Ex Vivo Red Blood Cell Hämolyse-Assay für die Beurteilung von pH-responsive endosomolytischen Agenten für Cytosolic Lieferung von Biomakromoleülkomplexen Drugs

Zusammenfassung

Eine Hämolyse-Assay kann als schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Drug-Delivery-Systeme "cytocompatibility und endosomolytische Aktivität für die intrazelluläre Frachtlieferungen verwendet werden. Der Assay misst die Unterbrechung der Erythrozytenmembranen als Funktion der pH Wert.

Zusammenfassung

Phospholipiddoppelschichten die endo-lysosomalen Vesikeln bilden eine Barriere, die Lieferung von biologischen Medikamenten zur intrazellulären Ziele darstellen. Um diese Barriere zu überwinden, wurde eine Reihe von synthetischen Droge Trägern entwickelt worden, um aktiv zu stören den endosomalen Membran und liefern Fracht in das Zytoplasma. Hier beschreiben wir die Hämolyse Assay, der als rasche, Hochdurchsatz-Bildschirm für den cytocompatibility und endosomolytische Aktivität der intrazellulären Drug Delivery Systemen verwendet werden können.

In der Hämolyse Assay werden menschlichen roten Blutkörperchen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die extrazelluläre, frühe endosomalen und lysosomalen späten Endo-Umgebungen imitieren coinkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt zu pelletieren intakten roten Blutzellen, wird die Menge des Hämoglobins in das Medium freigesetzt spektrophotometrisch gemessen (405 nm für die besten Dynamikbereich). Der prozentuale Anteil der roten Blutkörperchen Störung wird dann quantifiziert, bezogen auf positive Kontrolle samples lysiert mit einem Reinigungsmittel. In diesem Modellsystem die Erythrozytenmembran dient als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Das gewünschte Ergebnis ist vernachlässigbar Hämolyse bei physiologischem pH (7,4) und robuste Hämolyse in der endo-lysosomalen pH-Bereich von etwa pH 5 bis 6,8.

Einleitung

Obwohl es viele potenzielle high-impact therapeutische Ziele innerhalb der Zelle sind, stellt die intrazelluläre Abgabe von Mitteln eine große Herausforderung. Häufig werden Drogen, insbesondere Biologika, durch Zellen internalisiert und gehandelte zu Vesikeln, dass entweder eine Verschlechterung ihres Inhalts durch die Endo-lysosomalen Weg führen, oder zurück aus der Zelle über pendelte Exozytose. ¹ Bei letzterem Verfahren, das interne pH der Vesikel auf etwa 5-6 angesäuert, welches der optimale pH für die Aktivität von Enzymen, die Funktion in diesem Abteil, wie Lysozym. ²

In jüngster Zeit haben eine Reihe von Materialien speziell zu nutzen, die Versauerung der Endosomen, um cytosolische Lieferung von ihrer Ladung zu erleichtern entwickelt. Ein Beispiel für diesen Ansatz verwendet synthetische, Polymermizelle Nanopartikel, deren Kern im zwitterionischen und ladungsneutrale bei physiologischem pH (dh 7,4). Jedoch bei pH 6,0- 6.5, wobei die Polymere zu erwerben protoniert und eine positive Nettoladung, die die Micellkerns destabilisiert, und die freiliegenden Polymersegmente interagieren und stören die endosomale Membran. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass die endosomalen Entweichen von Peptid und Nucleinsäure-Therapeutika zu fördern, so dass sie ihre Ziele cytosolischen übersetzen. ^3,4 Andere Beispiele von Methoden entwickelt, die den Escape-endosomalen Membranbarriere stören vermitteln beinhalten 'fusogenen' Peptide oder Proteine, die Membranfusion oder transiente Porenbildung in der Phospholipid-Doppelschicht vermitteln können. ⁵ Homopolymerisate von anionischen Alkylacrylsäuren wie Poly (Propylacrylsäure) sind eine weitere gut untersuchten Ansatz, und in diesen Polymeren, bestimmt der Protonierungsgrad von anhängenden Carbonsäure Übergangs in eine hydrophobe, Membran-disruptive Zustand in endo-lysosomalen pH-Bereiche. ^6,7

