Generation Ausgerichtet Functional Myokardgewebe Durch Mikrokontaktdrucken

Zusammenfassung

Die Erzeugung von ausgerichteten Myokardgewebe ist eine wesentliche Voraussetzung für die Anpassung der jüngsten Fortschritte in der Stammzellbiologie, um klinisch nützliche Zwecke. Hier beschreiben wir einen Mikrokontaktdruck Ansatz für die präzise Steuerung der Zelle Form und Funktion. Mit hoch gereinigte Populationen von embryonalen Stammzellen abgeleitete kardiale Vorläuferzellen, wir erzeugen dann anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe.

Zusammenfassung

Fortgeschrittener Herzinsuffizienz stellt eine große Herausforderung unerfüllten klinischen, die aus dem Verlust von lebensfähigen und / oder voll funktionsfähige Herzmuskelzellen. Trotz optimaler medikamentöser Therapie stellt Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten menschlichen Physiologie myokardialen in vitro. Ebenso sind die großen Herausforderungen in der regenerativen Biologie kardialer um die Identifizierung und Isolierung von Patienten-spezifischen kardialen Vorläuferzellen in klinisch relevanten Mengen zu drehen. Diese Zellen haben, um dann in funktionelle Gewebe, das die native Herzgewebe Architektur. Mikrokontaktdruck ermöglicht die Erstellung von präzisen mikrostrukturierten Protein Formen, die strukturelle Organisation des Herzens ähneln ähnelt montiert werden, wodurch geometrische Hinweise auf Zelladhäsion räumlich steuern. Hierinbeschreiben wir unserem Ansatz zur Isolierung von hochreinem Herzmuskelzellen aus pluripotenten Stammzellen in vitro Differenzierung, die Erzeugung von Zellwachstum Oberflächen mit Proteinen der extrazellulären Matrix mit Mikrostruktur und die Montage der Stammzellen abgeleiteten Herzmuskelzellen in anisotropen Myokardgewebe.

Einleitung

Trotz der jüngsten Fortschritte in der medizinischen Therapie, bleibt fortgeschrittener Herzinsuffizienz eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität in der entwickelten Welt. Das klinische Syndrom ergibt sich aus einem Verlust von funktionalen Herzmuskelgewebe und anschließend die Unfähigkeit des versagenden Herzens, um die metabolischen Anforderungen der Betroffenen gerecht zu werden. Da das Herz hat eine begrenzte Regenerationsfähigkeit ist autologen Herztransplantation die einzige aktuelle klinisch anerkannte Therapie direkt am Auffüllen verloren funktionale Herzgewebe ab. Signifikante Nachteile der Herztransplantation, einschließlich einer begrenzten Anzahl von Spenderherzen und die Notwendigkeit für eine langfristige Immunsuppressionstherapie, schließt die weit verbreitete Verwendung dieser Therapie. Als Ergebnis hat die medizinische Therapie die Hauptstütze der Behandlung von Patienten mit Herzerkrankungen. Eine große Herausforderung in der Arzneimittelentwicklung ist die Identifizierung von zellulären Assays, die genau rekapitulieren normalen und erkrankten Myokards Physiologie in vitro.

Die jüngste Annäherung der Stammzellbiologie und Tissue Engineering Technologie wirft neue, viel versprechende Wege zur kardialen Regeneration. Erzeugung funktioneller Myokardgewebe aus erneuerbaren Patienten-spezifische Quelle wäre ein großer Fortschritt auf dem Gebiet sein. Dies würde bei der Entwicklung der Krankheit spezifische zelluläre Assays zur Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln ermöglichen und die Grundlage für kardiale Regenerationsmedizin lag. Menschliche embryonale Stammzellen (ES-Zellen) und mehr deutlich, menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) stellen eine potenziell erneuerbaren Patienten-spezifischen Quelle der ventrikulären Vorläuferzellen und reife ventrikulären Myozyten. Die Kombination von Stammzellbiologie und Tissue Engineering Strategien löst dieses Problem durch Erzeugen funktionelle Herzgewebe in vitro, die in der Entwicklung von zellulären Assays für die Wirkstoffentwicklung oder in kardialen regenerativen Ansätzen zur Behandlung fortgeschrittener Herzinsuffizienz verwendet werden können.

