. Zeichnungen der Halter aus Metall speziell für die Mikrofluidik-Chip konstruiert sind den Autoren erhalten werden.
- Platzieren des mikrofluidischen Chips in dem Metall-Halter, mit Silikon-Gel zwischen dem Glas des Chips und den Metallteilen der Halterung, um eine wasserdichte Abdichtung zu schaffen. Schrauben Sie die Muttern vorsichtig, damit das Glas nicht brechen.
- Verbinden dünne Röhren (ca. 5-15 cm lang) auf dem Seitenkanal und dem Auslasskanal des Chips. Die Verwendung einer Pinzette erleichtert, um den Schlauch in die gestanzten Löcher einzufügen.
- Füllen Sie eine 50 ml Spritze Luer-Lok mit Kulturmedium, entfernen Sie die Luft aus der Spritze und verbinden Sie es nacheinander mit einer Spritze Filter, einem 20 Spur Luer Stummel, einen kurzen dicken Schlauch (ca. 2 cm lang) und einen dünnen Schlauch. Stellen Sie sicher, dass die dünne Wannee ist lang genug, um den Abstand zwischen der Spritzenpumpe und dem Mikroskoptisch erstrecken.
- Legen Sie die Spritze in die Spritzenpumpe, schneller Vorlauf, bis die Pumpe den dünnen Schlauch vollständig mit Medium gefüllt ist.
- Schieben Sie den dünnen Schlauch mit der Spritze in den Einlasskanal des Chips und lassen Sie das Medium durch den Chip bei 10 ml / min (Abbildung 2B). Sammeln Sie das Medium verlässt den Chip (zB in einer Petrischale). Das Medium zur Neige gehen über den Seitenkanal wegen des Widerstandes zwischen der Tough-Tag groß gemacht Seitenkanal und den Auslasskanal.
- Platzieren Sie den Chip im Mikroskop Bühne und den Fokus des Mikroskops auf den Pads.
Die Verwendung von Ölimmersionsobjektive wird über die von Wasser Immersionsobjektive bevorzugt, weil das Öl nicht austrocknet über den zeitlichen Verlauf des Experiments.
Abhängig von der Mikroskop könnte es Probleme mit der Beibehaltung der focus in den ersten Stunden des Experiments. Es ist daher ratsam, den Chip für ein bis zwei Stunden in dem Mikroskop Bühne zu verlassen, damit es zu begleichen können sich vor dem Laden Zellen und Beginn des Experiments.
4. Laden von Hefezellen in der Mikrofluidik-Chip
- Schließen Sie ein 5 ml Luer Spritze zu einer 20 Spur Luer Stub und einem dicken Rohr (ca. 3 cm).
- Nehmen einer Probe von der Zellkultur in den Chip geladen.
Die bevorzugte Zellzahl für die Beladung zwischen 1-5 x 10 6 Zellen pro ml. Kulturen mit höheren Zellzahlen müssen vor der Beladung verdünnt werden. Wenn Kultivierung von Zellen auf YPD können Zellenbelastung verbessert viele-fach werden, wenn die Zellen zunächst mit gewaschen und erneut in Minimalmedium mit Glucose einen ähnlichen Prozentsatz vor dem Laden. Während des Betriebs des Chips kann YPD-Medium wieder sicher verwendet werden.
- Legen etwa 1 ml der Zellsuspension in the Spritze und entfernen Sie die Luft aus der Spritze.
- Verringern Sie die Flussrate der Spritzenpumpe bis 0,5 ml / min. Die niedrigen und kontinuierlichen Fluss von der Spritzenpumpe während des Ladens (in Schritt 4.5) durchgesetzt wird Push fraktionslosen Zellen erfolgt über den Seitenkanal (Abbildung 2C).
- Die Spritze mit der Zellsuspension in das Rohr des Auslasskanals. Laden der Zellen durch Drücken auf den Kolben der Spritze vorsichtig. Beachten Sie die Zellen, die in und Abrechnung unter den micropads über die Augen oder über den Computer-Bildschirm.
- Behalten Sie den Druck auf den Kolben, bis genügend Zellen unter den Pads zu begleichen. Die optimale Belastung 1-3 Zellen pro Pad. Als Zellen unter den Pads zufällig zu regeln, ist es durchaus üblich, dass ein paar Pads enthalten keine Zellen und andere Polster vollständig mit Zellen gefüllt.
- Trennen Sie die Spritze für die Zell-Beladung und dem dicken Schlauch verbunden, um sie von der dünnen Schlauch des Auslasskanal verwendet, spülen Sie die Seite channel für ein paar Minuten bei höheren Flussraten (10 ul / min), um Luftblasen zu entfernen und / oder Zellen, die noch nicht verlassen den Chip (2B). Wenn Zellen, die nicht von der Seite-Kanal entfernt sind, können sie beginnen, in dem Seitenkanal wachsen und stören das Experiment später.
