Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

Zusammenfassung

Eine Hämolyse-Assay kann als schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Drug-Delivery-Systeme "cytocompatibility und endosomolytische Aktivität für die intrazelluläre Frachtlieferungen verwendet werden. Der Assay misst die Unterbrechung der Erythrozytenmembranen als Funktion der pH Wert.

Zusammenfassung

Phospholipiddoppelschichten die endo-lysosomalen Vesikeln bilden eine Barriere, die Lieferung von biologischen Medikamenten zur intrazellulären Ziele darstellen. Um diese Barriere zu überwinden, wurde eine Reihe von synthetischen Droge Trägern entwickelt worden, um aktiv zu stören den endosomalen Membran und liefern Fracht in das Zytoplasma. Hier beschreiben wir die Hämolyse Assay, der als rasche, Hochdurchsatz-Bildschirm für den cytocompatibility und endosomolytische Aktivität der intrazellulären Drug Delivery Systemen verwendet werden können.

In der Hämolyse Assay werden menschlichen roten Blutkörperchen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die extrazelluläre, frühe endosomalen und lysosomalen späten Endo-Umgebungen imitieren coinkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt zu pelletieren intakten roten Blutzellen, wird die Menge des Hämoglobins in das Medium freigesetzt spektrophotometrisch gemessen (405 nm für die besten Dynamikbereich). Der prozentuale Anteil der roten Blutkörperchen Störung wird dann quantifiziert, bezogen auf positive Kontrolle samples lysiert mit einem Reinigungsmittel. In diesem Modellsystem die Erythrozytenmembran dient als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Das gewünschte Ergebnis ist vernachlässigbar Hämolyse bei physiologischem pH (7,4) und robuste Hämolyse in der endo-lysosomalen pH-Bereich von etwa pH 5 bis 6,8.

Einleitung

Obwohl es viele potenzielle high-impact therapeutische Ziele innerhalb der Zelle sind, stellt die intrazelluläre Abgabe von Mitteln eine große Herausforderung. Häufig werden Drogen, insbesondere Biologika, durch Zellen internalisiert und gehandelte zu Vesikeln, dass entweder eine Verschlechterung ihres Inhalts durch die Endo-lysosomalen Weg führen, oder zurück aus der Zelle über pendelte Exozytose. ¹ Bei letzterem Verfahren, das interne pH der Vesikel auf etwa 5-6 angesäuert, welches der optimale pH für die Aktivität von Enzymen, die Funktion in diesem Abteil, wie Lysozym. ²

In jüngster Zeit haben eine Reihe....

Protokoll

Ein. Vorbereitung und Sterilisation von Puffer und Test-Agents

1. 150 mM NaCl-Puffer: Man löst 4,383 g NaCl-Kristalle in 500 ml Nanopure-Wasser.
2. pH-Puffer: Planen Phosphatpuffer bei pH 5,6, 6,2, 6,8 und 7,4 durch Mischen entsprechender Mengen an einbasischen und zweibasischen Natriumphosphat. Wenn Proben, bei niedrigeren pH-Werten (dh pH <5,6), dann eine mehr geeigneten Puffer, wie Citrat-Puffer getestet werden sollen, zu verwenden. Buffer Rezepte sind leicht zugänglich, und ein Beispiel verwiesen wurde hier. ¹²
3. Sterilisieren alle Puffer oben erwähnt durch eine Flasche-top Vakuumfiltervorrichtung und Re-Check-Puffer pH-....

Ergebnisse

Typischerweise weisen die Mittel, die idealen pH-abhängigen hämolytischen Verhalten zeigen das höchste Potenzial für cytosolische Abgabe von Medikamenten, Nukleinsäuren oder anderen bioaktiven Molekülen. Dies wird durch Agent # 1 beispielhaft dargestellt, wie in Abbildung 2, die minimale Hämolyse bei pH 7,4 zeigt dargestellt, aber ein starker Anstieg der hämolytischen Verhalten bei endosomalen pH-Bereichen (<6.5). Einige Mittel können ein erhebliches Maß an hämolytisch Verhalten bei physiologis.......

Diskussion

pH-empfindlichen Polymeren oder anderen Mitteln zur endosomolytischen Funktion konstruiert sein kann rasch und effektiv bezogen auf die Lyse der roten Blutzellen bei pH-Werten im Endosom angetroffen (Abbildung 1 gescreent; pH 6,8 - frühe Endosom, pH 6,2 - späte Endosom, pH 5,6 - Lysosom). ^14-17 pH-abhängigen Hämolyse wurde verwendet, um die Fähigkeit von Trägern zu endosomalen Freisetzung biomakromolekulare Therapeutika (z. B. Peptide, siRNA, ODNs, Proteine) vermitteln screenen, und .......

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Blutentnahmekanülen, 20,5-Gauge	Fisher Scientific	02-665-31	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	Für die Blutentnahme
BD Marke Isopropylalkohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Für die Blutentnahme
Salzsäure (konz.)	Fisher Scientific	A144-500	Zur Einstellung des pH der D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive Kontrolle
Dulbecco PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Bottle-Top-Filter-Einheit mit SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-Well-Platten mit flachem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol	Fisher Scientific	08-772-2C	Für plattenförmige Lesung am Ende des Assays.
BD 96-Well-Platten, mit rundem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol	Fisher Scientific	08-772-17	Für die Inkubation von roten Blutkörperchen mit den experimentellen Mitteln.