_CONTENT "> Eine zentrale Herausforderung kardiale Regeneration ist seit der Identifizierung einer optimalen Zelltyp. Eine Vielzahl von Zellen wurden ¹ untersucht jedoch bisher, obwohl verschiedene multipotenten Vorläufern kardiogenen aus verschiedenen Quellen haben entdeckt worden, die eine Identifizierung einer Zelle Quelle, die kritischen Anforderungen wie Einsatz für die myogenen Zellschicksals erfüllt hat Erhaltung der Kapazität, um in vivo oder in vitro und Zusammensetzung an eine funktionelle Myokardgewebe erweitern sich als zentrales Problem ² sein. Wir haben zuvor eine doppelt transgenen Maus beschriebene System das ermöglicht die Isolierung von hoch gereinigten Populationen von Vorläuferzellen engagierten ventrikulären (CVP) aus ES-Zellen differenzierenden in vitro. Wir erzeugten eine neuartige doppelt transgenen Maus, die den roten fluoreszierenden Proteins DsRed exprimiert unter der Kontrolle eines ISL1-abhängigen Enhancer des Gens und MEF2C das verstärkt grün fluoreszierende Protein unter der Kontrolledie herz-spezifische Nkx2.5 Enhancer. Basierend auf dieser zweifarbige Fluoreszenz-Reporter-Systems, einen ersten und zweiten in das Herz Feld Vorläuferzellen aus Entwicklungs-ES-Zellen kann mittels Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) nach ihrer Expression MEF2C und Nkx2.5 Gene isoliert werden. CVP ähneln Herzmuskelzellen auf den Expressionsmuster der myokardialen Marker und strukturellen und funktionellen Eigenschaften ^3, was sehr vielversprechend für Herzgewebe regenerative Zwecke bietet basiert.

Zwar gab es viele Fortschritte auf dem Gebiet des Tissue Engineering, imitiert nativen zellulären Architektur bleibt eine zentrale Herausforderung. Herkömmliche Methoden zur Bewältigung dieser Herausforderung sind Aussaat biologischen oder synthetischen Gerüsten mit Zellen in vitro. Aufgrund einer Reihe von Nachteilen von Gerüsten, einschließlich schnellen Abbau, begrenzte physikalische und mechanische Stabilität und geringe Zelldichte ^1,4,5, haben wir versucht, Gerüst-weniger Gewebe zu konstruieren. Although Herzzellen ihre lokalen Mikroumgebung durch die Sekretion von extrazellulären Matrix-Proteinen verändern, haben sie eine weitere begrenzte Kapazität haben, um stabförmigen kardialen Myozyten in Abwesenheit von extrazelluläre Signale anzuordnen. Somit wird eine Vorlage, die Zellen und biologische entsprechenden räumlichen Hinweise auf funktionelle Myokardgewebe komponieren bietet erforderlich. Mikrokontaktdrucken dieser Herausforderung durch die Bereitstellung eines einfachen und kostengünstigen Technik zur präzisen Steuerung Zellform, Organisation und Funktion ^6-8, die alle entscheidend für die Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet sind. Es umfasst die Verwendung von mikrotexturierte Polydimethylsiloxan (PDMS) Stempel mit Strukturgrößen im Bereich bis zu 2 um ^9, die die Ablagerung von Proteinen der extrazellulären Matrix auf PDMS Substrate präzise Muster ermöglichen und damit zu Zelladhäsion räumlich beeinflussen.

Hier schlagen wir vor, Gewebe Bioengineering-Technologie mit Stiel cel kombinierenl Biologie zu generieren anisotropen funktionale Herzmuskelgewebe. Dementsprechend wir hier zeigen unsere kürzlich veröffentlichten Ansatz für die folgenden: (1) die Erzeugung von mikrostrukturierten Oberflächen-Protein auf PDMS Substraten durch Mikrokontaktdrucken zur Erzeugung einer Schablone für ausgerichteten Herzmuskelgewebe, (2) die Isolierung hochreiner kardialen Vorläuferzellen aus ES-Zellen in vitro Differenzierung und (3) die Kombination der beiden Techniken zur Erzeugung von funktionellen Myokardgewebe ausgerichtet.

Protokoll

Das Protokoll ausgerichtet funktionelle Myokardgewebe erzeugen kann in drei Hauptteile aufgeteilt werden. Die Herstellung der mikrostrukturierten Master mit weichen Lithographie-Techniken wird nicht als Teil der folgenden Protokoll, sondern kann auf der Basis etablierte Methode ⁶ vorgenommen werden.

Ein. Mikrokontaktdrucken von Fibronektin auf PDMS Substrate

1. Mix Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS Elastomer einem 10:1-Basis zu Härter-Verhältnis und Degas die Montage mit einem Exsikkator, um Luftblasen zu beseitigen.
2. Härten PDMS mit einer zuvor hergestellten Master mit 20 um Breite und 2 um hohen Grate, durch Abstand 20 um entweder für 2 Tage bei Raumtemperatur oder 4 Std. bei 65 ° C bis mikrotexturierte PDMS-Stempel erhalten getrennt.

