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Methodenartikel

Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

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⸱

DOI:

10.3791/50181

⸱

1. Dezember 2013

 , 
1Department of Microbiology & Immunology, Medical University of South Carolina

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Implantation von Krebszellen in das Ursprungsorgan als nützliches präklinischen Modell, um neue Therapien zu evaluieren zu dienen. MB49-Blasenkarzinomzellen in der Blase nach intravesikale Instillation gezüchtet werden. Dieses Protokoll zeigt, Katheterisierung der Blase der Maus für die Zwecke der Tumorimplantation und adenoviraler Lieferung.

Zusammenfassung

Blasenkrebs ist die zweithäufigste Krebserkrankung des Urogenitaltraktes und neue therapeutische Ansätze, die eine Wiederkehr zu reduzieren und das Fortschreiten benötigt werden. Der Tumor-Mikroumgebung wesentlich beeinflussen können Tumorentstehung Antwort. Es ist daher oft wünschenswert, um Tumorzellen in das Organ, von dem sie stammen, zu wachsen. Dieses Protokoll beschreibt eine orthotope Modell von Blasenkrebs, in der MB49 murinen Blasenkarzinom-Zellen werden über Katheter in die Blase instilliert. Erfolgreiche Implantation der Tumorzellen in diesem Modell erfordert Unterbrechung des Schutz Glycosaminoglycan Schicht, die durch physikalische oder chemische Mittel erreicht werden können. In unserem Protokoll die Blase mit Trypsin vor der Zell Instillation behandelt. Katheterisierung der Harnblase kann auch zur Therapie liefern, sobald die Tumoren etabliert werden wird. Dieses Protokoll beschreibt die Bereitstellung eines adenoviralen Konstrukts, das ein Luciferase-Reporter-Gen exprimiert. Während our-Protokoll wurde für den Kurzzeitstudien optimiert und konzentriert sich auf die Gen-Lieferung, die Methodik der Maus Blasenkatheter hat breite Anwendungen.

Einleitung

Blasenkrebs ist die zweithäufigste Krebserkrankung des Urogenitaltraktes mit fast 75.000 Neuerkrankungen und 15.000 Todesfällen im Jahr 2012 1 erwartet. Hohe Rezidivraten erfordern lebenslanges Follow-up, die Blasenkrebs eines der teuersten Krebsarten behandelbar machen. Blasenkrebs, die die Muskelschicht eingedrungen hat, kann zu Leber-, Lungen-oder Knochen über das Lymphsystem metastasieren. Multimodale Therapie von fortgeschrittenen Tumoren führt nur zu 20-40% Überlebensrate nach 5 Jahren. Daher sind effektive Behandlungsstrategien zur Verringerung des Wiederauftretens und Progression der oberflächlichen Blasenkrebs sowie die Verbesserung der Therapieergebnisse bei Patienten mit fortgeschrittener Krankheit abzielen dringend erforderlich.

Entwicklung neuartiger Therapeutika erfordert präklinischen Modellen zur Beurteilung der Wirksamkeit nach der ersten in-vitro-Beurteilung. Der Tumor-Mikroumgebung wesentlich beeinflussen können Krebsentwicklung und Reaktionsfähigkeit, die die Notwendigkeit für Präklinik hebtal Modelle, in denen Tumoren entstehen oder in der Ursprungsorgan eingerichtet werden. Ein Ansatz ist die Entwicklung von transgenen Modellen, in denen Tumore spontan auftreten oder können in einer organspezifischen Weise induziert werden. Eine hervorragende Protokoll einer transgenen Blasenkrebs-Modell wurde vor kurzem veröffentlicht 2. Der Nachteil von transgenen Modellen ist, dass Tumoren neigen dazu, langsam und mit weniger Einheitlichkeit als gewünscht zu entwickeln. Darüber hinaus hat die Kosten der Aufrechterhaltung einer Zuchtkolonie zu berücksichtigen. Eine Alternative zu transgenen Modellen orthotope Implantation von Tumorzellen, die den Vorteil der kurzen Zeitrahmen für die Tumoretablierung im Handel erhältlich Mäusen hat. Während einige menschliche Blasenkarzinom Zelllinien können orthotopisch gezüchtet werden (die wir erfolgreich verwendet UM-UC-3), kann es wünschenswert sein Tumoren in immunkompetenten Mäusen zu etablieren. Zwei murinen Blasenkrebszelllinien, die orthotop wachsen MBT-2 und 3 MB49. Da MBT-2-Zellen mit replizierenden verunreinigtTyp C Retrovirus 4, haben wir MB49-Zellen, die für unsere Untersuchungen ausgewählt. Es ist wichtig zu beachten, daß MB49-Zellen wurden aus einer männlichen Maus isoliert und orthotope Implantation sind aus anatomischen Gründen in weiblichen Mäusen durchgeführt. Dies hat den Vorteil der einfachen Identifizierung der implantierten Zellen durch Marker des Y-Chromosoms, aber die Fehlanpassung Geschlecht kann ein Nachteil für immunologische Untersuchungen sein.