Ein nützliches Modell für das Screening endosomolytischen Verhalten ist die ex vivo pH-abhängig Hämolyse-Assay. ⁸ In diesem Modellsystem dient die Erythrozytenmembran als Surrogat für die Lipid-Doppelschicht-Membran, die Endo-lysosomalen Vesikeln umschließen. Dieses Modell generalisierbar von anderen verwendet worden, um die endosomolytische Verhalten zellpenetrierendes Peptide und andere polymere Genabgabesysteme auszuwerten. ^8-11 In diesem Experiment sind menschliche rote Blutzellen und Testmaterialien in Puffern bei pH-Werten definiert, die imitieren coinkubiert extrazellulären (7,4), frühe Endosomen (6,8), und am späten endo-lysosomalen (<6,8) Umgebungen. Die Menge an Hämoglobin während der Inkubationszeit freigesetzt wird als Maß für die Lyse der roten Blutkörperchen, die der Menge an Hämoglobin im positiven Kontrollproben mit einem Detergens lysiert freigesetzt normalisiert wird quantifiziert.

Von Screening einer kleinen Bibliothek von potenziell endosomolytischen Testmaterialien, kann man folgern, dass Proben, die keine Hämolyse produzieren bei pH 7,4, aber deutlich erhöhten Saumolysis bei pH <6,5, werden die effektivsten und cytocompatible Kandidaten für cytosolische Drug Delivery sein. Materialien, die diese Kriterien erfüllen würde voraussichtlich nicht inert und nicht wahllos zerstören Lipiddoppelschichtmembranen (dh, die Zytotoxizität führen können) bis an einen Abfall der lokale pH-Wert nach Internalisierung in endo-lysosomaler Kompartimente ausgesetzt werden.

In diesem Protokoll werden Erythrozyten von einem menschlichen Spender isoliert und bei pH 5,6, 6,2, 6,8 oder 7,4 mit experimentellen endosomolytische Arzneimittelabgabe Mittel co-inkubiert. Intakte Erythrozyten werden pelletiert, und die Überstände (enthaltend Hämoglobin aus lysierten Erythrozyten freigesetzt) ​​für die charakteristische Absorption von Hämoglobin über einen Plattenleser (Abbildung 1) analysiert.

Protokoll

Ein. Vorbereitung und Sterilisation von Puffer und Test-Agents

1. 150 mM NaCl-Puffer: Man löst 4,383 g NaCl-Kristalle in 500 ml Nanopure-Wasser.
2. pH-Puffer: Planen Phosphatpuffer bei pH 5,6, 6,2, 6,8 und 7,4 durch Mischen entsprechender Mengen an einbasischen und zweibasischen Natriumphosphat. Wenn Proben, bei niedrigeren pH-Werten (dh pH <5,6), dann eine mehr geeigneten Puffer, wie Citrat-Puffer getestet werden sollen, zu verwenden. Buffer Rezepte sind leicht zugänglich, und ein Beispiel verwiesen wurde hier. ¹²
3. Sterilisieren alle Puffer oben erwähnt durch eine Flasche-top Vakuumfiltervorrichtung und Re-Check-Puffer pH-Werten.
4. 20% Triton X-100 (positive Kontrolle): Mix 20 ml reinem Triton X-100 in 80 ml nanoreinem Wasser. Vortex kräftig und beschallen zu lösen. Hinterlegen über Nacht bei Raumtemperatur vor der Verwendung.

2. Vorbereitung von Erythrozyten

1. Erhalten 25 ml Blut from eine anonyme menschlichen Spender direkt in K _{2-EDTA-beschichteten} Vacutainer Röhrchen gezogen, um Gerinnung zu verhindern.

