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Ex utero Elektroporation und Whole Hemisphäre Explantate: A Simple Experimentelle Methode für Studien der frühen kortikalen Entwicklung

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DOI:

10.3791/50271

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3. April 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Physiology, SUNY Upstate Medical University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte Explantat Verfahren, das umfasst Ex utero Elektroporation, Dissektion und Kultur des gesamten zerebralen Hemisphären aus dem embryonalen Maus. Die Vorbereitung erleichtert pharmakologischen Studien und Untersuchungen von Genfunktionen in der frühen kortikalen Entwicklung.

Zusammenfassung

Kortikalen Entwicklung beinhaltet komplexe Interaktionen zwischen Neuronen und nicht-neuronalen Elemente, einschließlich Vorläuferzellen, Blutgefäße, Hirnhäute und die damit verbundenen extrazellulären Matrix. Weil sie eine geeignete organotypischen Umfeld zu schaffen, sind kortikale Schicht Explantate oft verwendet, um die Wechselwirkungen, die neuronale Differenzierung und Entwicklung steuern zu untersuchen. Obwohl von Vorteil, kann die Scheibe Explantat-Modell von Nachteilen einschließlich aberrante zelluläre Laminieren und Migration leiden. Hier berichten wir über eine ganze Gehirnhälfte Explantat für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, die einfacher herzustellen als kortikale Scheiben und zeigt konsistente organotypischen Migration und Laminierung. In diesem Modellsystem, frühe Laminierung und Migrationsmuster der Regel über eine Zeitspanne von zwei Tagen in vitro, einschließlich der Dauer der Vorbeschichtungszyklus Splitting, bei denen Interessenten Rindenschicht sechs Formen. Wir entwickelten eine ex utero Elektroporation (EUEP)Ansatz, ~ 80% Erfolg bei der Ausrichtung der GFP-Expression zu Neuronen entwickeln im dorsalen medialen Kortikalis erreicht.

Die ganze Hemisphäre Explantat Modell macht frühen kortikalen Entwicklung zugänglich für die Elektroporation, pharmakologische Intervention und Live-Bildgebung. Dieses Verfahren vermeidet die Überlebensrate Chirurgie in utero Elektroporation (IUEP) erforderlich ist, während Ansätze Verbesserung sowohl Transfektion und Flächendichte Targeting Konsistenz. Dieses Verfahren erleichtert experimentelle Untersuchungen von neuronalen Proliferation, Migration und Differenzierung.

Einleitung

Die Säugerzellen Großhirnrinde Formen durch den abgestimmten Proliferation, Migration und Differenzierung von nacheinander erzeugten Neuronen. Jedes Neuron in der ventrikulären Zone (VZ) geboren und wandert von der VZ in die Zwischenzone (IZ), Bilden des kortikalen Platte (CP) ein. Als sie durch die verschiedenen kortikalen Bereichen passieren, zeigen die Migration Neuronen mehrere Modi der Migration 2,3, die auf die extrazelluläre Umgebung und andere zelluläre Elemente (zB radiale Gliazellen) innerhalb des sich entwickelnden Gewebes ab. Kortikalen Neuronen dann verhaften Migration an der Spitze der bildenden kortikalen Platte in den zusammenfallenden Prozesse der neuronalen Migration Verhaftung und dendritogenesis 4.

Kortikalen Entwicklung zwischen embryonalen Tag 11-13 (E11-13) 5 durch die Einrichtung des Ur plexiformen Schicht 6 oder Vorbeschichtungszyklus (PP), eine Schicht des Pioniers Neuronen, die über der VZ eingeleitet. ProspektivSchicht 6 kortikalen Neuronen (dh die ersten kortikalen Neuronen im VZ geboren), dann orientieren ihre Somata in einem stereotypen Muster und verbinden sich zu einer deutlichen Schicht innerhalb des PP 7. Diese Ereignisse spaltete die Vorbeschichtungszyklus in eine oberflächliche marginal (zukünftige kortikale Schicht 1) und einer tiefen Zone, die letztere Plattenaufbau Zellen (transiente kortikale Schicht 7) zusammen. Dieser Vorgang, genannt Vorbeschichtungszyklus Spaltung, ist ein grundlegendes Ereignis in der Zukunft Wachstum der Großhirnrinde 8.