Die Blase Epithel wird durch eine Glycosaminoglycan (GAG)-Schicht, die als Barriere für eine Infektion durch Mikroorganismen fungiert ausgekleidet. Diese Barriere kann auch mit der Implantation der Tumorzellen und mehrere Verfahren stören entwickelt worden, um diese Schwierigkeit zu (Tabelle 1) zu überwinden. Elektrokauter wurde ausgiebig als physikalische Mittel, um die GAG-Schicht 5-13 und ein Protokoll zeigt, Elektrokauter hat vor kurzem in JoVE 14 veröffentlicht worden stören eingesetzt. Allerdings sollte ein Elektrokauter Gerät nicht verfügbar sein, bedeutet, um die chemischen G zerstörenAg-Schicht, wie Silbernitrat oder Poly-L-Lysin kann auch verwendet werden, 15-24. Tumoren wirksam durch eine kurze Belichtung der Blase auf ein kleines Volumen von Silbernitrat fest (5-10 ul 0,15-1,0 M, ~ 10 Sekunden) oder länger Kontakt mit Poly-L-lysin (100 ul 0,1 mg / ml 20 min) (Tabelle 1). Hier beschreiben wir eine Methode, die Trypsin verwendet, um die Implantation von MB49-Zellen zu erleichtern.

In einem Versuch, therapeutische Ansätze für Blasenkrebs zu verbessern, hat die Gentherapie erhebliche Aufmerksamkeit erregt. Aus klinischer Sicht ist Blasenkrebs ein ideales Ziel für die Gentherapie durch die einfache Zugänglichkeit der Orgel und die Möglichkeit, vor Ort die Nutzlast liefern. Virale Vektoren, die für Blasenkrebs Gentherapie erforscht worden sind, schließen eine onkolytischen Herpes-simplex-Virus 25, 26 Retrovirus, Kanarienpockenvirus 27, Vaccinia-Virus, AAV und adenoviruS 28. Im zweiten Teil des Protokolls, beschreiben wir ein Verfahren für die virale Liefer, die praktisch identisch mit der Instillation der Tumorzellen ist. Von Interesse in unserem Labor ist die Entwicklung von neuartigen Ansätzen zur Gen-Lieferung, die wir beurteilen, über Biolumineszenz mit einer Adenovirus-Vektor, der ein Transgen Luciferase ausdrückt. Jedoch kann die Methodik der Blasenkatheter zur Abgabe von verschiedenen Mitteln verwendet werden und hat daher eine breite Anwendbarkeit.

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Protokoll

Alle Verfahren, die Tiere sind überprüft worden und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Medizinischen Universität von South Carolina genehmigt. Das Protokoll wurde unter USDA Kategorie D für Schmerzen zugelassen.

