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Methodenartikel

Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes

24.8K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/50289

⸱

24. September 2013

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Institute, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Division of Cardiology, Sapienza University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.

Zusammenfassung

Die Verwendung von primären Kardiomyozyten (CMS) in der Kultur hat eine leistungsstarke Ergänzung zu Mausmodellen von Herzerkrankungen in unser Verständnis von Herzerkrankungen ist. Insbesondere haben die Fähigkeit, Ionen-Homöostase, Ionenkanal-Funktion, Mobil Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung und deren Veränderungen in erkrankten Bedingungen und durch krankheitsverursachende Mutationen zu studieren, um wichtige Erkenntnisse zu Herzerkrankungen geführt. Darüber hinaus haben der Mangel an einer angemessenen immortalisierten Zelllinie zu Erwachsenen CMs imitieren, und die Grenzen der Neugeborenen-CMs (die viele der strukturellen und funktionellen Biomechanik Merkmal der Erwachsenen fehlt CMs) Kultur in unserem Verständnis der komplexen Zusammenspiel zwischen Signalwege behindert, Ionenkanäle und kontraktilen Eigenschaften im erwachsenen Herzen Stärkung der Bedeutung des Studiums Erwachsenen isoliert Kardiomyozyten. Hier sind Verfahren zur Isolierung und Kultur, die Manipulation der Genexpression durch adenoviral expre präsentieren wirssed Proteine, und anschließende funktionelle Analyse von Kardiomyozyten aus der adulten Maus. Die Verwendung dieser Techniken wird dazu beitragen, mechanistischen Einblick in die zellulären Signalwege, die Erregbarkeit zu regulieren, Ca 2 + Dynamik und Kontraktilität zu entwickeln und eine viel physiologisch relevante Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Krankheit.

Einleitung

Murine Modelle von Herz-Kreislauf-Krankheit wurden als effektive Werkzeuge für die Aufklärung grundlegender Krankheitsmechanismen 1,2 als auch für potenzielle therapeutische Ziele 1,3 serviert. Insbesondere haben die Verwendung von sowohl murinen Modellen von erworbenen Herzerkrankungen (wie beispielsweise Druck-Überlast) von 4,5 und einer transgenen Mausmodellen unser Verständnis von Herzerkrankungen 6-8 vorgerückt. Die Verwendung von Zellkulturtechniken, um Signalkaskaden 3,9,10 und Änderungen in einzelne Proteine, die zelluläre Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unterliegen Kupplung im Herzen 11-13 auf der Ebene der Einzelzelle zu studieren, die in-vivo-Maus-Modelle ergänzt. Doch der Mangel an geeigneten Zelllinien, die Erwachsenen CM Struktur und Funktion reflektieren es eine deutliche Einschränkung. Forscher haben versucht, dies durch die Untersuchung einzelner Proteine, wie Ionenkanäle zu überwinden, die in heterologen Expressionssystemen 14, und während diese Studien haben uns mit nützlichen Informationen in Form von Ionenkanal-Protein Biophysik oder Menschenhandel, unzureichende Darstellung des nativen Mikroumgebung des CMs vorgesehen ist eine erhebliche Einschränkung. Zweitens, da die meisten dieser heterologen Zellen nicht über eine ausgereifte kontraktilen Apparates, es war nicht möglich, die kontraktile Funktion und das komplexe Zusammenspiel zwischen zellulären Erregbarkeit und Kontraktion zu studieren. Aus diesem Grund haben Forscher primären Herzzellkulturen für viele ihrer in vitro funktionelle Studien gemacht. Schließlich isolierte Kardiomyozyten Studien ermöglichen Beurteilung der Kontraktionsfunktion ohne die Störfaktoren von mehrzelligen Vorbereitung einschließlich der Auswirkungen von Narben oder Fibrose und der Faserorientierung.