* Aushärtung in einem Exsikkator wird dringend empfohlen, um mögliche Luftblasen zu beseitigen.

3. Spin Mantel PDMS auf Glasdeckgläschen (zB22x22 mm) bei 5000 rpm für 2 min unter Verwendung eines Spin-Coater auf Headway dünne und gleichmäßige PDMS Substrate von 15 um Dicke herzustellen.
4. Reinigen Sie Briefmarken mit 70% Ethanol, um Staub und Schmutz zu entfernen. Lassen Sie sie an der Luft trocknen.

* Briefmarken mehrmals verwendet werden kann, jedoch wird zur Verlängerung PDMS-Stempel auf einer regelmäßigen Basis zu empfehlen, da eine Oberfläche Abrieb über die Zeit.

5. Ort Briefmarken in einem SPI Plasma-Prep II Plasma Reiniger und Verfahren für 1 min bei 275 mTorr zu machen PDMS Oberflächen hydrophil.

* Oxygen Plasma-Behandlung beobachtet werden sollte. Längere Behandlungszeiten in Cracken des Elastomers führt.

6. Sterilisieren Briefmarken mit 70% Ethanol für 1 min. Trocknen schnell mit Druckluft.

* Weitere Schritte sollten in einer biologischen Sicherheitswerkbank durchgeführt werden, um die Sterilität zu erhalten.

7. Titelbild Stempel Oberflächen mit Fibronectin-Lösung (50 g / ml in ddH ₂ O). Let it adsorbieren mindestens 10 min.
8. Abzuschütteln Fibronectin-Lösung von Briefmarken und trocknen schnell mit Druckluft.
9. Stellen konformen Kontakt zwischen Stempel und PDMS Substrate für 2 min und fest andrücken.
10. Spülen mikrostrukturierten Substraten mit ddH ₂ O. Lagern Sie sie in ddH ₂ O für maximal 2 Wochen bei 4 ° C, es sei denn zunächst verwendet. Shop PDMS-Stempel in ddH ₂ O.

2. Wartung von doppelt transgenen embryonalen Stammzelllinien

Zuerst bereiten Sie die folgenden Medien zur Kultivierung von Maus-ES-Zellen:

Maus embryonale Fibroblasten (MEF)-Medium: Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), 10% Fetal Bovine Serum (FBS) ES-Zell-Differenzierung oder-grade, 1% Penicillin-Streptomycin (P / S)

Embryonale Stammzellen (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES-Zell-grade,1% Non-Essential Amino Acids (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% Leukämiehemmfaktor (LIF), 0,0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME)

1. Coat 6-well Platten mit steriler 0,1% Gelatine in ddH ₂ O und lassen Sie es adsorbieren 15 min bei 37 ° C.
2. Hinzufügen von einem MEFs aufgetaut Aliquot auf 50 ml PBS in einem konischen Rohr und zentrifugieren bei 1.000 UpM für 5 min. Resuspendieren MEFs in MEF-Medium.
3. Nach der Adsorption absaugen überschüssige Gelatine und Add MEFs in die Vertiefungen. Lassen MEFs 1 Tag zu befestigen.

* Ein Aliquot von 10 Millionen MEFs genügt für 3 6-Well-Platten.

4. Wenn MEFs angelagert haben, addieren ES-Zellen aus einem aufgetauten Aliquot auf 50 ml PBS in einem konischen Rohr und zentrifugieren bei 1.000 UpM für 5 min. Resuspendieren ES-Zellen in ESC-Medium und fügen Sie sie in die Vertiefungen mit MEFs. Kultur ES-Zellen in ESC-Medium bis zur Konfluenz erreicht ist.

* Sobald ES Zellen Konfluenz erreicht, wird die Passage requIRED zur Überwucherung zu vermeiden und ES-Zell-Kolonien zu erhalten.

5. Planen ES-Zellen zur Passagierung. Aspirate ESC-Medium und waschen Sie einmal mit sterilem PBS.
6. Absaugen PBS und 500 ul Trypsin. Prozess 3,5 min bei 37 ° C.
7. Pipettieren Sie die Trypsin-Lösung nach oben und unten mehrere Male zu brechen ES-Zell-Kolonien und neutralisieren mit 500 ul ESC-Medium.
8. Passage ES-Zellen nach Ihren gewünschten Verhältnis, zB Übertragung 33 ul zu einem anderen auch mit zuvor MEFs, um den Durchgang 1/30 vorbereitet. Pflegen ES-Zellen in ESC-Medium.