1. Zellimplantation

  1. Zwei Tage vor der Durchführung des Verfahrens, Platte 1 x 10 6 Zellen in MB49-T-25-Kolben. Verwenden DMEM high glucose, ergänzt mit 10% FBS (und Antibiotika, falls gewünscht). Ein Kolben ist ausreichend für jede Gruppe von bis zu fünf Mäusen, die betäubt und parallel implantiert wird.
  2. Am Tag des Verfahrens, bereiten Trypsin zur Instillation durch Verdünnen 0,25% sterile Gewebekulturqualität Trypsin zu 0,125% mit sterilem DMEM Grundmedium (1:2 Verdünnung). 1,2 ml ist ausreichend für 10 Mäuse. Legen Sie in einem 37 ° C im Wasserbad ins Gleichgewicht.
  3. Vorwärmen ein Heizkissen und positionieren Sie es unter den Raketenspitzen des Narkosesystem, das verwendet wird, um i liefern werdensoflurane. Legen Sie eine saubere, saugfähige Unterlage über das Heizkissen.
  4. Zeigen Mäuse in die Induktionskammer des Anästhesiesystem und induzieren Anästhesie mit 3% Isofluran. Bei Mäusen haben Bewusstsein, das durch den Verlust der Zehen-Prise Reflex prüft verloren geht, übergeben sie an die Raketenspitzen. Stellen Sie sicher, dass jedes Tier in Rückenlage und richtig auf dem Heizkissen gelegt, um die Körpertemperatur aufrecht zu erhalten.
  5. Reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration auf 2% bis Narkose aufrecht zu erhalten.
  6. Bewerben Augensalbe in beide Augen, um ein Austrocknen zu verhindern.
  7. Optionaler Schritt: Entfernen Bauch Haar. Haar auf dem Unterleib muss entfernt werden, wenn in-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung durchgeführt werden kann.
    1. Eine großzügige Schicht von Enthaarungscreme wie Veet, auf den niedrigsten Platz 1 in der Fell am Bauch, kümmert sich nicht um die äußeren Genitalien zu treten. Warten Sie 3 min.
    2. Entfernen Sie Haare durch Reiben Sie den Bereich mit einem trockenen Schwamm, und dann mit einem feuchten Schwamm, um die Haut zu reinigen. Einmal wiederholen, falls erforderlich.
  8. Katheterisierung der Harnblase
    1. Schmieren Sie eine neue, sterile 24 G pädiatrischen Venenkatheter mit einem nicht reizenden Gleitgel wie KY. Entfernen und Entsorgen der Nadel. Wenn Austreten von Flüssigkeit um den Katheter ist ein häufiges Problem, dh. es tritt häufiger als in einem von zehn Mäusen, größere Bohrung Katheter (20 G) verwendet werden. Dies kann ein wichtiger Gesichtspunkt bei Mäusen älter als 8 Wochen.
    2. Halten Sie die Nabe des Katheters, verwenden Sie den Daumen und Zeigefinger der anderen Hand auf die Hinterbeine der Maus verbreitet und setzen die Harnröhrenmündung. Den Katheter vorsichtig in die Harnröhre in einem 45 °-Winkel, die Änderung der Winkel, um ein parallel mit der Bank, um sie vollständig einfügen.
    3. Nach dem vollständigen Einführen des Katheters leicht anheben, indem sie es auf die Bank parallel und visuell zu bestätigen, dass sie in der Harnröhre und nicht die Vagina, die nachstehend es platziert wird. Wenn richtig positioniert, wird der Katheter in der Lage zu sein,vollständig eingeschoben, da die Vagina ist kürzer als der Harnröhre.
    4. Reduzieren Sie die Isofluran-Konzentration auf 1%.
  9. Bringen Sie einen Tipp zu einem P200 Pipette und Urin aus der Blase zu entfernen, indem Saugwirkung auf das äußere Ende des Katheters. Verbleib Urin von der Nabe des Katheters. Entsorgen Urin und lassen Katheter an Ort und Stelle.
  10. Vorsichtig pipettieren, 80 ul 0,125% Trypsin-Lösung in die Nabe des Katheters Luftblasen vermeiden. Bringen Sie eine 1 ml Luft gefüllten Spritze mit dem Katheteransatz und den Kolben langsam drücken 0,1-0,2 ml, um das Trypsin in die Blase zu liefern.
  11. Lassen Sie die Spritze und Katheter-Anordnung an Ort und Stelle für 15 min. Wiederholen Sie die Schritte 1,8-1,11 für jede der verbleibenden Mäuse anästhesiert (bis zu 4). Fahren Sie mit dem nächsten Schritt während der Wartezeit. TIPP: Zunächst kann es hilfreich sein, jemand anderes die Zellen (Schritt 1.12) vorzubereiten.
  12. Bereiten MB49-Zellen für die Implantation. Zellen wurden bei 1 x 10 6 pro T-2 plattiert5 Kolben 48 Stunden vor der Implantation (Schritt 1.1).
    1. Entfernen Sie das Medium, und fügen Sie 500 ul von 0,25% Trypsin in den Kolben. Wenn Zellen lösen 5 ml komplettem DMEM, um Zellen zu resuspendieren. Entfernen Sie ein 50 ul Aliquot zu zählen, und den Rest Zentrifuge bei 1.000 rpm für 5 min. Während der Zentrifugation Schritt weiter 1.12.2 und 1.12.3 Schritte.
    2. Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Berechnen Sie die Zellen / ml. Errechnet die an das Zellpellet bis 4 x 10 6 Zellen / ml (2 x 10 5 Zellen pro 50 &mgr; l) Volumen zu bringen.
    3. Überstand abgießen von Zellen zentrifugiert und das Pellet in DMEM Grundmedium mit dem erforderlichen Zellen auf 4 x 10 6 Zellen / ml (wie in Schritt 1.12.2 berechnet) Volumen auszusetzen. Halten Zellen bei Raumtemperatur.
  13. Wenn die 15 Minuten-Zeitpunkt für Trypsin Behandlung von Blasen erreicht ist, nehmen Sie den Luftspritze aus dem Katheter wobei der Katheter an Ort und Stelle. Gesamte Trypsin werden normalely fließen zurück durch den Katheter. Entfernen Sie alle restlichen Trypsin aus der Blase durch Absaugen mit dem P200-Pipette, wie in Schritt 1.9 oben und entsorgen.
  14. Unmittelbar Je 50 ul der Zellsuspension MB49 in die Nabe des Katheters. Befestigen Sie die 1 ml Luft gefüllte Spritze an der Nabe des Katheters und liefern die Zellen in die Blase durch langsames Drücken Sie den Kolben 0,1-0,2 ml. Wiederholen Sie diesen Schritt bis zu vier weitere Male, um alle fünf Mäuse implantieren. Verwerfen Sie Zellen.
  15. Verlassen der Katheter-Spritze Montage an Ort und Stelle, damit sich die Zellen in der Blase für 50 min verweilen.
  16. Aus der Harnröhre zurückziehen vorsichtig die Katheter-Spritze Montage. Drehen Sie die Isofluran-Konzentration auf Null und bewegen Jede Maus ein oder zwei von der Nasenkegel auf dem Heizkissen erholen Zoll.
  17. Wenn eine Maus hat seine Aufrichtungsreflexes wieder, bringen Sie es in seinen Käfig.