Primäre neonatalen Ratten-Kardiomyozyten (NRVMs) sind relativ leicht zu Kultur, kann mit Adenoviren und Lentiviren infiziert, die Genexpression 15 zu manipulieren, einend haben deshalb ein erfolgreich verwendet worden, aber haben Einschränkungen ihrer eigenen. Obwohl sie einen physiologischen Mikroumgebung ein und wurden das Arbeitspferd der Signalisierungsfeld, wesentliche Unterschiede zwischen der Morphologie und subzellulärer Organisation NRVMs und Erwachsenen cardiomyoctyes machen sie eine unzureichende Modell für die Untersuchung der Ionenflüsse und-Elektromechanische Kopplung im erwachsenen Herzen . Vor allem fehlt eine definitive NRVMs t-Rohrsystem 4. Da Ca 2 +-Fluss und Dynamik sind entscheidend von reifen T-und Rohr Retikulum (SR) Struktur 6, Ca 2 + Dynamik und funktionelle Untersuchungen des kardialen Kontraktilität in NRVMs sind nicht eine genaue Reflexion dieser kritischen Prozesse in der Erwachsenenherzmuskelzellen. Weitere, einige Komponenten des Signalwege unterscheiden zwischen Neugeborenen und Erwachsenen Mäusen 9, wodurch ein weiterer Einschränkung für das Studium Krankheitsprozesse und deren impact auf die zelluläre Erregbarkeit und Kontraktilität in NRVMs. Schließlich ist die Verteilung des Kontraktionsmaschinen zu multidirektionale und ungleichmäßige Zellverkürzung Begrenzung der Genauigkeit der Kontraktionsmessungen.

Die Verwendung von isolierten adulten Kardiomyozyten stellt daher eine genauere in vitro Modellsystems. Das außergewöhnliche Wachstum von Wissen ermöglicht durch die genetische Manipulation von Mäusen möglich, unterstreicht die Bedeutung der Erlangung Funktions isolierten Herzmuskelzellen von Mäusen. In der Tat hat die Charakterisierung der Erwachsenen CMs von Mausmodellen isoliert Licht auf vielen biologischen und pathologischen Ereignisse zu vergießen. Isoliert CMs aus transgenen Mausmodelle für die Untersuchung der Gewinn oder Verlust der Funktion von Proteinen auf die kontraktilen Eigenschaften von Einzelzellen 2,16, und die Lebensfähigkeit in Krankheitsmodellen wie Ischämie / Reperfusion 17,18 erlaubt, damit Informationen aus in Ergänzung gewonnen vivo-Studien über diese Mäusen. Verwendung von isolierten adulten CMs von Mausmodellen von erworbenen Herzerkrankungen 3,19,20 (wie Quer Aortakonstriktion bedingten Drucklast, dass Bluthochdruck oder imitiert Aortenklappenstenose) oder Übung 5,21 (für die Modellierung von physiologischen Hypertrophie) ermöglicht die Prüfung der Wechselwirkung von Signalkaskaden bei diesen Verfahren mit zellulären Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung auf der Ebene der Einzelzelle gebracht. Darüber hinaus gibt uns die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren mit Adenovirus-driven Genexpression in erwachsenen CMs die Möglichkeit, die Komponenten der komplexen Signalwege zu sezieren.

Aus einem elektro Sicht haben Ganzzellspannung und Stromklemme-Experimente an isolierten adulten CMs in der Aufklärung der Natur der Ionenflüsse zu Beginn und bei verschiedenen Krankheitszuständen kritisch. Aufgrund der komplexen Struktur der Zellmembran und dem Differential Protein Gerüststrukturen zwischen Erwachsenen und CMs NRVMs oder heterologen Zelllinien, die von adulten Zellen Fläche bietet eine viel bessere Darstellung der Wirkungen bestimmter Membranproteinen, Strukturproteine ​​und Ionenkanalinteraktionspartner auf die elektrophysiologischen Komponenten des erwachsenen Herzen.

Trotz dieser prominenten Vorteile bei der Untersuchung adulten Kardiomyozyten, Isolierung und Kultivierung erwachsenen Mäusen Kardiomyozyten wurde eine Herausforderung, drängt die Notwendigkeit einer systematischen und genaue Beschreibung der Methodik, um lebensfähige Kardiomyozyten der Maus zu isolieren und in Kultur zu halten, um weitere genetische Manipulation ermöglicht mit viralen Vektoren. Frühere Studien haben entweder akut isolierten Maus Erwachsenen CMs oder Zucht erwachsenen Ratte CMs verwendet. Letztere sind leichter zu Kultur als erwachsene Maus CMs, und die meisten Experimente Manipulation der Genexpression in vitro erwachsenen Ratte CMs verwendet. Nur wenige Studien haben erfolgreich verändert und untersucht Funktional Genexpression in Maus Erwachsenen CMs, stellt eine große Einschränkung in den Rahmen von Experimenten. Daher hier im Detail präsentieren wir solche Methoden aus früheren Untersuchungen geändert, für die Isolierung 7,8,22, Kultur 3,10,15,23, Adenovirusinfektion 11-13,15 und funktionelle Analyse von erwachsenen Maus ventrikuläre cardiomyoctyes. Diese Isolation Protokoll Ergebnisse in Ca 2 +-tolerant, erregbare Herzmuskelzellen, die wir haben, bis zu 72 Stunden erfolgreich kultiviert und transient mit Adenovirus transfiziert. Die Funktionalität dieser isolierten Zellen unter Verwendung des Abbildungssystems MMSYS 14,24 und Patch-Clamp, die auch diskutiert werden bewertet.