HINWEIS: Alle Verfahren müssen von der zuständigen Institutional Review Board (IRB) und Venenpunktion und Blutentnahme im Voraus genehmigt werden muss durch einen geschulten phlebotomist durchgeführt werden, um das Risiko für den Spender zu minimieren. Standard Phlebotomie Verfahren wurden an anderer Stelle. Veröffentlicht ¹³

2. Zentrifuge Blut bei 500 xg für 5 min, und markieren Ebenen der Hämatokrit (rot, untere Schicht) und Plasma (gelblich, obere Schicht) auf dem Rohr.
3. Absaugen Plasma vorsichtig über eine Mikropipette in bleach hinzuzufügen, und entsorgen in biologischer Abfälle.
4. Füllen Hämatokrit Rohr markierte Zeile (ursprüngliche Niveau von Plasma) mit 150 mM NaCl-Lösung. Cap und invertieren ein paar Mal vorsichtig mischen. Zentrifugation bei 500 xg für 5 min.
5. Wiederholen Sie Schritt 2,3-2,4 an Blutzellen wieder waschen. Dann saugen übernatürlichenant und ersetzen mit PBS bei pH 7,4. Invertieren mischen.
6. Split Blut gleichmäßig in vier Rohre, die der jeweiligen pH, die getestet werden soll. Kennzeichnen der Rohre nach jedem pH zu testenden (5.6, 6.2, 6.8, 7.4).
7. Zentrifuge Blut Röhrchen bei 500 xg für 5 min. Markieren Sie Ebenen an Rohren, dann absaugen Überstand.
8. Füllen Sie jedes Rohr markierte Zeile mit Puffer geeigneter pH-Wert (wie in 2,6 angegeben).
9. Etikett vier 50 ml konischen Röhrchen (eine pro pH-Test) und Pipette 49 ml PBS des geeigneten pH-Wertes in jeden konischen Rohrs.
10. 1 ml Erythrozyten (gleichen pH) in entsprechende Rohr für einen 1:50-Verdünnung. Sichtprüfung der verdünnten Blut, das trübe und sollte werden niederlassen, wenn sie ungestört. Wenn kein Pellet Formen haben Zellen lysiert.

3. Lysis Assay 96 Well Plate Setup und Quantifizierung

1. Stammlösungen aller experimentellen Drug-Delivery-Agenten, bei 20x die gewünschte Endkonzentration getestet werden (Assaywerden 10 ul von Drug-Delivery-Agent + 190 ul verdünnte roten Blutkörperchen, was zu einer 1/20 Verdünnung des ursprünglichen Drug-Delivery-Agenten in die endgültige Testansatz) nehmen. Stocks von 20, 100 und 800 Mikrogramm / ml vorgeschlagen, was zu abschließenden Test Konzentrationen von 1, 5 und 40 ug / ml.
2. Pipet 10 ul jeder Stammlösung in V-96-Well-Platten. Für optimale Ergebnisse, laden jede Probe in dreifacher oder vierfacher.

Hinweis: Der Einfachheit, wird empfohlen, dass eine separate 96-Well-Platte für jedes pH sollte vorbereitet sein, getestet, mit jeder Probe werden (bei ​​jeder Konzentration) geladen bei n = 3-4 pro Platte.

3. Für positive Kontrollvertiefungen, mit 10 ul 20% Triton X-100.
4. Für negative Kontrollvertiefungen, fügen Sie 10 ul Phosphatpuffer. Verwenden Puffer bei gleichem pH getestet werden.
5. Pipet 190 ul verdünnte Erythrozyten (siehe 2,10) in jede Vertiefung, um sicherzustellen, Zelle Stammlösung bleibthomogenes während der Übertragung. Hinweis: Verwenden Sie Mehrkanal-Pipette, um diese Aufgabe zu vereinfachen.
6. Inkubieren Platten bei 37 ° C für eine Stunde (Optional: Verwenden Sie einen Orbitalschüttler oder Wippe).
7. Zentrifuge Platten für 5 min bei 500 xg zu pelletieren intakte Erythrozyten. Hinweis: Beim Entfernen der Platte aus der Zentrifuge und der Transport zum nächsten Schritt, pfleglich zu behandeln und sicher sein, nicht auf das Zellpellet zu stören.
8. Mit einer Mehrkanalpipette, dann 100 ul Überstand aus jeder Vertiefung in eine klare, mit flachem Boden 96-Well-Platte. Hinweis: Wenn das Zellpellet versehentlich für jede Probe (n) gestört, kann man erneut zentrifugieren Platte und fahren Sie dann mit Überstand Transfer.
9. Messen Absorption der Überstände mit einer Platte Leser. Beachten Sie, dass ein Bereich von Wellenlängen verwendet werden (400 - 541 nm) sein.