2. Intravesikale Lieferung von Adenovirus (8 Tage nach der Implantation von Zellen)

ACHTUNG: Dieser Teil der Adenovirus-Protokoll verwendet, die ein infektiöses Agens ist und sollte unter strenger BSL2 Leitlinien behandelt werden (http://oma.od.nih.gov/manualchapters/intramural/3035/).

Alle Verfahren mit Infektionserregern durchgeführt wurden von der Institutional Biosafety Committee der Medical University of South Carolina genehmigt.

  1. Acht Tage nach der Implantation Mäuse mit MB49-Zellen, überprüfen Hämaturie. Pick-up einzelner Tiere über einem weißen Stück saugfähiges Papier und drücken Sie vorsichtig auf den Bauch, um Tropfen Urin auf das Papier tupfen. Urin, die rosa bis rot ist, zeigt Hämaturie und ist ein Zeichen dafür, dass Tumoren festgestellt haben. Tumoraufnahmerate mindestens 80% und mit ausgezeichneter Technik kann so hoch wie 100% sein.
  2. Auftauen adenoviralen Lager auf Eis und in sterile, Raumtemperatur PBS verdünnt auf 10 9 PFU/50 ul (2 x 10 10 PFU / ml).
  3. Anesthetize Mäusen, wie oben beschrieben, in Schritten von 1,3 bis 1,6.
  4. Katheterisieren Mäuse wie in den Schritten 1.8 beschrieben und Urin zu entfernen, wie in Schritt 1.9
  5. Nach dem Urin entfernt wird, unmittelbar Je 50 ul der Virussuspension in die Nabe des Katheters. Befestigen Sie die 1 ml Luft gefüllte Spritze an der Nabe des Katheters und liefern das Virus auf die Blase durch langsames Drücken Sie den Kolben 0,1-0,2 ml.
  6. Verlassen der Katheter-Spritze Montage an Ort und Stelle, kann sich der Virus in der Blase für 40 Minuten verweilen.
  7. Zurückzutreten vorsichtig die Katheter-Spritzenaufbaus aus der Harnröhre, und entsorgen in 10% Bleichmittel-Lösung, um alle verbleibenden Virus inaktivieren.
  8. Drehen Sie die Isofluran-Konzentration auf Null und bewegen Jede Maus ein oder zwei von der Nasenkegel auf dem Heizkissen erholen Zoll.
  9. Wenn eine Maus hat seine Aufrichtungsreflexes wieder, bringen Sie es in seinen Käfig.
  10. Mark Käfige, dass Mäusen zeigen, haben mit Adenovirus eingeflößt. Virus für mehrere Tage in den Käfig Bettwäsche vergossen werden und alle Käfige und Bettwäsche müssensachgemäßer Handhabung und desinfiziert.

