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Methodenartikel

Ein Zebrafisch Modell des Diabetes mellitus und Stoffwechselkrankheiten Speicher

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DOI:

10.3791/50232

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28. Februar 2013

 ,  , 
1Dr. William M. Scholl College of Podiatric Medicine, Rosalind Franklin University of Medicine and Science, 2Chicago Medical School, Rosalind Franklin University of Medicine and Science

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Metabolic Speicher ist das Phänomen, mit dem diabetischen Komplikationen fortbestehen und Fortschritte ungehinderten auch nach euglycemia pharmazeutisch erreicht. Hier beschreiben wir eine Diabetes mellitus Zebrafisch Modell, das einzigartig ist, dass es ermöglicht die Prüfung der mitotisch übertragbare epigenetische Komponenten des metabolischen Speicher In vivo.

Zusammenfassung

Diabetes mellitus betrifft derzeit 346 Millionen Menschen und wird dies voraussichtlich auf 400 Millionen im Jahr 2030 erhöhen. Evidence from Labor und großangelegte klinische Studien haben gezeigt, dass diabetische Komplikationen Fortschritt über das Phänomen des metabolischen Speicher, selbst wenn die glykämische Kontrolle pharmazeutisch erreicht ungehindert. Genexpression kann stabil durch epigenetischen Veränderungen, die nicht nur ermöglichen Zellen und Organismen, schnell auf sich ändernde Umweltbedingungen Reize reagieren verändert werden, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle auf "auswendig" diese stößt, sobald die Impulse entfernt wird. Als solche sind die Rollen, die diese Mechanismen spielen im Stoffwechsel Gedächtnisphänomen derzeit geprüft.

Wir haben vor kurzem die Entwicklung eines Zebrafisch-Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus berichtet und charakterisiert dieses Modell, dass diabetische Zebrafisch zeigen, zeigen nicht nur die bekannten Folgeerkrankungen einschließlich der Veränderungen verbundenmit diabetischer Retinopathie, diabetischer Nephropathie und Wundheilungsstörungen sondern weisen auch beeinträchtigt Schwanzflosse Regeneration. Dieses Modell ist einzigartig, da die Zebrafisch ist in der Lage, ihre beschädigten Bauchspeicheldrüse zu regenerieren und wieder einen euglykämische Zustand ähnlich zu dem, was nach der Transplantation menschlicher Patienten erwartet werden. Außerdem mehrere Runden der Schwanzflosse Amputation zur Trennung und Untersuchung von reinem epigenetische Effekte in einem in vivo System ohne potentiellen Komplikationsfaktoren vom vorherigen diabetischen Zustand erlauben. Obwohl euglycemia nach Pankreas-Regeneration erreicht wird, bleibt der diabetischen sekundäre Komplikation fin Regeneration und Haut Wundheilung auf unbestimmte Zeit. Im Fall der gestörte Flosse Regenerierung wird diese Pathologie auch nach mehreren Runden der Flosse Regeneration in den Tochterzellen Flosse Gewebe zurückgehalten. Diese Beobachtungen deuten auf eine zugrunde liegende epigenetischer Prozess bestehenden in der metabolischen Speicher Zustand. Hier präsentieren wir Ihnen die Methoden benötigt, um erfolgreich generate die Diabetiker und metabolischen Speicher Gruppen von Fischen und diskutieren die Vorteile dieses Modells.