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Protokoll

1. Cardiomyocyte Isolation

Materialien (1)

Microdissecting Zange
Tissue Zange
Zarte Arterienklemmen
Arterienklemmen
Microdissecting, gezackt, gebogene Pinzette
Betriebsschere, gerade
Betriebsschere, gebogen
15 ml Falcon-Röhrchen (5)
60 mm Petrischale
Phosphat-gepufferte Saline (PBS)
Nylon Mesh - 400 um Porengröße
Kleiner Trichter
Wachs beschichtet, geflochten Seide 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Nicht-Injektionsnadel, stumpfes Ende, 24 G oder kommerzielle Tierernährung Nadel (24 x 1 in, W/1-1/4)
Heparin-Natrium
Ketamin / Xylazin-Mischung
Pasteur Pipetten
Optivision Dissecting Goggles
IonOptix MMSYS System

Hinweis: Wenn die Kultivierung von Zellen, siehe Abschnitt 2 auf Zellkultur vor Beginn dieses Protokoll.

Hinweis: Alle Mäuse wurden in gepflegteine Barriere Anlage und nach anerkannten IACUC Vorschriften, Verfahren und Verfahren geopfert.

Hinweis: Vor dem Beginn des Verfahrens sollte das gesamte System vorgeheizt, um sicherzustellen, dass alle Elemente der Langendorff-System (2A, Fig. 3) auf 37 ° C erwärmt, um für die richtige und vollständige Kollagenase-Aktivität zu ermöglichen.