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Ergebnisse

Hämaturie ist in fast alle Mäuse innerhalb von 8 Tagen nach der Implantation von 200.000 MB49-Zellen beobachtet. Wie in Abbildung 1 gezeigt, Blasengewicht mehr als verdoppelt von 34,7 ± 3,3 mg (Bereich 31 bis 37 mg, n = 4) in nontumor tragenden Mäusen auf 87,5 ± 19,2 mg (Bereich von 77 bis 120 mg, n = 10) bei Mäusen, die wurden mit MB49-Zellen implantiert. In Bezug auf die Gen-Lieferung, fanden wir, dass die Abbildung Mäuse 24 Stunden nach der Virus Einträufeln ergibt ein stärkeres Signal als nach 48 h ...

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Diskussion

Die in diesem Protokoll beschriebenen primären Methodik ist Katheterisierung der Maus Blasen, die breite Anwendungen zur Instillation von Zellen oder der Agenten, für die lokale Zustellung in die Blase Epithel bestimmt hat. Die spezifische Protokoll oben skizzierten für Kurzzeitstudien (~ 10 Tage) optimiert. Implantieren der genauen Anzahl der Zellen ist kritisch, da eine höhere Anzahl von Zellen in schneller Tumorwachstum und möglicherweise Verlust von Tieren durch große Tumorbelastung führen. Mit 200.000 MB49-Zellen z...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde vom NIH R21 CA143505 Christina Voelkel-Johnson unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare

Name des Reagenzes

Firma

Katalognummer

Kommentare

6-8 Wochen alte weibliche Mäuse

Jackson Laboratories

Stammname: C57BL/6J

Lagernummer: 000664

Trypsin*

MediaTech

MT25-053-CI

Bezogen durch Fisher

DMEM*

MediaTech

MT10-017-CV

Gewonnen durch Fisher

>

FBS

Hyclone

SH30071.03

Hitzeinaktiviert

T25-Kolben*

Corning Costar

Corning Nr.:3056

Fisher: 07-200-63

Gewonnen durch Fisher

MB49 Zellen

N/A

N/A

Von Dr. Boehle (siehe Referenz11)

Puralube Vet Salbe*

Pharmaderm

Henry Schein Company

Nr.: 036090-6050059

Fisher: NC9676869

Bezogen durch Fisher

Enthaarungscreme: Veet

örtliche Apotheke

Gleitmittel:

K-Y Jelly

lokale Apotheke

Katheter*

Exel International

Exel International

Nr.:26751;

Fisher: 14-841-21

Bezogen durch Fisher

Isofluran

Terrell

NDC 66794-011-25

Bezogen über die Krankenhausapotheke

1 ml TB-Spritzen mit Aufsteckspitze

Becton Dickinson

BD309659

Fisher:14-823-434

D-Luciferin

Gold Biotechnologies

L-123-1

Ad-CMV-Luc

VectorBiolabs

1000; Fordern Sie eine großtechnische Amplifikation und CsCl-Aufreinigung für die Verwendung in in vivo an

Infektionserreger, der eine BSL2-Eindämmung erfordert

>

Steady-Glo  Luciferase Assay System

Promega

E2510 (10 ml), E2520 (100 ml) oder E2550 (10 x 100 ml)

*über mehrere Anbieter erhältlich

EQUIPMENT

Anästhesiesystem

E-Z Systeme, Euthanex Corporation

Anästhesiesystem: EZ7000

5-Port-Maus-Rückatmungsgerät: EZ109

Bezogen durch Fisher

>

Xenogen IVIS 200

Caliper Life Sciences

http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm

FLUOstar Optima

BMG Labtech

http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2

Referenzen

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Orthotope TumorimplantationKatheterisierung der Mäuseblaseadenoviraler GentransferLuciferase-Reporter-AssayTrypsin-Behandlung der BlaseInstillation von MB49-ZellenHämaturienachweisBildgebung bei kleinen Tierenvirale Genexpression
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