Viele genetische Mutationen identifiziert worden, die stören, die verschiedenen Aspekte der kortikalen Entwicklung 9. Kortikalen Entwicklung kann sich auch negativ durch die Exposition gegenüber aufgenommenen Gifte wie Kokain 10 und Alkohol 11 beeinflusst werden. Da kortikalen Fehlbildungen, die während der Entwicklung entstehen wahrscheinlich Beitragszahler neurologischen Erkrankungen (zB Autismus, Schizophrenie), sind empirische Untersuchungen von Störungen auf kortikalen Entwicklung inhärentenders wichtig. Es ist daher von großer Bedeutung, um Ansätze zu etablieren, um kortikalen Entwicklung, die eine schnelle Tests von genetischen oder Toxin Effekte erlauben die aber auch die Erhaltung der möglichen Wechselwirkungen zwischen differenzierenden Neuronen, andere Zelltypen und der extrazellulären Matrix (ECM) in dieser frühen Phase der Entwicklung des Gehirns 12 studierst .

Scheibe Explantate 13 haben ein solches System zur Verfügung gestellt und sind weit Assay kortikalen Neuronen Entwicklung 14-16 verwendet. Allerdings kann Slice Assays unter dem Nachteil, dass neuronale Migration und Laminierung kann als abnormal 17 möglicherweise durch die Zellen, die den meningealen entwickelnden Gehirns und der radiale Anker glialen Stützgerüst umgeben beschädigen leiden. Als radiale Gliafasern ein wichtiger Substrat für kortikale Neuronen Migration 18 Störung der Basallamina durch Schneiden sind lokal zu stören radialen Gliazellen Architektur und führen zu veränderten kortikalen Migration. Neben der SLIced Oberflächen Explantate stellt einen Bereich aus toten Zellen, die den normalen Zusammensetzung der ECM in diesen Bereichen verändert werden kann.

Neuere Ansätze haben ihre Analyse auf Zellen tief in der Scheibe, die durch geeignete gesunde Zelltypen und ECM umgeben befinden konzentriert. Jedoch kann in einigen Fällen diese neueren Ansätze können erfordern, dass die ursprüngliche Dicke kultivierten Slice Kryo-oder Paraffin-Schnitt geschnitten werden nach Fixierung, so daß die relativ normal Inneren der Scheibe zur Verfügung gestellt wird zur Analyse 19-21. Sowohl der ursprüngliche Vibratom Schneiden, um die Live-Scheiben für Kultur sowie der anschließenden Kryoschneiden von festen Scheiben für die Analyse vorzubereiten erfordern Sorgfalt und Mühe für diese Assays zu arbeiten.

Um einen einfachen, ergänzenden Ansatz für Studien der frühen kortikalen Entwicklung, haben wir modifiziert eine bestehende Scheibe Ansätze 13 Studien der frühen kortikalen Entwicklung zu erleichtern. Wir haben eine wh entwickeltole Hemisphäre Explantat-Modell ähnlich einem bestehenden E14 ganzen Hemisphäre Modell, das geschüttelte Kulturen bei 65 Umdrehungen pro Minute und erlaubt organotypischen Wachstum für 16-18 Stunden 22,23 involviert. In unserem Ansatz werden ganzen Hemisphäre Explantate auf semipermeable Membran 13 mit einem hohen Sauerstoff-Atmosphäre Kultur 21,24 angeordnet, um organotypischen kortikalen Wachstum für 48 Stunden verlängern. Dieser Ansatz ermöglicht eine konsistente Elektroporation entwickelt kortikalen Neuronen. Die Embryonen werden aus der Gebärmutter entfernt und elektroporiert, Plasmid-DNA einzuführen und die Telencephalon wird dann seziert. Jede Hemisphäre wird isoliert und medialen Seite nach unten auf eine Kollagen-beschichtete Filter. Das Explantat wird dann für einen Zeitraum von 48 Stunden, eine Periode, die Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 8 umfasst kultiviert. Während der Anzucht, entwickeln L6 Neuronen aus Vorläuferzellen zu unterscheiden Neuron 25, richtig positioniert in der kortikalen Platte. Während dieser Zeit ist die Entwicklung vonNeuron wird durch die entsprechende ECM und Zelltypen, die die entsprechende Zelle in vivo zu konfrontieren würde umgeben. Dieses System hat sich bereits in der Entschlüsselung der zellulären Vorgänge, die Ethanol Toxizität 26, Schicht 6 Bildung und Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung 7,25 zugrunde wertvoll.