  1. Spritzen erwachsenen Mäusen (~ 12 Wochen) mit 150 USP-Einheiten Heparin-Natrium in den Bauchraum.
  2. Betäuben mit einer Injektion einer Ketamin / Xylazin-Mischung bei einer gewichtsabhängige Dosis (Tabelle 1).
    1. 80:12 mg / kg Ketamin: Xylazin Rezept: 2,6 ml Ketamin (100 mg / ml) + 0,4 ml Xylazin (100 mg / ml) + 37 ml PBS. Finale: Ketamin = 6,5 mg / ml; Xylazin = 1 mg / ml
  3. Sichern Sie die Maus, um sediert Betriebs Pad, das Herz herauszuschneiden, und in einen Teller der Raumtemperatur PBS oder 0,9% Kochsalzlösung (Abbildung 1J). PhySIOLOGISCHE Salzlösung ermöglicht die intakte Herz für bessere Extrusion von Blut in der Kammer und eine einfache Identifizierung der Aorta vor dem Schritt 1.6 schrumpfen. Mäuse wurden überprüft, um sicherzustellen, dass sie tief über Verlust hinteren Gliedmaßen Zehenklemmreflex und Verlangsamung der Atemfrequenz vor Beginn der Thorakotomie anästhesiert.
  4. Verwenden Sie Optivision Sezieren Brille (1A) zu identifizieren und zu setzen die Aorta. Entfernen des Gewebes um die Aorta, obwohl es ermöglichen die Visualisierung des Schiffes ist für die Optimierung der Zellisolierung erforderlich, wenn der Aortenwurzel ist deutlich sichtbar.
  5. Prime die Pumpe mit Perfusionspuffer (Tabelle 2). Die Temperatur sollte bei 37 ° C für die Dauer des Verfahrens statt mit einer kontrollierten, zirkulierenden Wasserbad (2D).
  6. Montieren Sie das Herz auf die Langendorff-Apparat (Abbildung 2A). Mit zwei Mikro Präparierzange (1D-E), prime die Aorta auf der nicht-Subkutan stumpfe Nadel (24 G) mit Silikonschlauch an der distalen Spitze. Alternativ kann ein kommerziell Tierfütterungsnadel (24 x 1, W/1-1/4) verwendet werden. Der Silikonschlauch auf der 24 G Nadel oder der Fütterung Nadel für die Sicherung der Naht über der Nut zu ermöglichen. Legen Sie die Aorta auf der Nadel als Socke. (Fig. 2C).
    1. Hinweis: Es ist wichtig, sicherzustellen, dass das Ende der Nadel liegt in der aufsteigenden Aorta, im Idealfall in der Aortenwurzel distalen rechts innominate, aber dass es nicht durch die Aortenklappe in den linken Ventrikel zu verlängern, da dies stark begrenzen die Fähigkeit der Puffer wirksam durch das Herz über die Koronararterien zu perfundieren.
  7. Sichern Sie die Herzen an der Nadel durch das Binden einer kleinen Nahtlänge von Seide (7-10 cm lang) (Abbildung 1 K) um den oberen Teil der Aorta, sicherzustellen, dass die Krawatte ist auf der Ebene der aufsteigenden Aorta, unter dem rechten innominate artery, ist aber über dem Ende der Nadel.
  8. Senken die Herz in das Innere des konischen Glas (2B), um eine geeignete Umgebungstemperatur zu halten.
  9. Perfundieren das Herz mit Perfusionspuffer für 5 min bei einer Geschwindigkeit von 1 ml / min und klemmen die Glaskammer Abfluss, damit das Perfusat in den konischen Glas sammeln und umhüllen das Herz. Das Schema für den Verdau des Herzens ist in Fig. 3 gezeigt.
    1. An diesem Punkt sollten Sie das Volumen des Herzens Anstieg zu sehen. Zusätzlich wird Blut im Herzgewebe von Perfusat ersetzt werden, wodurch Gewebe Blässe.
  10. Lassen Sie den Haken, um den Abfluss Perfusat abtropfen lassen. Stoppen Sie die Pumpe, um den Schlauch von der Perfusion Pufferbehälter an das Enzym Pufferbehälter (2E) zu bewegen. Neustart der Pumpe zu beginnen, um das Herz mit Enzympuffer (Tabelle 2) bei 1 ml / min durchströmen. Klemmen Sie den Abfluss erneut, um die Enzympuffer zu umhüllen dieHerz.
    1. Hier, wie das Enzym Perfusion des Herzens und Verdauen des Bindegewebes, das Herz wird blasser und die strukturelle Integrität wird abnehmen.
    2. Um festzustellen, wann die Herzkammern aus dem verdaut Herz, heben Sie das Herz aus der konischen Glas, drücken Sie leicht die Herzen mit einer Pinzette und sammeln ein paar Tropfen Perfusat in einer kleinen Petrischale, und überprüfen Sie, ob einzelne Zellen sinken .
    3. Für den Anfänger ist es hilfreich, die Durchblutung Linie mit einem Manometer zu verbinden. Wenn das Herz immer verdaut wird der Druck rapide ab, da das Bindegewebe nicht den Widerstand zu halten. Das Manometer ist auch für den Laien, um sicherzustellen, daß die Position der Nadel oberhalb der Aortenklappe und nicht im Ventrikel. Niederdruck an, dass die Nadel in der Herzkammer und die Hochdruck angegeben, dass die Nadel des Ventils berührt.
  11. Schneiden Sie die Herzkammern aus dem Herzen in eine Schalevoll von Transferpuffer (A) (Tabelle 2), wenn der Kammerdruck beginnt zu drastisch sinken oder wenn Sie in der Lage, einzelne Zellen im Perfusat zu sehen. Dies dauert in der Regel ~ 7-10 min.
  12. Auch unter Verwendung von Mikro Präparierzange (1C), Hackfleisch die Ventrikel in kleine Stücke zu distanzieren. Eine erfolgreiche Verdauung wird fast keine festen Klumpen von Gewebe nach dem Hacken zu verlassen, mit den meisten der Gewebe amorph bei der Dissoziation.
    1. Weiter dissoziiert das Gewebe zu pipettieren, die Lösung in / mit Hilfe einer Pasteurpipette aus Kunststoff (Fig. 4), von dem die Spitze zu einem Durch ~ 45 ° Winkel geschnitten. Diese Änderung dient dazu, die Innendurchmesserfläche von der Pipettenspitze so Verringern der Menge an Scherspannung auf die Zellen, während das Gewebe verrieben erhöhen.
    2. Vor der Zerlegung des Gewebes mit der Pinzette ist es möglich, die einzelnen Kammern zu trennen und separat zu dissoziieren Vorhof, linksventrikulärer oder Rechtt ventrikuläre Zellen.
  13. Sichern Sie die quadratischen Maschen (Abbildung 1 M) zu einem kleinen Trichter (Abb. 1 l) mit Schellen und legen diese Filtervorrichtung in eine 15 ml-Falcon-Röhrchen (1I).
  14. Verwenden Sie die modifizierte Pasteur-Pipette, um die Zell-Lösung aus der Schale entfernen und filtern Sie die Lösung in den Falcon-Röhrchen.
  15. Lassen Sie die lebenden Zellen auf den Boden des Röhrchens absetzen (live Zellzentrifugation sollte 2-4 Minuten dauern).
  16. 2,5 ml Aliquot jeder der vier Calciumlösungen (Tabelle 3) in 4 separate 15ml Falcon-Röhrchen.
  17. Wiederum unter Verwendung eines Standard-Pasteurpipette vorsichtig die Zellpellets aus dem Boden des Röhrchens und die Übertragung der Zellen an die erste der Calciumlösungen.
  18. Lassen Sie die Zellen auf den Boden des Röhrchens absetzen und wiederholen Sie Schritt 1.17 in den nachfolgenden Calciumlösungen, bis sich die Zellen in der letzten Lösung.
  19. Lassen Sie sich nicht die Zellen in der fourt niederh Calciumlösung. Das Röhrchen und drehen Sie ihn auf die Seite.

