Graphene Coatings for Biomedical Implants

Zusammenfassung

Graphene bietet Potenzial als Beschichtungsmaterial für biomedizinische Implantate. In dieser Studie zeigen wir, ein Verfahren zur Beschichtung Nitinollegierungen mit Nanometer dicken Schichten von Graphen und bestimmen, wie Graphen kann Implantat Reaktion beeinflussen.

Zusammenfassung

Atomar glatten Graphen als Oberflächenbeschichtung hat Potential Implantat zu verbessern. Dies zeigt ein Verfahren zur Beschichtung Nitinollegierungen mit Nanometer dicke Schichten aus Graphen für Anwendungen als Stentmaterial. Graphen wurde auf Kupfer Substrate durch chemische Dampfabscheidung gezüchtet und dann auf Nitinolsubstraten übertragen. Um zu verstehen, wie die Graphen Beschichtung könnte biologische Reaktion zu ändern, wurde die Lebensfähigkeit der Zellen von Ratten-Endothelzellen und Rattenaorta glatten Muskelzellen untersucht. Außerdem wurde die Wirkung von Graphen-Beschichtungen auf Zelladhäsion und Morphologie mit fluoreszierendem konfokale Mikroskopie untersucht. Zellen wurden für Actin und Kerne angefärbt, und es waren deutliche Unterschiede zwischen unberührten Nitinol Proben verglichen, um Graphen-beschichteten Proben. Insgesamt Aktin Expression von Rattenaorta glatten Muskelzellen gefunden wurde mittels Western Blot. Proteinadsorption Eigenschaften, ein Indikator für potenzielle Thrombogenität, were für Serumalbumin und Fibrinogen mit Gelelektrophorese bestimmt. Darüber hinaus wurde die Übertragung von Ladung von Fibrinogen an das Substrat hervorgerufen, die mittels Raman-Spektroskopie. Es wurde festgestellt, dass Graphen Beschichtung auf Nitinolsubstraten die funktionalen Anforderungen für eine Stent-Material erfüllt und verbessert die biologische Reaktion im Vergleich zu unbeschichteten Nitinol. So ist Graphen-beschichteten Nitinol ein brauchbarer Kandidat für einen Stent Material.

Einleitung

Die letzten drei Jahrzehnte haben Entdeckung neuartiger Materialien-basierten Therapien und Geräte für die Erkrankung von Medikamenten und diagnostischen erlebt. Neuartige Legierungen wie Nitinol (NiTi) und Edelstahl sind oft in der biomedizinischen Implantate Herstellung aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften verwendet. ^1-3 jedoch zahlreiche Herausforderungen durch exogene Material Zytotoxizität bleiben, Bio-und Hämokompatibilität. Die Natur dieser metallischen Legierungen führt zu schlechter Bioverfügbarkeit und Hämokompatibilität durch Metall Auslaugen, mangelnde Zell-Adhäsion, Proliferation und Thrombose, wenn es in Kontakt mit strömenden Blutes (wie Katheter, Transplantaten Blutgefäß, vaskulären Stents, künstliche Herzklappen etc.). ^{1, 4, 5} Das Zusammenspiel von Proteinen oder lebenden Zellen mit der Oberfläche des Implantats kann zu einer starken Immunantwort und der anschließenden Kaskade von biochemischen Reaktionen führen kann negative Auswirkungen auf die Gerätefunktionen. Daher wird pertinENT, um die Kontrolle über die Wechselwirkungen zwischen biomedizinischen Implantaten und Umgebung biologischen Umgebung zu erreichen. Oberflächenmodifizierung wird oft verwendet, um Reduktion oder Prävention der nachteiligen physiologischen Reaktion, die aus dem Implantatmaterial. Eine ideale Oberflächenbeschichtung soll hohe Haftfestigkeit, chemische Trägheit hohe Glätte und gute Hämo-und Bioverträglichkeit aufweisen. Bisher wurden zahlreiche Materialien einschließlich diamantartigem Kohlenstoff (DLC), SiC, TiN, TiO ₂ und viele Polymermaterialien als biokompatiblen Implantats Oberflächenbeschichtungen getestet. ^{1, 6-23} Jedoch sind diese Materialien noch nicht alle treffen die funktionalen Kriterien für ein geeignetes Implantat Oberflächenbeschichtung.