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Protokoll

1. Ex utero Elektroporationen mit Green Fluorescent Protein Expression Plasmid

  1. Plasmid-DNA werden mit Injektionslösungen CAG-eGFP DNA 27 verdünnt, um die endgültige Arbeitskonzentration von 0,33 mg / ml in ddH 2 O zubereitet Endo-Free Qiagen Maxi-Präparationen verwendet werden, um das Plasmid aus den transformierten Bakterien zu reinigen. Schnelle grünen Farbstoff bei ~ 0,02% (w / v endgültige) mit der DNA-Lösung als Injektion Tracer zugegeben.
  2. Um den OP-Bereich vorzubereiten, abspritzen Labor-und Binokular Bühne mit einer 70% igen Ethanol-Lösung und trocken wischen. Sprühen chirurgische Scheren und Zangen mit 70% Ethanol vor Dissektion und trocken wischen.
  3. Timed Schwangere Swiss / Webster Dämme auf E13 durch Überführung in eine Kammer mit CO 2 aus einer Druckflasche gefüllt und der Damm wird überwacht geopfert, bis alle Bewegung für mindestens 1 min gestoppt wurde. Nach der Tötung durch CO 2-Inhalation werden die Embryonen aus dem Uterus entfernt und ineine 10 cm Petrischale mit eiskaltem Hanks ausgewogene Salzlösung (HBSS).
  4. Sorgfältig sezieren jeden Embryo aus den umliegenden extraembryonalen Membranen und halten in eiskaltem HBSS.
  5. Übertragen jedes Embryo einzeln mit einem zweiten 10 cm Petrischale mit kaltem HBSS. Verwenden einer Hamilton-Spritze auf 2-3 ul der DNA schnell Grünmischung in den Ventrikel des linken Großhirnhemisphäre injizieren, wobei darauf zu in einer kortikalen Bereich räumlich getrennt von dem kortikalen Bereich für zukünftige Analysen injizieren.
  6. Um elektroporieren, halten den Embryo vorsichtig mit Pinzette und leicht zu platzieren die positive Paddel des Pinzette Elektrode auf der dorsalen Mittellinie des Kopfes zu platzieren und leicht die negative Paddel unterhalb des Embryos Kinn. Elektroporationen mit einem BTX830 Elektroporator programmiert zu fünf 30 V Impulse von 50 ms Dauer von 950 ms Intervalle getrennt liefern erreicht. Diese Einstellungen sind für die BTX830 Modell. Andere Systeme können nach Herstellerangaben instructio verwendet werdenns.

2. Whole Hemisphäre Explantatherstellung

  1. Nach der Elektroporation werden die Embryonen wieder in eiskaltem HBSS platziert. Das Gehirn wird entfernt, indem zwei # 5 Juwelier Zange, um die Haut und knorpeligen Schädels aus dem Embryo Kopf zu entfernen. Eine Pinzette wird dann rutschte unterhalb des Gehirns, um das intakte Gehirn aus dem Schädel zu entfernen. Das elektroporierte Halbkugel (links) wird dann von dem Gehirn seziert und die angeschlossenen mittleres Hirngewebe entfernt wird. Während der Dissektion Verfahren wird darauf geachtet, nicht zu beschädigen die Hirnhäute, die über dem linken kortikalen Hemisphäre.
  2. Sobald seziert jeder Embryo in HBSS mit einer Pipette mit einem Schnitt 1 ml Pipettenspitze übertragen wird. Die Halbkugel wird vorsichtig auf ein Kollagen beschichteten Kulturplatten Einsatz vertrieben. Bis zu sechs Hemisphäre Explantate medialen Seite angeordneten sich auf jeweils 24 mm Einsatz. Einmal angeordnet, überschüssiges HBSS wird von dem Einsatz entfernt und der Einsatz wird dann in eine 35-mm-Well einer 6-Well-Schale gegeben. Der Brunnen enthält exactly 2,7 ​​ml Medium: DMEM-F12 Medium mit Glutamax und ergänzt mit 2% B-27, 1% G5 und 1% Penicillin-Strep. Ein paar Tropfen der Medien aus dem Brunnen können übereinander Explantat pipettiert werden, aber nicht hinzufügen media über der ursprünglichen 2,7 ml pro Vertiefung.
  3. Sobald die Explantate auf Collagen Filter platziert wurden die 6 Well-Platte, welche die Explantate in eine Billups Rothenberg (BR) Kammer (das auch eine Schale mit Wasser befeuchtet) platziert. A 95% / 5% Sauerstoff / CO 2-Gasmischung in die Kammer für mindestens 1 min vor Abdichten der Kammer geschlossen und Abklemmen der 95% / 5% Sauerstoff / CO 2 Gaszufuhrrohr infundiert. Das BR Kammer wird dann in einem 37 ° C Inkubator für Gewebekultur den Rest der Kulturperiode, 1-2 DIV platziert.