2. Zellkultur

  1. Bevor die Isolation, Platte 1 ug / ml Natur Maus Laminin auf Deckgläser und Inkubation für mindestens 1 h bei 37 ° C und 2% CO 2. Damit auch Ihre Plattieren und Kulturmedien (Tabelle 4) im Brutschrank bei 37 ° C erwärmen und 2% CO 2. Dies ermöglicht das gelöste CO 2 in den Medien, um zu äquilibrieren.
    1. Darf die von den Medien nicht entfernen. Einfach die oben lösen, um eine Kontamination zu vermeiden.
  2. Ermöglichen die isolierten Zellen auf dem Boden des Falcon-Röhrchen pelletieren.
  3. Entfernen Sie das Pellet mit einem Standard-Kunststoff-Pasteur-Pipette resuspendieren und in der entsprechenden Menge an Beschichtung Medien.
  4. Platte der Zellen auf Laminin-beschichtete Deckgläser in die entsprechende Größe Schale und Inkubation in 37 ° C und 2% CO 2 für mindestens 30-60 Minuten, damit sich die Zellen an den Deckgläsern haften.
  5. ** Wenn die Transfektion mit Adenovirus, verdünnen das Virus in einer geeigneten Menge Plattierungsmedien und ersetzen Sie den Plattenmedien in die Schüssel mit den virushaltigen Medien. Inkubieren ließ das Virus an die Zellen für 2 h bei 37 ° C und 2% CO 2. **
  6. Entfernen Sie den Plattenmedien aus der Schüssel und ersetzen mit Kulturmedien.
  7. Das Kulturmedium jeden Tag sorgfältig zu ändern, um nicht die Zellen auf dem Deckgläschen stören.

Mit diesem Verfahren Zellen wurden erfolgreich bis zu 72 h kultiviert. Bilder von kultivierten und GFP-transfizierten Zellen in 5 zu finden.