* Eine Passage Verhältnis von 1/30 erlaubt ES-Zellen bis zur Konfluenz in 3 Tagen erreichen. Passage ES-Zellen nach Ihren in vitro Differenzierung Zeitplan.

3. In vitro Differenzierung von doppelt transgenen embryonalen Stammzelllinien und Isolation und Seeding of Cardiac Vorläufer

Zuerst bereiten die following Medien für die in vitro Differenzierung von ES-Zellen erforderlich:

Adaptionsverstärkende Medium: Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), 15% FBS ES-Zell-Grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME

Differenzierungs-Medium: IMDM, 15% FBS Differenzierungs-Klasse. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% von 0,1 M Ascorbinsäure, 0,0007% 2-ME

1. Starten Sie in-vitro-Differenzierung, wenn ES Zellen Konfluenz erreicht haben. Coat 10 cm Kulturschalen mit steriler 0,1% Gelatine in ddH ₂ O und lassen Sie es adsorbieren 15 min bei 37 ° C.

* Seien Sie sich bewusst von der Dauer der in vitro Differenzierung. Es dauert 8 Tage bis kardiale Vorläuferzellen isoliert werden können. Planen Sie Ihre Experimente entsprechend.

2. Ernte ES-Zellen wie zuvor. Nach der Adsorption absaugen überschüssige Gelatine und fügen etwa 1/3-1/2 der ES Zellsuspension angesetzte KulturSchalen mit Adaptation-Medium. Kulturzellen für 2 Tage.

* Wählen Sie den Betrag von ES-Zellen für die Anpassung nach Ihren Experimenten.

3. Ernte angepaßt ES-Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit PBS unter Verwendung von 1. 5 ml Trypsin. Zentrifuge dissoziierten ES-Zellen bei 1.000 UpM für 5 min und resuspendiert in ihnen Differenzierungs-Medium.
4. Machen Embryoidkörpern (EVG) von ca. 1.000 Zellen pro 10 ul Tropfen in 15 cm Kulturschalen mit einem Multi-Kanal-Pipette. Umkehren der Platten und Kultur EBs als hängende Tropfen für 2,5 Tage bei 37 ° C.
5. Nach 2,5 Tage, Pool EBs von 6-8 15 cm Kulturschalen in einem mit Differenzierungs-Medium und Kultur sie für weitere 3,5 Tage bei 37 ° C.
6. Nach 3,5 Tagen sammeln EBs in einem konischen 50 ml Tube und ließ sie auf den Boden für ca. 5 min zu versenken. Saugen Sie den Überstand und waschen EBs mit sterilem PBS. Lassen EBs wieder zu Boden sinken für ca.oximately 5 min.
7. Distanzieren EBs durch die Bearbeitung mit 2. 5 ml Trypsin für 2 min in einem Wasserbad bei 37 ° C schüttelt die Röhre sanft. Dann fügen Sie 2. 5 ml sterilem PBS auf die Trypsin-Lösung und und Abpipettieren mit einer 10 ml serologische Pipette ca. 8-10 mal zu brechen Zellhaufen. Neutralisieren Trypsin mit 10 ml FACS-Puffer, enthaltend 7,5% FBS ES-Zell-Differenzierung oder-grade und 0,01% DAPI in PBS.
8. Zentrifuge dissoziierten EBs bei 1.000 UpM für 5 min und resuspendiert sie in etwa 1 ml FACS-Puffer. Und Abpipettieren mit einer 1 ml Pipette ca. 8-10 mal zu brechen Zellhaufen.

* In FACS-Puffer nach dem geschätzten Betrag von dissoziierten EBs. Zu hoch konzentriert Zellen können während der FACS verstopfen und zu niedrig konzentrierten Zellen FACS unnötig Zeit zu verlängern.

9. Übertragen Zellen in ein steriles Rundboden-Röhrchen mit einer 35 um Zellsieb zu erhalteneine einzelne Zellsuspension.
10. Sortieren differenzierten ES-Zellen mit einem FACSAria Durchflusszytometer und erhalten gereinigte Populationen von CVP.