Die Entdeckung-dicke Schicht von sp ² Kohlenstoff als Graphen bekannt, hat Türen für die Entwicklung neuartiger Multifunktionsmaterialien geöffnet. Graphene wird erwartet, dass ein idealer Kandidat für Implantat Oberflächenbeschichtung sein, da esist chemisch inert, atomar glatt und sehr langlebig. In diesem Brief, untersuchen wir die Lebensfähigkeit von Graphen als Oberflächenbeschichtung für biomedizinische Implantate. Unsere Untersuchungen zeigen, dass die Graphen beschichteten Nitinol (NiTi-Gr) alle funktionellen Kriterien erfüllt, und unterstützt zusätzlich ausgezeichnete glatte Muskelzellen und Endothelzellen Zellwachstum führt zu besseren Zellproliferation. Wir finden auch, dass die Serum-Albumin Adsorption auf Gr-NiTi höher als Fibrinogen ist. Wichtig ist, dass (i) unsere detaillierte spektroskopische Messungen bestätigten das Fehlen von Ladungstransfer zwischen Graphen und Fibrinogen darauf hindeutet, dass Graphen Beschichtung hemmt Thrombozytenaktivierung durch Implantate, (ii) Graphen Beschichtungen zeigen keine signifikante in vitro Toxizität für Endothelzellen und glatten Muskelzellen Zelllinien bestätigt ihrer Biokompatibilität, und (iii) Graphen Beschichtungen sind chemisch inert, robust und undurchlässigen im fließenden Blut Umwelt. Diese Hämo-und biokompatiblen Eigenschaften, zusammen mit hoher strength, chemische Beständigkeit und Langlebigkeit, machen Graphen Beschichtungen als ideale Oberflächenbeschichtung.

Protokoll

Ein. Graphen-Beschichtung von NiTi

1. Die Graphen-Proben in dieser Studie verwendet wurden auf Kupfer (Cu)-Substraten unter Verwendung des chemischen Dampfabscheidungstechnik aufgewachsen, und anschließend zu 4,5 mm ² NiTi Substrate übertragen.
2. Cu-Folien (1 cm x 1 cm) wurden in einer 1 in. Quarzrohrofen vorgelegt und auf 1000 ° C in Gegenwart von 50 sccm H ₂ und 450 sccm Ar.
3. Weiter, Methan (1 und 4 sccm) wurde in den Ofen in verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten für 20-30 min eingeführt. Die Proben wurden schließlich auf Raumtemperatur unter strömendem H _2, Ar und CH ₄ gekühlt.
4. Als nächstes wurden die Cu-Folien Schleuderbeschichtung mit PMMA (verdünnt mit 4% Anisol) bei 4.000 Umdrehungen pro Minute durch eine Wärmebehandlung für 5 min bei 150 ° C, gefolgt Graphen an PMMA-Schicht wurde durch Ätzen des Cu-Folie mit TRANSENE Inc., CE-100 Ätzmittel, und anschließendes Spülen in 10% HCl und deionisiertem Wasser für 10 min erhalten.
5. Die sBeispiele wurden auf NiTi Substrate (4,5 mm ²⁾ überführt und getempert bei 450 ° C in Ar (300 sccm) und H ₂ (700 sccm) für 2 Stunden, um die PMMA zu entfernen. Schließlich wurden die Substrate mit Aceton gewaschen, um das restliche PMMA löst, um den Gr-NiTi Probe zu erhalten. Ein XY Dilor Dreifach Gittermonochromator wurde für die Mikro-Raman-Charakterisierung (100X mit Objektiv) aller Gr-NiTisamples mit 514,5 nm Anregung von einem Ar ^{+-Ionen-Laser} verwendet.

2. In vitro-Toxizität von Gr-NiTi

Ratte-Endothelzellen (Cell Anwendung Inc.) wurden auf einem 8 Kammern gelatinebeschichteten Schieber kultiviert. Für die Prüfung des Zellwachstums, makellos und Gr-NiTisubstrates wurden in Brunnen ohne Gelatineschicht platziert. Rasterelektronenmikroskopie-Bilder wurden mit einem Hitachi S-4800 SEM. Zusätzlich wurden Rattenaorta Glattmuskelzellen auch in Cellbind gezüchtet 96-Well-Platten als Kontrollgruppe (Corning) in Dulbecco-modifiziertes Eagle Medium (ATCC).