Einleitung

Diabetes mellitus (DM) ist ein ernstes und zunehmendes gesundheitliches Problem, dass zu einer verringerten Lebenserwartung durch krankheitsspezifische mikrovaskulären (Retinopathie, Nephropathie, Neuropathie, Wundheilungsstörungen) und makrovaskuläre (Herzerkrankungen und Schlaganfall) Komplikationen 1. Einmal ausgelöst, diabetischen Komplikationen weiterhin Fortschritte ununterbrochenen selbst wenn Blutzuckerkontrolle 2,3 erreicht wird und dieses Phänomen wurde metabolischen Speicher oder den Legacy-Effekt bezeichnet. Das Vorhandensein dieses Phänomen wurde klinisch in den frühen 1990er Jahren als "The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT)" Fortschritte gemacht und hat seit durch mehrere zusätzliche klinische Studien 4,5,6,7,8,9,10 unterstützt erkannt, 11,12,13,14. Tiermodelle der DM wurden entscheidend für Entdeckungen im Zusammenhang mit der Pathophysiologie der diabetischen Komplikationen und Stoffwechselkrankheiten Speicher. In der Tat war die Persistenz von diabetischen Komplikationen zunächst in einem Hundemodell der diabetischen dokumentiertRetinopathie welche inzwischen von mehreren Linien der experimentelle Nachweis unter Verwendung einer Vielzahl von in-vitro-Kultur-Systeme und Tiermodellen 15,16,17,18,19,20,21 unterstützt. Diese Studien zeigen deutlich, dass eine anfängliche hyperglycemic Zeitraum führt zu einer dauerhaften Anomalien (einschließlich aberrante Genexpression) von Zielorganen / Zellen und mechanistisch das Engagement des Epigenom schlägt.

Epigenome bestehen aus allen Chromatinmodifikationen für einen gegebenen Zelltyp und sind verantwortlich für eine Zelle einzigartigen Genexpressionsprofils. Die Chromosomen-Modifikationen sind während der Entwicklung, Unterstützung Zelldifferenzierung dynamisch reagieren auf äußere Reize sind mitotisch stabil vererbt und 22,23 kann in Krankheit 24,25,26 verändert werden. Diese epigenetischen Mechanismen beinhalten: posttranslationalen Histon-Modifikationen, nicht-kanonischen Histon-Variante Aufnahme in octomers, Chromatin Zugang Veränderungen durch DNA-Methylierung und GenAusdruck Kontrolle durch nicht-kodierende micro RNAs 27,28,29,30. Insgesamt epigenetische Prozesse Zellen / Organismen sich schnell an verändernde Reize aus der Umwelt 31,32,33 reagieren können, sondern auch die Fähigkeit verleihen der Zelle zu "merken" diese Begegnungen, sobald der Reiz 23,22 entfernt. Daher wird, wie veränderter Genexpression, die aus Profilen epigenetische Prozesse in Abwesenheit des Signals (s), die sie initiiert sind stabil und werden durch Zellteilung vererbbare, haben sie große Interesse als Basiswert molekularen Mechanismen von menschlichen Erkrankungen einschließlich metabolischen Speichers gewonnen. Die Ergebnisse, die im Kontext von DM und Epigenetik parallel Fortschritte bei anderen Erkrankungen, dass eine Fülle von epigenetischen Veränderungen durch Hyperglykämie induziert verursachen bemerkenswerte Änderungen in persistente Transkriptionsnetzwerke von Zellen (besprochen in 34,35,36,37,38) abzeichnen.

Der Zebrafisch ist seit langem ein führender Modellorganismus zur study Entwicklung von Wirbeltieren jedoch in den letzten 15 Jahren ein exponentielles Wachstum bei der Nutzung dieses Organismus für das Studium der menschlichen Krankheit. 39 gesehen. Zebrafisch Modellen menschlicher Erkrankungen wurden eingerichtet überspannt eine Vielzahl menschlicher Erkrankungen einschließlich genetischer Erkrankungen und erworbenen Krankheit 40,41,42. Die vielen Vorteile des Zebrafisch gegenüber anderen Wirbeltieren Modell-Organismen sind die hohe Fruchtbarkeit, kurze Generationszeit, Transparenz durch frühen Erwachsenenalter verringert Wohnkosten und eine Reihe von Werkzeugen für die Gen-Manipulation. Darüber hinaus wurden aufgrund der umfangreichen Erhaltung der genetischen Signalwege und zellulären Physiologie unter den Wirbeltieren und die Fähigkeit, einen hohen Durchsatz Drogen-Screenings durchzuführen, hat der Zebrafisch erfolgreich für pharmazeutische Entdeckung verwendet.

