Hier beschreiben wir die Isolierung von adulten Maus cardiomyoctyes mit einem Langendorff-Perfusion-System. Die resultierenden Zellen sind Ca2 +-tolerant, elektrisch Ruhe und kultiviert und mit Adeno-oder Lentiviren, um die Genexpression zu manipulieren transfiziert werden. Ihre Funktionalität kann auch mit dem MMSYS System und Patch-Clamp-Techniken analysiert werden.
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Methodenartikel
Isolierung, Kultur, und funktionelle Charakterisierung der erwachsenen Maus Cardiomyoctyes
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verwendung von primären Kardiomyozyten (CMS) in der Kultur hat eine leistungsstarke Ergänzung zu Mausmodellen von Herzerkrankungen in unser Verständnis von Herzerkrankungen ist. Insbesondere haben die Fähigkeit, Ionen-Homöostase, Ionenkanal-Funktion, Mobil Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion Kupplung und deren Veränderungen in erkrankten Bedingungen und durch krankheitsverursachende Mutationen zu studieren, um wichtige Erkenntnisse zu Herzerkrankungen geführt. Darüber hinaus haben der Mangel an einer angemessenen immortalisierten Zelllinie zu Erwachsenen CMs imitieren, und die Grenzen der Neugeborenen-CMs (die viele der strukturellen und funktionellen Biomechanik Merkmal der Erwachsenen fehlt CMs) Kultur in unserem Verständnis der komplexen Zusammenspiel zwischen Signalwege behindert, Ionenkanäle und kontraktilen Eigenschaften im erwachsenen Herzen Stärkung der Bedeutung des Studiums Erwachsenen isoliert Kardiomyozyten. Hier sind Verfahren zur Isolierung und Kultur, die Manipulation der Genexpression durch adenoviral expre präsentieren wirssed Proteine, und anschließende funktionelle Analyse von Kardiomyozyten aus der adulten Maus. Die Verwendung dieser Techniken wird dazu beitragen, mechanistischen Einblick in die zellulären Signalwege, die Erregbarkeit zu regulieren, Ca 2 + Dynamik und Kontraktilität zu entwickeln und eine viel physiologisch relevante Charakterisierung von Herz-Kreislauf-Krankheit.
Einleitung
Murine Modelle von Herz-Kreislauf-Krankheit wurden als effektive Werkzeuge für die Aufklärung grundlegender Krankheitsmechanismen 1,2 als auch für potenzielle therapeutische Ziele 1,3 serviert. Insbesondere haben die Verwendung von sowohl murinen Modellen von erworbenen Herzerkrankungen (wie beispielsweise Druck-Überlast) von 4,5 und einer transgenen Mausmodellen unser Verständnis von Herzerkrankungen 6-8 vorgerückt. Die Verwendung von Zellkulturtechniken, um Signalkaskaden 3,9,10 und Änderungen in einzelne Proteine, die zelluläre Erregbarkeit und Erregung und Kontraktion unterliegen Kupplung im Herzen....
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Protokoll
1. Cardiomyocyte Isolation
Materialien (1)
Microdissecting Zange
Tissue Zange
Zarte Arterienklemmen
Arterienklemmen
Microdissecting, gezackt, gebogene Pinzette
Betriebsschere, gerade
Betriebsschere, gebogen
15 ml Falcon-Röhrchen (5)
60 mm Petrischale
Phosphat-gepufferte Saline (PBS)
Nylon Mesh - 400 um Porengröße
Kleiner Trichter
Wachs beschichtet, geflochten Seide 4-0, 19 mm, 7-10 cm lang
Nicht-Injektionsnadel, stumpfes Ende, 24 G oder kommerzielle Tierernährung Nadel (24 x 1 in, W/1-1/4)
Heparin-N....
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Ergebnisse
Die Isolierung von adulten cardiomyoctyes Ergebnisse in stabförmigen, gestreift und Ruhe (nicht spontan schlag)-Zellen (Abbildung 5A). Tote Zellen aussehen wird gerundet und keine Riefen werden anwesend sein. Ruhende Zellen können kultiviert und mit Adenovirus-Gen-Expression (Fig. 5B und 5C) zu manipulieren, transfiziert werden. Nach 24 h der Kultur, ist die Morphologie der lebenden Zellen nicht ändern, sind sie noch Ca 2 +-tolerant, und sie können durch Feld.......
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Diskussion
In diesem Bericht haben wir die notwendigen Techniken für eine erfolgreiche Isolierung und Kultivierung von adulten CMs von der Maus Herz beschrieben. Unsere Technik kann für die anschließende Untersuchung der Funktion und CM Erregbarkeit unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren. Der kritische Parameter für das Studium der Erwachsenen CMs Funktionalität ist die Gesundheit und Qualität der isolierten CMs. Wie oben beschrieben, ermöglichen eine hohe Ausbeute an funktionellen Zellen zugänglich Manipulation der Gen.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Natriumchlorid | Sigma | S7653 | |
| Kaliumchlorid | Sigma | P9333 | |
| Magnesiumchlorid | Sigma | M8266 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Natriumphosphat Monobasisch | Sigma S8282 | ||
| D-Glukose Minimum | Sigma | G8270 | |
| Taurin | Sigma | T0625 | |
| 2,3-Butandion-Monoxim | Sigma | B0752 | |
| Kollagenase B | Roche Applied Science | 11088807001 | |
| Kollagenase D | Roche Applied Science | 11088858001 | |
| Protease XIV aus Streptomyces griseus | Sigma | P5147 | |
| Albumin aus Rinderserum | Sigma | A2153 | |
| Calciumchlorid | Sigma | C8106 | |
| Minimum essentielle Medien | Sigma | 51411C | |
| Albuminlösung aus Rinderserum | Sigma | A8412 | |
| L-Glutamin | Sigma | G3126 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Insulin-Transferrin-Natriumselenit-Medien Ergänzung | Sigma | I1884 | |
| Cäsiumchlorid | Sigma | 289329 | |
| Glutamat | Sigma G3291 | ||
| Adenosin 5'-triphosphat | Magnesiumsalz Sigma | A9187 | |
| Ethylenglykol-bis(2-amin– thylether)-N,N,N',N'-Tetraessigsäure | Sigma | E3889 | |
| Cäsiumhydroxid-Lösung | Sigma | 232041 | |
| Tetraethylammoniumhydroxid-Lösung | Sigma | 86643 | |
| OptiVisor binokulares Visier aus optischem Glas | Dohegan Optical Company Inc. | N/A | |
| Gewebezange, 5.5", 1x2 Zähne | Roboz Scientific | RS-8164 | |
| Moloney Pinzette - 4.5" (11.5 cm) lange leichte Kurve, gezahnt | Roboz Scientific | RS-8254 | |
| Dumont #3 Pinzette, Dumostar, Spitzengröße 0.17 x 0.10mm | Roboz Scientific | RS-4966 | |
| Packer Mosquito Pinzette 5" Gerade Flach | Roboz Scientific | RS-7114 | |
| Mikro-Präparierschere 4,5" gebogen scharf/scharf | Roboz Scientific | RS-5917 | |
| Mikro-Präparierschere 3,5" gerade scharf/scharf20mm | Roboz Scientific | RS-5907 |
Referenzen
- Chlopcikova, S., Psotová, J. Neonatal rat cardiomyocytes-a model for the study of morphological, biochemical and electrophysiological characteristics of the heart. Biomedical Papers. , (2001).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse asce....
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Nachdrucke und Genehmigungen
