Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation

Summary

Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen

Abstract

Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen ¹ enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene ^2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder in wirbellosen erforscht.

Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung ^3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn ^5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.

Protocol

Diese Vorgehensweise ist im Einklang mit Yale IACUC Anforderungen. Wissenschaftler sollten sicherstellen, dass IACUC Richtlinien zugelassen sind und nach ihrer institutionellen Voraussetzungen gefolgt.

Ein. Abschnitt 1. Herstellung von DNA, Lösungen und Glaspipetten

1. Generieren hoher Reinheit (OD 260/280> 1,80) hoher Konzentration (ug / ul> 2,5) Endotoxin-freien DNA.
2. Planen 0,9% iger Kochsalzlösung und steril filtriert durch ein 22 pm-Filter.
3. Platz 10 cm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillarrohre (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in ein Modell PP-830 Narishige PC-10 Glaspipette Abzieher mit einem Kanthal Draht. Set ....

Results

Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation Ergebnisse bei der Etikettierung von fast allen radialen Gliazellen zusammenhängend mit dem Rücken, dorsal lateral und lateral Subventrikulärzone nach dem "Sweeping" Bewegung der Pinzette Elektrode (1E). Allerdings kann Elektroporation der Anforderung des jeweiligen Experiments zugeschnitten werden, aber nicht Fegen der Elektrode und unter Verwendung spezifischer Anordnung und Ausrichtung, wie in dem Video. Da beispielsweise dorsal örtlichen radialen Glia von .......

Discussion

Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptischer.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Schwere Polished Borosilikat Tubing	Sutter Instrument	BF150-110-10
Dual-Stage Glas Feinpipettenziehvorrichtung	Narishige	PC-10H
Fast Green	Fischer Scientific	0521192205
ECM 830 Square Wave Impulsgeber	Harvard Apparatus	45-0052
Tweezertrodes	Harvard Apparatus	45-0488
Fiber-Optic Light Source	Fisher Scientific	12-562-36
Tungsten HalogenLampe	USHIO America, Inc	1002247
Picospritzer II	Parker Instruments	052-0312-900