Wir haben einen Erwachsenen Zebrafischmodell von Typ I-Diabetes mellitus, welche die diabetogene Droge, Streptozocin entwickelt. Wir haben dieses Modell gekennzeichnet zu zeigen, dass diabetische Zebrafisch nichtt zeigt nur die bekannten menschlichen sekundären Komplikationen, sondern darüber hinaus zeigen beeinträchtigten Extremität Regeneration (Schwanzflosse Regeneration) als Folge der Hyperglykämie Umwelt. Darüber hinaus haben wir berichtet, dass hyperglykämischen Zebrafisch wieder zurück zu normalen Glykämie innerhalb von 2 Wochen Medikament Entfernung aufgrund Regeneration von endogenen Betazellen des Pankreas, was zu einem physiologisch normalen glykämischen Zustand. Jedoch im Gegensatz dazu bleibt Schenkel Regeneration in dieser Fische beeinträchtigt im gleichen Umfang wie in der akuten diabetischen Zustand anzeigt, diese Komplikation auftritt und ist anfällig für metabolische Speicher. Die wichtigsten Impulse für die Erzeugung dieses Modells war es, ein System, um die mitotisch stabile epigenetische Komponenten, die den Stoffwechsel Gedächtnisphänomen unterstützt in der Abwesenheit von dem Hintergrundrauschen des vorherigen hyperglycemic Umgebung zu studieren bieten. Am Abschluß des Protokolls bereitgestellt hier die Zebrafisch oder selektive und Geweben, die durch jeden Assay geeignet ist, der verarbeitet werden kann Forschurchers braucht. Wir haben erfolgreich dieses Verfahren verwendet, um die genomweite anhaltenden Veränderungen in der DNA-Methylierung durch Hyperglykämie induziert, die im Stoffwechsel Speicherzustand 21 beibehalten werden zu identifizieren.

Wir glauben, dass diese Zebrafisch Modell vom Typ-I-Diabetes mellitus mehrere innovative Vorteile gegenüber anderen Modellsystemen für die Prüfung metabolische Gedächtnis hat. 1) Alle unsere Studien in vivo durchgeführt werden und wie das vorherige hyperglycemic Fisch euglycemia zurück durch Regeneration der endogenen Produktion von Insulin, sie benötigen keine exogenen Insulin-Injektionen. Daher vermeidet dies die kompliziert Spitzen und Täler der glykämischen Kontrolle in Tiere, die exogenen Insulins auftreten können. 2) Wie oben, der Hintergrund Stimulation aus der früheren diabetischen Zustand (dh die ständige Präsenz von fortgeschrittener Glykosylierung Endprodukte und reaktiven Sauerstoffspezies-Marker) werden eliminiert beschrieben und deshalb kann man die rein EPIG untersuchenenetic Faktoren des metabolischen Speicher. 3) Die Experimente können schneller durchgeführt werden, da es rund 80 Tage an Diabetes Induktion dauert, bis metabolischen Speicher Untersuchung. 4) Schwanzflosse Regeneration ist experimentell sehr zugänglich und ermöglicht eine einfache genetische und experimentelle Manipulation, für die gibt es eine Vielzahl von Werkzeugen. 5) Schwanzflosse Regeneration bietet eine sehr einfache und quantifizierbare Methode zur metabolischen Speicher beurteilen und daher für zukünftige Wirkstoffentwicklung ermöglichen.

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Protokoll

Alle Vorgänge werden nach den Richtlinien in "Principles of Laboratory Animal Care" beschrieben (National Institutes of Health Veröffentlichungs-Nr. 85-23, revidiert 1985) und der zugelassenen Rosalind Franklin University Institutional Animal Care durchgeführt und Verwenden Ausschuss Tier-Protokoll 08-19.

Es gibt 2 wichtige Abkürzungen, die in diesem Manuskript verwendet werden. 1) DM: bezieht sich auf Fische, die in einer akuten (300 mg / dl) hyperglycemic Zustand sind und für mindestens 3 Wochen. 2) MM: bezieht sich auf Fische, die 21 Tage waren (siehe Protokoll) DM Fisch und dürfen Blutzuckerkontrolle durch Pankreas-Regeneration wiederherzustellen. Dies wird in (14) Tagen von Drogen Entfernung erreicht. Die Fische werden MM Fische ab diesem Zeitpunkt berücksichtigt. Es ist auch wichtig, dass die Fische, die als Kontrolle bezeichnet werden beachten sind identisch wie DM oder MM Fische in Bezug auf die Anzahl der Injektionen (Kochsalzlösung only), der Inkubationszeiten bei den verschiedenen Temperaturen und der Anzahl und Zeitpunkt behandeltder Schwanzflosse Amputationen.