3. MMSYS-System

  1. Schalten Sie das System MMSYS sicherzustellen, dass die Bogenlampe der ersten Aufnahme.
  2. Verbinden der Rohre von der Pumpe zu dem entsprechenden Einlaß und Auslässen der MMSYS Kammer (6).
  3. Prime das System mit Calciumpuffer (B) (Tabelle 2).
  4. Legen Sie eine ca.opriately große Deckglas in die Kammer und fasten (6E). Die meisten MMSYS Kammern entweder 22 mm oder 25 mm im Quadrat Deckgläser. Fragen Sie Ihren MMSYS Bedienungsanleitung, um die entsprechende Deckglas für Ihre Kammer zu bestimmen.
  5. Transfer 500 ul der Zelllösung zu einem kleinen Eppendorf-Röhrchen.
  6. In 0,5 ul Fura2-AM (Stammlösung von 1 ug / ul) an die Röhrchen von Zellen und es ihnen ermöglichen, im Dunkeln bei RT für 5-7 min inkubiert. Dies ermöglicht die Fura2-AM auf "Last" in die Zellen durch schnelle passive Diffusion durch die Zellmembran.
    1. Lassen die Fura-2 beladenen Zellen zu pelletieren, um den Boden des Röhrchens, und Waschen des überschüssigen Fura mit 500 &mgr; l Puffer B. Calcium
  7. Schalten Sie die Raumbeleuchtung.
  8. Mit einem Standard-Pasteur-Pipette, lassen Sie 1-2 Tropfen (abhängig von der Zellkonzentration) der "geladen" Zell-Lösung in die Mitte der Kammer (6C) und damit die Zellen to auf dem Deckglas für ca. 5 min.
    1. Die Dichte der Zellen in der Kammer sollte so sein, dass einzelne nicht-überlappenden Zellen leicht in die MMSYS Datenerfassungsplattform betrachtet werden.
  9. Sorgfältig zu fließen beginnen Calciumpuffer (B) durch die Kammer.
  10. Erhöhung der Kammertemperatur auf 37 ° C
    1. WICHTIG: auf dem Heizgerät nicht einschalten, bis der Fluss eingeleitet wurde. Dies kann zu schweren Schäden das Feedback Thermoelement (6A).
  11. Stellen Sie sicher, dass die Kammer zu der MyoPacer verbunden über die Anschlussdrähte (6B) und beginnen, die Zellen bei 1,5 x die Reizschwelle für die Zellen Tempo 5 Hz.
  12. Wählen Sie eine Zelle, die mit der richtigen Frequenz zu schlagen ist, und verschieben Sie sie in die Rahmenöffnung.
  13. Einstellen der Kamera-und Framing-Öffnungsabmessungen, so dass die gesamte Zelle ist in der Mitte des Fensters, in Horizontalrichtung mit dem AP sarcomeresElternteil.
    1. Für Zellenlänge einstellen roten und grünen (rechts und links) Photodiode Indikatoren an den Rand der Zelle. Stellen Sie den Kontrast, um die Schwarz / Weiß-Kontrast an den Rändern der Zelle zu optimieren. Finden Sie in der Bedienungsanleitung Ionoptix für weitere Details.
  14. Legen Sie die Box in einem Bereich der Zelle mit gut definierten Sarkomere und stellen Sie den Fokus auf den Gipfel des Leistungsspektrums (rot) zu optimieren. Auch die Helligkeit des Mikroskops, um die blaue Glättung Fenster und schwarze Kontrastinformationen optimieren.
  15. Stellen Sie die grünen Balken Schwelle, so viel von dem roten Leistungsspektrum (peak) und so wenig wie möglich zu erfassen Hintergrund.
  16. Starten Sie die Aufnahme.
  17. Nachdem genügend Daten aufgezeichnet worden sind, klicken Sie auf "Pause", um die Aufnahme vorübergehend zu stoppen und sicherzustellen, dass weder der Fokus noch Dimensionen des Sichtfensters verändert, bewegen des Mikroskops Bühne zu einem Bereich des Deckglases, in dem keine Zellen oder Zellmaterial sein kann gesehen. Length der Aufnahme variiert je nach Versuchsprotokoll für den Prüfer.
    1. Hinweis: Klicken Sie auf "Stop" wird die Aufnahme zu beenden und keinen Hintergrund in der Lage, für diese Zelle aufgenommen werden.
  18. Klicken Sie auf "Fortsetzen", um eine Hintergrundmessung aufzuzeichnen.
  19. Nachdem genügend Hintergrund wurde gespeichert klicken Sie auf "Stop", um die Aufnahme zu beenden.
  20. Klicken Sie auf "Datei >> Speichern", um alle Spuren für diese Zelle in einem einzigen. Zpt Datei zu speichern.
  21. Wiederholen Sie die Schritte von 3,12 bis 3,20, bis genügend Zellen aufgenommen wurden.
  22. Wenden IonOptix-MMSYS Benutzerhandbuch 12 Anweisungen zur Analyse der aufgezeichneten Daten. Charakteristisch aufgezeichneten Daten von Wildtyp-Kardiomyozyten sind in Abbildung 7 dargestellt.

4. Patch-Clamp-

Patch-Clamp von verschiedenen Zelltypen wurden zuvor auch in dieser Zeitschrift 25-28 beschrieben. Wir haben daher auf einige Kritiker konzentrierenal-Parameter für eine erfolgreiche Patch-Clamp von adulten Kardiomyozyten isoliert über unser Protokoll beschrieben.