1. Zum Testen Zelllebensfähigkeit wurden Zellen (sowohl Endothel-und glatten Muskelzellen) bei 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in Vertiefungen, die unberührten NiTi, 1 sccm oder 4 sccm Gr-NiTi Substraten, wobei die angegebenen sccm Methan entspricht der Strömung in der verwendete ausgesät CVD-Wachstum von Graphen. Die Zellen wurden für den gewünschten Zeitraum in einem Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO _2, den Austausch von Medien jeder andere Tag.
2. Am Ende Zeitpunkt wurde das Medium entfernt und frisches Medium, das 0,5 mg / ml Thiazolyl Blau tetrazoliumbromid (MTT oder von Sigma bezogen) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Die Zellen wurden dann für weitere 3 Stunden inkubiert. Für den MTS-Assay wurde das Medium in der letzten Zeitpunkt entfernt und durch 120 ul MTS Arbeitslösung (Cell 96 Grad wässrigen, Promega) und inkubiert für drei Stunden.
3. Weiter wurde das Medium vorsichtig entfernt und mit 100 ml Dimethylsulfoxid (Sigma) wurde zu jeder Vertiefung zugegeben. Nach alloFlügel 10 min für die MTT-Kristalle aufzulösen, wurde die Lösung in ein anderes Well-Platte transferiert. Für den MTS-Assay wurde kein Dimethylsulfoxid in die Vertiefungen gegeben. Nun Inhalte wurden auf eine neue Platte bewegt.
4. Absorption wurde bei 490 nm abgelesen, und die prozentuale Lebensfähigkeit wurde durch Normalisierung der durchschnittlichen Absorption Extinktion der unberührten NiTi Probe bestimmt. Mindestens fünf Wiederholungen wurden für jede Probe gemacht Typs.

3. Konfokale Mikroskopie Studium der Zellmorphologie

1. Für die konfokale Abbildung der Rattenaorta Glattmuskelzellen, wurden Substrate in einer 8-Kammer Schieber (Thermo Scientific) platziert. Die Zellen wurden bei 25.000 Zellen / Kammer ausgesät und 3 Tage bei 37 ° C und 5% CO _2.
2. Zellen wurden auf dem Substrat mit 4% Formaldehyd in Phosphat gepuffertem Kochsalz 20 min.
3. Permeabilisiert mit 0,1% Triton-X für 1 min.
4. Actin wurde mit Alexa Fluor 488 Phalloidin (Lif gefärbte Technologies). 100 ul AlexaFluor 488 Phalloidin bei 200 Einheiten / ml in Methanol wurde auf 1,9 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung zugegeben. Zellen wurden mit 250 ul AlexaFluor 488 Phalloidin für 45 min gefärbt und dann zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
5. Zellkerne wurden mit fluoreszierenden Vectashield Eindeckmedium enthaltenden DAPI (Vector Laboratories) montiert ist. Konfokale Bilder wurden unter Verwendung eines Nikon Konfokale TI. Eine Kammer mit Zellen ohne Substrat ausgesät wurde als Kontrolle verwendet.

4. Proteinadsorptionsstudien

1. Substrat Dimensionen wurden mit einer Schieblehre, bevor Sie die Proteinadsorption Experimenten gemessen. Drei Messungen wurden für jede Seite der etwa quadratischen Proben genommen und gemittelt, um die Länge und Breite erhalten.
2. Jede Probe, unberührte NiTi, 1sccm und 4sccm Gr-NiTiwere mit 1 mg / ml Albumin in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert (PBS) oder 1 mg / ml Fibrinogen in PBS bei Raumtemperatur temperatur für 3 Stunden.
3. Proben wurden unter gleichen Bedingungen in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 ul reduzierenden Probenpuffer versetzt und für 5 min gekocht.
4. Proben wurden dann in einem Tris / Glycine / SDS Puffer (Bio-Rad) verdünnt und durch eine 4-15% Tris Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel (Bio-Rad) bei 90 V für 100 min.
5. Die Gele wurden dann mit SYPRO Red angefärbt. Verdünnen SYPRO Red (Life Technologies) Stammlösung bei 1:5.000 in 7,5 v / v% Essigsäure. Stain Gele für 60 min.
6. Bild Gele mit einem Flourchem SP (Alpha Innotech). Fluoreszenzintensität quantifiziert wurde mit ImageJ Software. Fluoreszenzintensität jeder Probe wurde durch die Gesamtfläche des Substrats normalisiert und Fibrinogen-Adsorption wurde Adsorption an Albumin verglichen.