Ein. Generation von Zebrafisch mit Diabetes mellitus, DM Fisch

  1. Bereiten Sie sowohl Erholung und Anästhesie Wassertanks. Recovery Wasser normale Fische Wasser. Für Anästhesie Wasser hinzufügen ausreichend 2-Phenoxyethanol, so dass ein 1:1,000 Verdünnung in normalen Fisch Wasser erreicht wird.
  2. Vorbereiten einer 0,3% igen Lösung (in einer Abzugshaube) des Streptozocin (STZ) durch Zugabe von 6 mg STZ bis 2 ml 0,09% Natriumchlorid und sofort platzieren die Lösung auf Eis. Dies wird genügend Injektionslösung für die Injektion von etwa 20 Fische in 20 min. Wenn Sie die 20 Minuten-Marke überschreiten, stoppen und einen frischen STZ-Lösung bevor Sie fortfahren. In einem separaten Röhrchen Aliquot genug Salzlösung zur Steuerung Fisch. Sobald das STZ solubilisiert alle nachfolgenden Schritte erfordern keine Abzugshaube verwenden.
  3. Füllen Sie eine ½ cc Spritze mit einer 27 1/2 Gauge-Nadel mit den STZ-oder Control-Lösungen sicherzustellen, dass keine Luftblasen eingeschlossen ausgestattet sind.
  4. AnestheTize jeden Fisch einzeln, indem Sie den Fisch in der Anästhesie Wasser und warten, bis ihr Schwimmen Bewegung aufhört (1-2 min).
  5. Einmal betäubt kurz den Fisch auf ein Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu absorbieren, den Fisch in Wiegeschiffchen und messen die Masse der Fische.
  6. Legen Sie den Fisch auf eine feste Unterlage (Petrischalendeckel) zur Injektion.
  7. Injizieren die STZ-oder Kontroll-Lösung in die Bauchhöhle des Fisches durch Einsetzen der Nadel hinter der Fase in den posterioren Aspekt der ventralen Peritoneum.
  8. 0,35 mg / g (350 mg / kg) der STZ sollte jedem Fisch und dem Volumen der 0,3%-Lösung erforderlich ist, in der folgenden Weise berechnet werden zugestellt.
    1. Multiplizieren Masse von Fischen (g) von 0,35, die Menge des in mg STZ erforderlich ergeben.
    2. teilen das Produkt oberhalb von 3 erzeugt, um das Volumen der 0,3% Injektionslösung in ul erforderlich ergeben.
      Beispiel: Für eine 0,5 g Fisch: a) 0,5 x 0,35 = 0,175 b) 0,0175 / 3 = 0,058 ml= 58 ul.
      Das gleiche Volumen ohne STZ würde für ein Steuerelement Fisch injiziert werden. Ein Blatt für Volumina pro Fisch Masse spritzen sollen erzeugt und verwendet werden zum schnellen Nachschlagen.
  9. Nach der Injektion den Fisch in der Erholung Wassertank und überwachen sie für den normalen Schwimmen Aktivität. Sobald dies erreicht werden die Fische in einen normalen lebenden Tank, der bei der reduzierten Temperatur von 22 gehalten wird übertragen ° C - 24 ° C. Diese reduzierte Temperatur ist entscheidend für die effiziente Induktion von Hyperglykämie (Diabetes mellitus, DM).
  10. Obwohl Hyperglykämie in 24 h nach der ersten Injektion erfasst wird, um einen verlängerten Zustand sehr hohen Hyperglykämie induzieren der Zebrafisch erfordern eine häufige Injektion Induktionsphase gefolgt von wöchentlichen Wartung Injektionen wie unten gezeigt.

Woche 1: 3 Injektionen (Tag 1, 3, 5), Woche 2: 1 Injektion (Tag 12), Woche 3: 1 Injektion (Tag 19),
Woche 4: (Tag 21) FührenAssay von Interesse.