  1. Mit einer Pipette Abzieher und Borosilikatglas (mit Faden: OD 1,5 mm, ID 0,86 mm - 10 cm Länge) ziehen eine Pipette, die ~ 2,0-3,0 MOhm, wenn sie mit Pipettenlösung (Tabelle 5) gefüllt aufweist.
  2. Brandlack die Pipettenspitze vorsichtig mit einem Narishige oder anderen vertikalen Brandpolierer. Der Widerstand der Patch-Pipette sollte 2-4 MO nach Feuerpolitur sein.
  3. Schalten Sie den Computer, Verstärker (Axopatch 200B), AD-Wandler (Digidata 1440A, Axon Instruments) und Mikromanipulator (MP-285). Für ganze Zelle Patch-Clamping, beginnen wir mit Standard-Parameter wie zuvor beschrieben.
  4. Für kultivierten adulten CMs, entfernen Sie sie aus dem Inkubator und vorsichtig waschen das Deckglas auf dem die CMs werden mit PBS bei Raumtemperatur beschichtet.
  5. Entfernen Sie vorsichtig das Deckglas und legen Sie sie in der Perfusions-Kammer auf der inversen Mikroskop (Nikon TE 2000).
    1. Sicherzustellen, dass der Einlass für das Perfusionssystem und Auslass (Saug) sind gerade über die Oberfläche des Deckglases.
  6. Starten Perfusion mit der entsprechenden extrazellulären Lösung (Tabelle 5).
  7. Für frisch gewonnenen Erwachsenen CMs, legen Sie ein Collagen-beschichteten Deckglas in der Perfusions-System wie oben.
    1. Da die Zellen in Lösung, leicht ersetzen die Lösung mit extrazellulären Puffer.
  8. Mit dem modifizierten Pasteur-Pipette (Abbildung 4) vorsichtig resuspendieren in der extrazellulären Puffer, einen aliquoten und legen Sie es auf dem Deckglas.
  9. Lassen Sie die Zellen legen 10-15 min vor Beginn der Durchblutung, wie in 4.4.
  10. Back-füllen die ganze Zelle Patch-Pipette mit intrazellulären Puffer unter Verwendung eines Microfil (World Precision Instruments, 28 G) Nadel. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spitze der Pipette, vorsichtig auf, damit die Luftblasen an die Oberflä schwebence der Lösung.
  11. Bringen Sie die gefüllte Patch-Pipette in die Pipettenhalter, so dass ein Kontakt zwischen der Mikroelektrode und der internen Lösung.
    1. Wir verwenden Silberchlorid-Elektroden, aber kümmern 'chloriding' die Silberdrähte mindestens einmal in der Woche über Nacht in Haushaltsbleichmittel eingetaucht.
  12. Senken Sie die Pipette in das Bad, so dass das Bad Elektrode wird zu allen Zeiten in dem Bad / extrazellulären Lösung eingetaucht. Offset keine Flüssigkeitsgrenzpotentiale zu diesem Zeitpunkt. Große Kreuzung Potentiale kann ein Zeichen von schlechter Silberchlorid auf den Elektroden sein.
  13. Gesunden erwachsenen zylindrischen CMs im Mikroskop identifiziert und in das Sichtfeld zentriert. Wie zuvor beschrieben, eine Kombination der Bewegung des Mikromanipulators und Einstellen des Fokus ermöglicht Nähe der Patch-Pipette und die Oberfläche des CM.
    1. Sobald sie in der gleichen Brennebene sind, verwenden wir eine Kombination von visuellensierung der Zelle und Testimpuls (verfügbar in der Axopatch 200B).
    2. Sobald der Widerstand der Pipette in die Hälfte abnimmt (was darauf hindeutet, dass die Pipette in Kontakt mit der Oberfläche der Zelle), und die Zelle weiterhin zylindrischen sehen, schaffen wir Gigaohm Dichtung mit leichtem Saugen.
    3. Für CMs, bevorzugen wir den Mund Saug-Unterdruck aufzubauen. Wenn ein Gigaseal erfolgreich erhalten wird, verwenden wir wieder sanften rhythmischen Sog Mund zu "Einbruch" in die Zelle zu Zelle ganze Patch-Modus zu etablieren.
  14. Typische Ruhepotentiale von gesunden CMs sind in der Größenordnung von -85 bis -90 mV. Sobald ein Gigaseal erhalten wird, messen die Ruhemembranpotential mit Stromzange mit I = 0 pA.
    1. Wenn das Ruhemembranpotential depolarisiert dies zeigen eine beschädigte Zelle oder eine schlechte Abdichtung.
  15. Da die CMs sind große Zellen mit viel Fläche braucht Aufmerksamkeit zu zahlen, um Kompensationskapazität, vor allem wHenne schnell aktivierenden Ströme wie das Natriumkanal muss untersucht werden. Wenn ausreichende Kapazität Entschädigung kann nicht erhalten werden unter Verwendung der Entschädigung Einstellungen auf dem Pulsgenerator gebaut, Vorimpulsen bei Unterschwellenspannung und entgegengesetzter Polarität können angewendet werden und der resultierende Strom aus dem aufgezeichneten Signal subtrahiert. Ein solches Protokoll ist leicht in Axopatch programmiert.
  16. Sobald ganze Zelle Patch-Modus eingerichtet wurde, warten Sie 15 min bis zum Gleichgewichtseinstellung zu ermöglichen und um die Stabilität der Dichtung vor Beginn Spannungs-oder Stromzange Protokolle gewährleisten. Wir verwenden Standard-Protokolle, die zuvor in dieser beschrieben wurden, und andere Fachzeitschriften und wird nicht weiter ausgeführt werden.