- Setzen Sie den Fluss von der Spritzenpumpe wieder auf 0,5 ml / min und schließen Sie den Seitenkanal durch den Anschluss an einen dicken Schlauch (ca. 5 cm lang) mit einem Katheter Stecker an seinem Ende (2D).
- Erhöhen Sie die Durchflussmenge zu einer endgültigen Flussrate von 1-5 ml / min. Durchflussmengen je nach Medium und Hefestamm.
- Starten Sie einen Film mit dem Mikroskop und Kamera-Einstellungen für das Ziel des Experiments. Stellen Sie sicher, dass die Geschwindigkeit des Mikroskops auf einen so niedrigen Geschwindigkeit, daß das Öl folgen ist. Für die Bestimmung der replikativen Lebensspanne, Bild-Zellen alle 10 min. Um Zellen aus den winzigen Mengen von UV-Licht durch die Halogen emittiert schützenLampe, die während DIC Übernahme verwendet wird, empfiehlt es sich, einen zusätzlichen UV-Filter in den Strahlengang zu platzieren. Bei der Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie, ist es bevorzugt, Bild der Zellen weniger häufig (zB alle 20 Minuten) phototoxische Wirkungen zu vermeiden. Das Experiment wird beendet, wenn alle Zellen zu Beginn des Experiments geladen tot, die unter normalen Bedingungen dauert bis zu 5 Tagen. Es wird empfohlen, regelmäßig zu überprüfen, den Fokus der Bilder während des Experiments und gegebenenfalls einstellen.
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Ergebnisse
In diesem Protokoll werden die Zellen in dem mikrofluidischen Chip direkt vom mittleren exponentiellen Kultur geladen. Um festzustellen, ob die Altersverteilung der Zellen in der mikrofluidischen Chips gefangen ähnlich wie der Kultur vor dem Beladen wurden die Zellen mit Weizen agglutinin konjugiert FITC (WGA-FITC) zu visualisieren Sprossnarben gefärbt. Wie in 3 zu sehen ist, ist der Einschluß von Zellen unter den micropads des mikrofluidischen Chips nicht an Zellen eines bestimmten Alters vorgespannt. ...
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Diskussion
Die mikrofluidischen hier beschriebene Methode ist ein wichtiges Werkzeug in Roman Altersforschung, wie es einfache und automatisierte Erzeugung von Hefe replikativen Lebensspanne Daten in Kombination mit kontinuierlichen hochauflösende Bildgebung ermöglicht. Diese Attribute sind wesentliche Verbesserungen gegenüber den experimentellen Möglichkeiten der klassischen Dissektion Methode, aber es gibt ein paar Einschränkungen der Methode, die berücksichtigt werden müssen.
Beachten Sie, dass die ...
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Danksagungen
Wir möchten Laura Schippers zum Schreiben der ersten Versionen der Zelle Laden Protokoll und Marcus de Goffau und Guille Zampar für Scoring mitochondrialen Morphologie danken.
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Materialien
EQUIPMENT
aus Kunststofftd colspan="4">
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | Dieses Paket enthält PDMS-Basis und PDMS-Härter. |
| Petrischalen aus Glas 120/20 mm | VWR International | 391-2850 | |
| Deckgläser 22x40 mm | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Aluminiumfolie | |||
| Einwegbecher | |||
| Serologische Pipette 5 ml | VWR International | 612-1245 | |
| Klebeband | VWR International | 819-1460 | |
| Baysilone-Paste (GE Bayer Silikone) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| PTFE-Mikrobohrungsschlauch, 0,012" ID x 0,030" OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Bezeichnet als dünner Schlauch |
| Tygon Microbore Schlauch, 0,030" ID x 0,090" OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Bezeichnet als dicker Schlauch |
| Skalpell | VWR International | 233-5334 | |
| 50 ml Luer-Lok Spritzen | BD | 300137 | |
| 5 ml Spritzen, Luerspitze | VWR International | 613-1599 | |
| Pinzette | VWR International | 232-2132 | |
| 20 Gauge Luer Stubs | Instech Solomon | LS20 | |
| Spritzenvorsatzfilter (Porengröße 0,20 μ m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Katheterstecker aus Edelstahl, 20 ga x12 mm | Instech Solomon | SP20/12 | |
| Petrischalen | VWR International | 391-0892< | |
| Benchtop UV-Ozone Cleaner | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| SU-8 Silizium Master Mold (Wafer) | Eigenbau; Für Details wenden Sie sich bitte an den korrespondierenden Autor | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Vakuumpumpe | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Exsikkator | VWR International | 467-2115 | |
| Heizplatte | VWR International | 460-3267 | |
| Optional: Metallhalter für Deckglas (22x40 mm) | Selbstgemacht; Für weitere Informationen wenden Sie sich bitte an den korrespondierenden Autor | ||
| (Fluoreszenz) Mikroskop mit 60-fachem Objektiv, Autofokus, Zeitrafferfähigkeit und vorzugsweise einem automatisierten (motorisierten XY-Steuerung) Tisch | Nikon | Eclipse Ti-E |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