An diesem Punkt der Zebrafisch als in einem längeren Zustand der Hyperglykämie gewesen und zeigen die diabetischen Komplikationen der Retinopathie, Nephropathie und ebenfalls beeinträchtigt fin Regeneration. Diese werden als DM Fische. Zusätzlich wenn gewünscht die Fische können in der hyperglycemic Staat mit wöchentlichen Wartungsarbeiten Injektionen eingehalten werden. Etwa 5% der Tod während dieses Prozesses zu erwarten.

2. Blutentnahme und Nüchternblutzucker (FBGL) Bestimmung

  1. Jede Gruppe von DM und Kontrolle Fisch muss genug Fische, um genau zu bestimmen, die durchschnittliche FBGL der Gruppe als dieser Test erfordert diese Fische geopfert werden.
  2. Planen eines markierten PCR-Röhrchen für jede Blutprobe mit 5 ul sterilem normaler Kochsalzlösung.
  3. Für die Blutentnahme, betäuben Fische wie oben, entfernen Sie das gesamte Wasser, den Fisch auf einem Objektträger und mit einem Skalpell, entfernen Sie den Kopf des Fischesan der Basis des Verschlusses.
  4. Sammeln das Blut (bis zu 2 ul), die von den Fischen auf den Objektträger freigesetzt wird und schnell fügen Sie es dem 5 ul steriler physiologischer Kochsalzlösung und Abpipettieren um sicherzustellen, dass das Blut nicht verstopfen. Anschließend wird der Probe auf Eis.
  5. Ermitteln der Blutprobe Volumen durch Messen des Gesamtvolumens der Flüssigkeit (Blut Kochsalzlösung +) und dann Subtrahieren der 5 ul Salzlösung.
  6. Übertragen 5 ul des verdünnten Blut von jedem PCR-Röhrchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und bestimmen die Blutglukosekonzentration mit dem QuantiChrome Glucose Assay Kit. Dies wird durch folgende Protokoll des Herstellers ohne Ausnahme durchgeführt. Erwartete Ergebnisse: normal / Kontroll-Fische 60 mg / dl und DM Fisch 310 mg / dl.

3. Schwanzflosse Regeneration Studies

  1. Anesthetize Fischen im 1,0-1,4 beschrieben.
  2. Legen Sie den Fisch auf einer Petrischale Deckel und amputieren die Schwanzflosse in einer geraden Linie mit einer sterilen GrößeSkalpell 10 proximal zur ersten lepidotrichia Verzweigungspunkt während des Betrachtens durch die Flosse einem Präpariermikroskop.
  3. Lassen Sie die Fische als in 1,10 erholen, aber den Fisch bei 33 ° C für die regenerative Wachstumsphase des Assays. Dies ist eine festgelegte Temperatur für eine beschleunigte Regeneration fin-Analyse.
  4. Die Lamellen können jederzeit Beitrag Amputation abgebildet werden wir jedoch routinemäßig untersuchen die regenerative Wachstum bei 24, 28 und 72 Stunden nach trans-Abschnitt.
  5. Anesthetize Fisch als zuvor (siehe 1,0-1,4), den Fisch unter einem Binokular mit einer Kamera (wir benutzen eine Nikon SMZ-1500 mit einem Q-Imaging-Kamera ausgestattet) ausgestattet und sammeln Sie alle fin Bilder bei 1X Vergrößerung mit NIS-Elemente-Software . Die Flosse sollte für die Bildgebung verteilt werden, so dass sie vollständig ohne Dehnung oder Beschädigung des Gewebes verlängert und sollte frei von Wassertröpfchen. Aus Gründen der Konsistenz immer den dorsalen Seite nach rechts.
  6. Drucken Sie Bilder und messen die regenerative growth Bereich mit Image J Software und die Verwendung einer Zeichenblock. Trace um den gesamten Bereich des neuen Wachstums und bestimmen den Bereich. Jede Messung sollte fünf Mal gemacht und gemittelt werden, um die Genauigkeit der Rückverfolgung zu gewährleisten. Es ist wichtig, dass die Bilder nicht verwendet Schatten oder Wassertröpfchen zu Fehlern, da diese wirken in der Messung des Auswachsens Bereich.
  7. Messung der Länge des entlang der Amputationsstelle dorsal-ventralen Achse und unterteilen den Bereich in 3,6 durch diese Messung bestimmt. Dies ermöglicht Fische verschiedener Größen, um direkt miteinander verglichen werden.