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Ergebnisse

Die Isolierung von adulten cardiomyoctyes Ergebnisse in stabförmigen, gestreift und Ruhe (nicht spontan schlag)-Zellen (Abbildung 5A). Tote Zellen aussehen wird gerundet und keine Riefen werden anwesend sein. Ruhende Zellen können kultiviert und mit Adenovirus-Gen-Expression (Fig. 5B und 5C) zu manipulieren, transfiziert werden. Nach 24 h der Kultur, ist die Morphologie der lebenden Zellen nicht ändern, sind sie noch Ca 2 +-tolerant, und sie können durch Feld...

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Diskussion

In diesem Bericht haben wir die notwendigen Techniken für eine erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von adulten CMs von der Maus Herz beschrieben. Unsere Technik kann für die anschließende Untersuchung der Funktion und CM Erregbarkeit unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren. Der kritische Parameter für das Studium der Erwachsenen CMs Funktionalität ist die Gesundheit und Qualität der isolierten CMs. Wie oben beschrieben, ermöglichen eine hohe Ausbeute an funktionellen Zellen zugänglich Manipulation der Gen...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
NatriumchloridSigmaS7653
KaliumchloridSigmaP9333
MagnesiumchloridSigmaM8266
HEPESSigmaH3375
Natriumphosphat MonobasischSigma S8282
D-Glukose MinimumSigmaG8270
TaurinSigmaT0625
2,3-Butandion-MonoximSigmaB0752
Kollagenase BRoche Applied Science11088807001
Kollagenase DRoche Applied Science11088858001
Protease XIV aus Streptomyces griseusSigmaP5147
Albumin aus RinderserumSigmaA2153
CalciumchloridSigmaC8106
Minimum essentielle MedienSigma51411C
Albuminlösung aus RinderserumSigmaA8412
L-GlutaminSigmaG3126
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Insulin-Transferrin-Natriumselenit-Medien ErgänzungSigmaI1884
CäsiumchloridSigma289329
GlutamatSigma G3291
Adenosin 5'-triphosphatMagnesiumsalz SigmaA9187
Ethylenglykol-bis(2-amin– thylether)-N,N,N',N'-TetraessigsäureSigmaE3889
Cäsiumhydroxid-LösungSigma232041
Tetraethylammoniumhydroxid-LösungSigma86643
OptiVisor binokulares Visier aus optischem GlasDohegan Optical Company Inc.N/A
Gewebezange, 5.5", 1x2 ZähneRoboz ScientificRS-8164
Moloney Pinzette - 4.5" (11.5 cm) lange leichte Kurve, gezahnt Roboz ScientificRS-8254
Dumont #3 Pinzette, Dumostar, Spitzengröße 0.17 x 0.10mmRoboz ScientificRS-4966
Packer Mosquito Pinzette 5" Gerade FlachRoboz ScientificRS-7114
Mikro-Präparierschere 4,5" gebogen scharf/scharf Roboz ScientificRS-5917
Mikro-Präparierschere 3,5" gerade scharf/scharf20mmRoboz ScientificRS-5907

Referenzen

  1. Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
  2. Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for human-disease models. Nat. Cell Biol. 9, 993-999 (2007).
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