3. Fixierung Explantatgewebe für die Histologie

  1. In einem Abzug vorbereiten Pagano Fixierung Lösung erster machende 8 g Paraformaldehyd in 100 ml vorgewärmtes (~ 80 & deg; C) ddH 2 O. Fügen Sie 1-3 Tropfen konzentrierte NaOH die Solubilisierung zu fördern und vorsichtig umrühren. Sobald solubilisiert mischen 8% Paraformaldehydlösung 1:1 mit einer Lösung, die 500 mM Saccharose, 100 mM Hepes, pH 7,4, 50 mM MgCl 2, 5 mM KCl für eine Endkonzentration von 4% Paraformaldehyd in 250 mM Saccharose 50 mM Hepes ist , 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4.
  2. Um dies zu beheben die Explantate erwärmen Pagano fix Lösung auf 37 ° C. Schnelles Entfernen meisten DMEM/F12 Medien aus jeder Kultur gut und 5 ml Pagano Fix zu jeder Vertiefung der Explantate. Achten Sie darauf, jedes Explantat vollständig bedecken in fix. Fix für 1 Stunde bei RT. Entfernen Sie nicht Explantate aus dem Filter vor 1 Stunde der Fixierung.
  3. Nach der Fixierung entfernen Pagano fix Lösung und ersetzen Pagano Lösung ohne fix (250 mM Saccharose 50 mM Hepes, 25 mM MgCl 2, 2,5 mM KCl, pH 7,4). Fügen Sie ein paar Tropfen 10% Natriumazid und bei 4 ° C bis Einbettung.

4. Einbettung und Sectioning für die Histologie

  1. Eine 10% ige Kalbshaut Gelatinelösung durch Solubilisieren 10 g Kalbshaut Gelatine in 100 ml warmem Wasser (55-60 ° C). Zeigen Gelatinelösung auf einer Heizplatte auf 60 ° C und wirbeln in regelmäßigen Abständen, bis solubilisiert.
  2. Gießen etwa 10 ml der 10% igen Gelatine-Lösung in den Boden einer 10 cm-Petrischale und erlauben 30 min zu verfestigen. Dadurch wird ein "pad" für die Einbettung der Explantate bilden. Diese Pads können vorbereitete Tage im Voraus und bei 4 ° C. Verwenden Sie ein Lineal, um ein Raster auf dem Boden der Petrischale zu ziehen und zu übertragen einzelnen Explantate in jedem Feld des Gitters. Rückstände von Pagano Lösung und mit einer Pipette auf jede Explantat mit warmen 10% igen Gelatinelösung und lassen sich zu verfestigen. Fortsetzen langsame Zugabe von Gelatinelösung, bis jede Explantat vollständig von Gelatine umgeben, dabei nicht um das Kissen durch die Zugabe von zu viel erwärmen Gelatine sofort schmilzt. Lassen Sie für die Gelatine zu härten für ~ 1 Stunde. Nach Aushärtung der einzelUAL Explantate können in kleine Blöcke von Gelatine geschnitten werden. Die Blöcke werden dann in Pagano-fixiert verfassen fix für 24-48 Stunden vor dem Schneiden mit einem Vibratom.
  3. Explantate in Gelatine Blöcke Riechkolben positioniert und geschnitten in der koronalen Ebene bei 100 mu m Dicke. Die Abschnitte werden gesammelt und in PBS + 0,1% Natriumazid bei 4 ° C bis immunhistochemische Verarbeitung. Gespeicherten
  4. Immunhistochemischen Nachweis erfolgt durch die Übertragung Abschnitten in eine 24-Well-Platte (2-3 Abschnitte pro Well) durchgeführt. Erster Block unspezifische Antikörperbindung durch Zugabe von 0,5 ml PBST + B (PBS + 0,5% Triton X 100 und 2% BSA) in jede Vertiefung, inkubieren 1 h unter leichtem Schütteln. Die entsprechenden primären Antikörper wird dann in PBST + B verdünnt und 0,4 ml pro Vertiefung wird für eine Inkubation über Nacht bei RT zugegeben. Der primäre erfolgt mit PBS 3X wäscht und für mindestens 10 min gewaschen. Der sekundäre Antikörper und 2 ug / ml Hoechst 33342 Nuklearfarbstoff werden dann in PBST + B verdünnt und die Proben werden für 2 h bei RT inkubiertunter leichtem Schütteln. Drei Wäschen PBS (10 min jeweils) werden durchgeführt und dann werden die Schnitte auf Objektträger unter Verwendung eines 90% Glycerin 50 mM Tris, pH 7,4, Eindeckmitteln montiert.