* Wir entwickelten einen mehrstufigen Strategie zur Gating hochgereinigten gefärbten Zellen zu isolieren. Kurz, wir erste Tor auf Forward Scatter Amplitude (FSC-A) und Side Scatter Amplitude (SSC-A) (Abbildung 1A). Dies ermöglicht es uns, ganze Zellen von Zelltrümmern zu trennen. Wir haben dann Tor auf FSC-A und Forward Scatter-Breite (FSC-W) (Abbildung 1B). Dies ermöglicht uns, Zelle Singuletts von Dubletten und andere zelluläre Aggregate zu isolieren. Wir haben dann Tor auf SSC-A und Side Scatter-Breite (SSC-W) (1C). Dies erhöht die Reinheit der Zelle Singuletts. Wir haben dann am Gate DAPI Anfärben zu lebensfähigen Zellen (DAPI-negativ) von nicht lebensfähigen Zellen (1D) zu isolieren. Wir haben dann am Gate Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) und PE-Cyanin Farbstoff 7 Amplitude (PE-Cy7-A) auf true rot-positiven ⁽⁺ R zu erhalten ) und echten roten negativ (R ^-)-Zellen und autofluoreszierenden rot-negativen Zellen (1E) auszuschließen. R ⁺ und R ^- Zellen werden dann gated separat auf Fluoresceinisothiocyanat Amplitude (FITC-A) und PE-A true green-positive (G ⁺⁾ und true green-negative (G ^-) sortieren Zellen innerhalb dieser Populationen (1F + 1G). Dies führt zu vier Populationen von Zellen wie folgt: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^-, R ^- G ⁺ und R ^- G ^- (Abbildung 1 H).

11. Passivieren mikrostrukturierten Substrate mit 1% Pluronic F-127 in ddH ₂ O für 10 min. Dann waschen Sie sie 3x mit sterilem PBS.

* Pluronic F-127 ist ein Tensid, dass Blöcke Zelladhäsion. Es unterstützt Einschluss der Zelladhäsion an mikrostrukturierten Bereich.

12. Bringen PDMS Dichtungen rund um die gemusterten Bereichund fest andrücken. Dann, Saatgut CVP auf Fibronectin mikrostrukturierten Substraten.

Ergebnisse

FACS-Reinigung von in vitro differenzierten ES-Zellen zeigten vier verschiedene Populationen von Vorläuferzellen (Abbildung 1). Die Anwesenheit von mikrostrukturierten Fibronectin wurde durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie, die eine vollständige Übertragung der kontinuierlichen Linien Fibronectin (Abbildung 2) bestätigt angezeigt. Plating der FACS-isolierten Vorläuferzellen auf Fibronektin Mikrostrukturen führte Ausrichtung der R ⁺ G ⁺ und ein Teil der R

Diskussion

In diesem Protokoll stellten wir ein Verfahren, um gereinigte Populationen von kardiogenen Vorläuferzellen zu isolieren und sie auf Saatgut mikrostrukturierten Substrate Fibronectin was ermöglicht sie auszurichten und einen Kardiomyozyten-ähnliche Stabform. Normale zelluläre Organisation ist kritisch für normales Gewebe Funktion ^8,10, insbesondere zum Myokardgewebe. Herzmuskelzellen Es wurde gezeigt, verbesserte mechanische ^11,12 und ^11,13 elektrophysiologischen Eigenschaften zu entwicke...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bezeichnung des Gutes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
L-Ascorbinsäure	Sigma-Aldrich	A4544	Bereiten 0,1 M Lösung in ddH2O
Exsikkator, Vacuum 10 Zoll	Nova-Tech International, Inc.	55206
4 ',6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochloride (DAPI)	Life Technologies	D1306
Dulbeccos Modified Eagle Medium	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II Durchflusszytometer	BD Biosciences
Fötales RinderserumES-Zell-grade	Gemini Bio-Produkte	100-106
Fetal Bovine Serum Differentiation-grade	Gemini Bio-Produkte	100-500
Fibronektin aus Rinderplasma	Sigma-Aldrich	F4759	Solubilisieren bis 1 mg / ml in ddH 2 O
Fisherfinest Premium Cover Glas 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
Gelatine aus Schweinehaut	Sigma-Aldrich	G1890	Bereiten 0,1% ige Lösung in ddH2O
Headway Spin Coater	Headway Research, Inc.	PWM32-PS-CB15
Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium	Thermo Scientific	SH30228.01
Leukämiehemmfaktor	SelbstVon LIF-sezernierenden Zelllinien vorbereitet		Bereiten 500x Stammlösung
MEM Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Embryonale Maus-Fibroblasten	Geerntet von Tag 12-15 Maus-Embryonen
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Bereiten 1% ige Lösung in ddH2O
Hin-und Bottom Tube mit 35 &mgr; Zellsieb	BD Biosciences	352235
SPI Plasma-Prep II Plasma Reiniger	SPI Supplies	11005-AB
Sylgard184 Silikon-Elastomer Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0.5KG
0,25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Vakuummeter	SPI Supplies	11.019-AB