4. Generation von Metabolic Memory (MM) Zebrafisch

  1. Starten Sie eine Gruppe von DM Fische und deren entsprechende Kontrollen, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
  2. 21 Tage bestimmen die FBGL für eine Teilmenge der Gruppe und teilen die DM Fische in 2 Untergruppen. Weiterhin wöchentliche Injektionen STZ für eine der Gruppen als DM Steuerelemente für die Dauer des Experiments. Cease STZ Injektion zur zweiten Gruppe und INCUBATe der Fisch bei normaler Temperatur. Innerhalb von 14 Tagen diese Zebrafisch wird wieder normale Blut Insulin und Glukose Kontrolle durch Pankreas-Regeneration. Diese Fische sind jetzt genannt MM (metabolische Speicher Fisch).
  3. Am Tag 30 nach Drogen Entfernen amputieren die Schwanzflossen der Kontrolle, DM und MM Fische über die Methode in 3.2 beschrieben.
  4. Zurück Fisch normales Wasser für fin Regeneration für 30 Tage. Dies ermöglicht das Wachstum dessen, was wir, metabolische Speicher Gewebe.
  5. Am Tag 60 führen eine zweite Amputation (wie unter 3.2 beschrieben) innerhalb des Gewebes, die in der Zeit von 30-60 Tagen wurde regeneriert und führen Sie die Schwanzflosse Regeneration Assay (3,1-3,7) Abbildung 1.
  6. Isolieren Gewebe und führen Assay von Interesse. Siehe Tabelle 1 für ein Protokoll Zusammenfassung.

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Ergebnisse

Typ I Diabetes Zebrafisch zeigen nicht nur die bekannten sekundären Komplikationen der Retinopathie und Nephropathie, aber auch, weisen eine zusätzliche Komplikation: eingeschränkter Schwanzflosse Regeneration. Diese späteren Komplikation besteht aufgrund metabolischer Speicher in Fische, die normale Blutzuckereinstellung restauriert wurden nach einer hyperglycemic Zeitraum. In 2A (Kontrolle) und 2B (metabolische Speicher) repräsentative Bilder der Regeneration Flossen, die bei 72 Stund...

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Diskussion

Diabetes mellitus ist eine Erkrankung des metabolischen Dysregulation, zunächst als Hyperglykämie, die letztlich ergibt Blutgefäß beschädigt, was zu vielen Komplikationen, die alle auch bestehen, nachdem euglycemia obwohl pharmazeutische Intervention erreicht wird diagnostiziert. Diese Persistenz von Komplikationen wird als metabolische Speicher und mehrere aktuelle Studien haben die Rolle, dass epigenetische Mechanismen spielen bei diesem Phänomen untersucht bezeichnet. Hier haben wir ein Protokoll, das für die Erzeugu...

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Offenlegungen

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch ein Forschungsstipendium aus dem Iacocca Family Foundation, Rosalind Franklin University Start-up-Fonds und National Institutes of Health Grants DK092721 (um RVI) unterstützt. Die Autoren möchten sich Nikki Intine für Beihilfen in Manuskripts danken.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Name des Reagenzes Firma Katalog-Nummer Kommentare (optional)
Streptozocin Sigma Aldrich S0130
2 Phenoxyethanol Sigma Aldrich P1126
Scalpel (Größe 10) Fisher Scientific 089275A
Petrischalen Fisher Scientific 08-757-13
½ cc Spritze mit 27 1/2 Nadel Fisher Scientific 305620
QuantiChrome glucose Assaykit. Bioassay-Systeme DIGL-100
Kochsalz Sigma Aldrich S3014
Seziermikroskop Nikon TMZ-1500 Jede Seziermikroskop ist in Ordnung.
Camera for Imaging Nikon Q Bildgebung Jede Kamera ist geeignet.
Image J Software National Institutes of Health NIH Image
NIS Elements Nikon Jede Bildbearbeitungssoftware geeignet ist.

Referenzen

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