5. Western Blot für die Protein-Expression

1. Western-Blot wurde durchgeführt, um insgesamt Aktin in Rattenaorta glatten Muskelzellen zu analysieren. Die Zellen wurden mit 10.000 Zellen / Substrat in einer 96-Gew ausgesätell Platte.
2. Die Zellen wurden drei Tage vor dem Entfernen Medium gezüchtet. Gesamtprotein wurde extrahiert mit RIPA-Puffer und ein Standard-BCA-Assay (Lamda) wurde durchgeführt, um Gesamtprotein quantifizieren.
3. Proben wurden auf die gleiche Konzentration in RIPA verdünnt und dann in einer reduzierenden Probenpuffer für 5 min gekocht.
4. Proteine ​​wurden durch einen 4-15% Tris Polyacrylamidgel über Elektrophorese bei 90 V für 100 min getrennt. Ein Kaleidoskop Proteinstandard (Bio-Rad) wurde verwendet, um Protein-Molekulargewicht zu beurteilen.
5. Proteine ​​wurden auf eine PVDF-Membran übertragen und blockiert mit einer 1% fettfreier Trockenmilch (Bio-Rad)-Lösung.
6. Insgesamt Aktin wurde mit einem Kaninchen-anti-Ratte Aktin-Antikörper (Sigma) markiert. Eine chemilumineszente BM Kits (Roche) wurde verwendet, um den primären Antikörper erkennt. Membranen wurden unter Verwendung FlourChem SP bildgebenden Geräten und Fluoreszenzintensität wurde mit ImageJ Software. Fluoreszenzintensität wurde durch Vergleich mit der pri normalisiertstine NiTisample.

Ergebnisse

. Abbildung 1 a) CVD gewachsen polykristallinen Graphen auf Cu-Folien imitiert die Metall-Kristallkörner (Maßstab: 10 um). b) Raman-Spektrum von 1 sccm (4 sccm) Graphen zeigt intensive (relativ schwächer) G 'Bande, die Monoschicht (wenige Schicht) Art des so hergestellten Graphen. c) AFM-Bild von Graphen auf NiTi übertragen zeigt eine Rauheit von ~ 5 nm. Maßstab = 500 nm.

Diskussion

Biokompatibilität und Zytotoxizität: Die chemische Gasphasenabscheidung (CVD)-Verfahren ergab polykristallinen Graphenproben die Cu Kristallkörner, wie in 1a gezeigt nachgeahmt. Wir beschäftigten Raman-Spektroskopie, um das Vorhandensein von Monolayer (wenige Schicht) Graphen auf 1 sccm (4 sccm) Proben (siehe Abbildung 1b) bestätigen. Offensichtlich weisen 1 sccm (4 sccm) Proben intensiv (relativ schwächere) G 'band Hinweis auf Monoschicht (wenige Schicht) Graphen. ...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
			Reagens
Dulbeccos Modified Eagle Medium	ATCC	30-2002
Thiazolylblau tetrazoliumbromid	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Aqueous Eine Lösung Zellproliferationsassay (MTS)	Promega	G3582
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D8418
36,5% Formaldehyd	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
AlexaFluor 488 Phalloidin	Life Technologies	A12379
Vectashield Eindeckmedium mit DAPIch	Vector Laboratories	H-1200
Humanserumalbumin	Sigma-Aldrich	A9511
Humanes Fibrinogen
Tris / Glycin / SDS	Bio-Rad	161-0732
Ready Gel Tris-HCl Gel	Bio-Rad	161-1158
Essigsäure	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO Red	Life Technologies	S-6653
Protein Low BCA-Assay	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Protein Kaleidoscope Norm	Bio-Rad	161-0375
Immun-Blot PVDF-Membran	Bio-Rad	162-0177
Blot Grade Blocker fettfreie Trockenmilch	Bio-Rad	170-6404XTU
Anti-Aktin-Antikörper in Kaninchen produziert	Sigma-Aldrich	A2066
BM Chemilumineszenz Western Blot Kit (Maus / Kaninchen)	Roche Applied Science	11520709001
RIPA Puffer	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti)	Alfa-Aesar	44953
			Ausrüstung
Horiba JobinYvon	Raman-Spektrometer	Dilor XY 98
Nikon	Konfokalmikroskop	Eclipse-TI-Mikroskop
Thermoscientific	Plattenlesegerät
Bio-Rad	Stromversorgung	164-5050	PowerPac grundlegende Versorgung
Bio-Rad	Elektrophoresezelle	165-8004	Mini-PROTEAN Tetra Zelle
Bio-Rad	Gelhalterung Kassette	170-3931	Mini-Kassette Gelhalterung