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Ergebnisse

Die embryonale Nager Cortex weist eine quer neurogenetischen Gradienten in der Entwicklungsphase ist, so dass seitliche Neocortex ungefähr 1 Tag reifer als dorsalen medialen Neocortex 28. Die Masse der Schicht 6 Neuronen so erzeugte (dh weisen ihre endgültige S-Phase) auf E12 in seitlichen Kortex (auch als Feld 40 5) und bei E13 in der dorsalen medialen Kortex (auch als Feld 1 5). Vorbeschichtungszyklus Aufspaltung beginnt etwa 1 Tag nach Layer 6 Neuron Generation und wird somit...

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Diskussion

Wir haben verbessert und ausgewertet eines experimentellen Modells - ganzen Hemisphäre Explantate - zur Untersuchung der frühen Entwicklung kortikalen (E13-E15). Das Modell hat sich für die Analyse der Migration und Differenzierung des exzitatorischen Neurons Linie, die Schicht 6 aus der Großhirnrinde 25,37 bildet nützlich. Die prinzipiellen Vorteile des Systems sind: 1) organotypischen Wachstum für 2 DIV, 2) Einfachheit der Zubereitung, und 3) experimentellen Zugang zu den Neuronen für die Elektroporation, p...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde Zuschüsse aus NINDS (NS066071) und der NIAAA unterstützt. (P50AA017823) an ECO. Die Autoren danken Dr. Robert Quinn und das Personal in der Abteilung für Versuchstierkunde Ressourcen für Tierpflege. Wir danken Judson Belmont für den technischen Support, Nicole Belletier für die Unterstützung als Sommer Undergraduate Research Fellow (SURF). Wir danken auch Dr. David Cameron für Kommentare und Änderungen auf eine frühere Version des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenzien
DMEM/F12 + GlutaMAXGIBCO10565
G5 Supplement 100XInvitrogen17503-012
B27 Serum-Free Suppl. 50XInvitrogen1504-044
Pen / Strep Liquid 100XInvitrogen15140-122
HBSS 500 mlGIBCO14025
Kultureinsatz kollagenbeschichtet Costar3492
Rinderhautgelatine SigmaG9382
H– chst 33342InvitrogenH1399
RinderserumalbuminSigma7906
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
Equipment
BTX 830 ElektroporatorHarvard Apparat450052
Pinzettenelektroden 10mmHarvard Apparat450166
InkubatorBillupsRothenberg MIC-101
Hamilton Spritze (5uL)Hamilton87930
Hamilton SpritzennadelHamilton7803-04Spezifizieren 1" und Style 4
Dumont #5 PinzetteFST11251-10
Feine Schere Tough Cut 9 cmFST14058-09

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Explant der gesamten Hemisph rePlasmidinjektionGewebedissektionhistologische AnalyseGFP Expressionkortikale Laminationneuronale MigrationEmbryogewinnung

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