Wir zeigen eine minimal-invasive Technik genannt Neugeborenen Subventrikulärzone Elektroporation. Die Technik besteht aus Einspritzen Plasmid-DNA in den lateralen Ventrikel neonataler Welpen und Anlegen von elektrischem Strom zu liefern und genetisch zu manipulieren Nervenstammzellen
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Methodenartikel
Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Neurale Stammzellen (NSCs) säumen die postnatale Seitenventrikel und führen zu mehreren Zelltypen, die Neuronen, Astrozyten und Ependymzellen 1 enthalten. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die für NSC Selbsterneuerung, Engagement und Differenzierung ist entscheidend für die Nutzung der ihr einzigartiges Potenzial, um das Gehirn zu reparieren und besser zu verstehen Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Bisherige Verfahren zur Manipulation von Säugersystemen erforderte die zeitaufwendig und teuer Bestreben der Gentechnologie am Ganztier Ebene 2. Somit haben die meisten Studien die Funktionen des NSC-Molekülen in vitro oder in wirbellosen erforscht.
Hier zeigen wir die einfache und schnelle Methode, um Neugeborenen NPCs, die als Neugeborene subventrikulären Zone (SVZ) Elektroporation bezeichnet manipulieren. Ähnliche Techniken wurden vor einem Jahrzehnt zu embryonalen NSCs zu studieren entwickelt und unterstützt Studien über cortical Entwicklung 3,4. In jüngerer Zeit wurde dies angewendet zu studieren die postnatale Nager Vorderhirn 5-7. Diese Technik führt zu robusten Kennzeichnung von SVZ NSCs und deren Nachkommen. So bietet postnatalen SVZ Elektroporation eine Kosten-und Zeitaufwand effektive Alternative für Säugetierzellen NSC Gentechnik.
Protokoll
Diese Vorgehensweise ist im Einklang mit Yale IACUC Anforderungen. Wissenschaftler sollten sicherstellen, dass IACUC Richtlinien zugelassen sind und nach ihrer institutionellen Voraussetzungen gefolgt.
Ein. Abschnitt 1. Herstellung von DNA, Lösungen und Glaspipetten
- Generieren hoher Reinheit (OD 260/280> 1,80) hoher Konzentration (ug / ul> 2,5) Endotoxin-freien DNA.
- Planen 0,9% iger Kochsalzlösung und steril filtriert durch ein 22 pm-Filter.
- Platz 10 cm feuerpolierte Borosilikatglas Kapillarrohre (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm) in ein Modell PP-830 Narishige PC-10 Glaspipette Abzieher mit einem Kanthal Draht. Set ....
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Ergebnisse
Neonatal Subventrikulärzone Elektroporation Ergebnisse bei der Etikettierung von fast allen radialen Gliazellen zusammenhängend mit dem Rücken, dorsal lateral und lateral Subventrikulärzone nach dem "Sweeping" Bewegung der Pinzette Elektrode (1E). Allerdings kann Elektroporation der Anforderung des jeweiligen Experiments zugeschnitten werden, aber nicht Fegen der Elektrode und unter Verwendung spezifischer Anordnung und Ausrichtung, wie in dem Video. Da beispielsweise dorsal örtlichen radialen.......
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Diskussion
Hier im Einzelnen die Technik der neonatalen SVZ Elektroporation, eine Technik, um schnell und robust beschriften und manipulieren SVZ Stammzellen und deren Nachkommen. Es gibt mehrere Vorteile, die Elektroporation im Vergleich zu anderen Techniken aufweist. Erstens, da der Schwerpunkt Markierung von Zellen, ist man in der Lage zu Zelle autonom und nicht zellautonomen Effekte zu erkennen. Zweitens genetischen Manipulation unter Verwendung induzierbare Systeme ermöglicht es, Effekte vor oder nach Integration synaptischer.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Angaben zu machen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Department of Defense (Idea Development Award, W81XWH-10-1-0041, AB), CT Stammzell-Stipendium (AB), und eine National Institute of Health NRSA 10.668.225 (DMF) unterstützt. Das vorliegende Material basiert auf der Arbeit teilweise durch den Staat Connecticut unter dem Connecticut Stem Cell Research Grants Program unterstützt werden. Die Inhalte sind allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des Staates Connecticut, das Department of Public Health des Staates Connecticut oder CT Innovations, Inc. hatte die Geldgeber keine Rolle in der Studie, Datenerhebung und Analyse, E....
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| Schwere Polished Borosilikat Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glas Feinpipettenziehvorrichtung | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Impulsgeber | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten HalogenLampe | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
Referenzen
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in....
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Nachdrucke und Genehmigungen