HINWEIS: Verschiedene Platereader unterschiedliche Sättigung Punkte und Empfindlichkeiten haben, so dass die Wahl der Wellenlänge für michaßangaben davon abhängt, ob oder nicht die Hämolyse von Daten von experimentellen Proben zuverlässig gegen maximale Hämolyse normalisiert werden, wie durch Detergensbehandlung induziert. Dies erfordert eine genaue Messung der Absorptionswerte der positiven Kontrollproben.

10. Mit Microsoft Excel oder einer ähnlichen Software zur Datenanalyse, den Durchschnitt der Hintergrundabsorption Lesungen aus den negativen Kontrollproben für jeden pH-Wert (Schritt 3,4) eingestellt. Subtrahieren diesem Hintergrund Extinktionswert von allen anderen Proben, die bei diesem pH-Wert gemessen wurden.
11. Nach Subtraktion des Hintergrunds, finden die durchschnittliche Absorption der positiven Kontroll-Waschmittel-behandelten Proben (Schritt 3,3). Dann normalisieren alle experimentellen Daten zu dieser Extinktionmittelwert, was sollte 100% Hämolyse darstellen. Schließlich multiplizieren jede Kavität Wert mit 100% bis% Hämolyse, die in jeder einzelnen Vertiefung relativ zu dem Detergens Kontrolle aufgetreten berechnen.

Ergebnisse

Typischerweise weisen die Mittel, die idealen pH-abhängigen hämolytischen Verhalten zeigen das höchste Potenzial für cytosolische Abgabe von Medikamenten, Nukleinsäuren oder anderen bioaktiven Molekülen. Dies wird durch Agent # 1 beispielhaft dargestellt, wie in Abbildung 2, die minimale Hämolyse bei pH 7,4 zeigt dargestellt, aber ein starker Anstieg der hämolytischen Verhalten bei endosomalen pH-Bereichen (<6.5). Einige Mittel können ein erhebliches Maß an hämolytisch Verhalten bei physiologis...

Diskussion

pH-empfindlichen Polymeren oder anderen Mitteln zur endosomolytischen Funktion konstruiert sein kann rasch und effektiv bezogen auf die Lyse der roten Blutzellen bei pH-Werten im Endosom angetroffen (Abbildung 1 gescreent; pH 6,8 - frühe Endosom, pH 6,2 - späte Endosom, pH 5,6 - Lysosom). ^14-17 pH-abhängigen Hämolyse wurde verwendet, um die Fähigkeit von Trägern zu endosomalen Freisetzung biomakromolekulare Therapeutika (z. B. Peptide, siRNA, ODNs, Proteine) vermitteln screenen, und ...

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes	Fisher Scientific	22-253-145	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Blutentnahmekanülen, 20,5-Gauge	Fisher Scientific	02-665-31	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter	Fisher Scientific	22-289-953	Für die Blutentnahme
BD Marke Isopropylalkohol Swabs	Fisher Scientific	13-680-63	Für die Blutentnahme
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet	Fisher Scientific	02-657-6	Für die Blutentnahme
Salzsäure (konz.)	Fisher Scientific	A144-500	Zur Einstellung des pH der D-PBS.
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Positive Kontrolle
Dulbecco PBS	Invitrogen	14190
Nalgene MF75 Sterile Bottle-Top-Filter-Einheit mit SFCA Membrane	Fisher Scientific	09-740-44A
BD 96-Well-Platten mit flachem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol	Fisher Scientific	08-772-2C	Für plattenförmige Lesung am Ende des Assays.
BD 96-Well-Platten, mit rundem Boden, Gewebekultur-behandelten Polystyrol	Fisher Scientific	08-772-17	Für die Inkubation von roten Blutkörperchen mit den experimentellen Mitteln.