Direct Imaging von Calcium ER mit Targeted-Esterase Induzierte Dye Loading (TED)

Zusammenfassung

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED) unterstützt die Analyse der intrazellulären Kalzium-Speicher der Dynamik von Fluoreszenz-Bildgebung. Das Verfahren stützt sich auf Targeting eines rekombinanten Carboxylesterase zum Endoplasmatischen Retikulum (ER), wo es verbessert die lokale Entlarvung von synthetischen niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen.

Zusammenfassung

Visualisierung Kalziumdynamik ist wichtig, die Rolle von Calcium in der Zellphysiologie zu verstehen. Um Kalzium Dynamik zu untersuchen, wurden synthetische fluoreszierenden Ca ^{2 +} Indikatoren populär geworden. Hier zeigen wir, TED (= gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Laden), eine Methode, um die Freisetzung von Ca ^{2 +} zu verbessern Indikatorfarbstoffe in das ER-Lumen verschiedener Zelltypen. Bisher wurde in TED-Zelllinien, Gliazellen und Neuronen in vitro verwendet. TED basiert auf effizienten, rekombinanten Targeting von einer hohen Aktivität Carboxylesterase dem ER-Lumen mit Vektor-Konstrukte, die ausdrückliche Carboxylesterasen (CES). Die neuesten TED Vektoren enthalten ein Kernelement CES2 fusioniert an ein rot fluoreszierendes Protein, wodurch gleichzeitige zweifarbige Bildgebung. Die Dynamik des freien Calcium in der ER sind in einer Farbe abgebildet, während die entsprechende ER Struktur erscheint in rot. Zu Beginn des Verfahrens werden die Zellen mit einem Lentivirus transduziert. Anschließend werden die infizierten Zellen einere auf Deckgläsern ausgesät, um endlich ermöglichen Live Cell Imaging. Dann lebenden Zellen werden mit dem Acetoxymethylester (AM-Ester) Form niedriger Affinität Ca ^{2 +} inkubiert Indikatoren, zum Beispiel Fluo5N-AM, Mag-Fluo4-AM, oder Mag-Fura2-AM. Die Esterase-Aktivität im ER spaltet hydrophoben Seitenketten vom AM Form des Ca ^{2 +-Indikator} und einem hydrophilen fluoreszierenden Farbstoff / Ca ^{2 +-Komplex} gebildet wird, und eingeschlossen in das ER-Lumen. Nach Farbstoffbeladung, werden die Zellen mit einem invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop analysiert. Die Zellen werden kontinuierlich mit Ringer-ähnliche Lösungen perfundiert und die ER Calcium Dynamik direkt visualisiert Zeitraffer-Bildgebung. Calcium-Freisetzung aus dem ER wird durch eine Abnahme der Fluoreszenz-Intensität in Regionen von Interesse identifiziert, während das Nachfüllen der ER Calcium Speicher erzeugt eine Zunahme der Fluoreszenzintensität. Schließlich wird die Änderung in der Fluoreszenzintensität über die Zeit durch Berechnung der AF / F ₀ bestimmt.

Einleitung

Um physiologischen Calcium Reaktionen des ER zu beheben, haben wir eine neue Strategie, um das Einfangen von synthetischen Calcium sensitiven Farbstoffen in die Notaufnahme zu verbessern. Das Verfahren ermöglicht die direkte, nicht-störende Echtzeit-Überwachung des freien ER Calcium in Gegenwart von extrazellulärem Calcium.

Funktion und Signalisierung von ER Calcium

Calcium-Signale werden in verschiedenen Zelltypen, zB Muskelzellen, Neuronen und Gliazellen und ihre Funktionen reichen von der Vermittlung Muskelkontraktion zu einer Beteiligung an der synaptischen Übertragung in Lernen und Gedächtnis ^1,2 gefunden. Änderungen im freien Calcium-Konzentration sind von hohem wissenschaftlichen Interesse, da Calcium in der Regulation der Gen-Transkription, Proliferation, neuronale Erregbarkeit, Zelltod und anderen Zelle Signalwege ^1-7 beteiligt ist. All diese zellulären Calcium-Signale sind funktional verbunden sind und dazu beitragen, Calcium intrazellulärestore Dynamik ^8-10.

Ein gemeinsames Merkmal aller Calcium-Signale ist der Fluss von Kalzium zwischen dem extrazellulären Raum, die Cytosol und Organellen, vor allem die ER und Mitochondrien. Dies bewirkt dynamische Änderungen der Calciumkonzentration innerhalb dieser Organellen, die von verschiedenen Signalkomponenten erfasst werden. Im Allgemeinen ist die Calcium-Konzentration in der ER zwischen 100 bis 800 um, in das Cytosol der Calcium-Konzentration in der Nähe von 100 nm und in den extrazellulären Raum die Konzentration etwa 1-2 mM. Dementsprechend gibt es eine hohe chemische Antriebskraft für Calcium Strömung zum Cytosol ^2,9,10.

Die am häufigsten untersuchten ER abgeleiteten Calcium Signale abhängig von der Stimulation der G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die dann aktiviert Phospholipase C (PLC). PLC erzeugt wiederum Inositol 1,4,5-triphosphat (IP ₃₎ ^1. Bei der Bindung von IP ₃ seiner receptor (IP _3-Rec, Abbildung 1) in der ER-Membran, werden Kalzium-Ionen aus dem ER-Lumen freigesetzt. Historisch gesehen, war IP _{3-vermittelte} Calcium-Freisetzung aus dem ER ersten - obwohl indirekt - gemessen in acinar Zellen der Bauchspeicheldrüse durch Streb et al 1983 ^11.. Diese Veröffentlichung vorgeschlagen erstmals eine Signalkaskade mit Acetylcholin, Phospholipase C und IP _3. Diese Art der Calcium-Freisetzung wird allgemein als IP _{3-induzierten} Calcium-Freisetzung (IICR) (Abbildung 1). Kinase-abhängige Aktivierung von Phospholipase C &ggr; durch Rezeptor-Tyrosinkinasen Verbindungen die Wirkung von Wachstumsfaktoren und neurotrophe Faktoren ER Calciumsignaltransduktion nach IP ₃ Erhebung ^12. Neben IICR kann Calciumerhöhung durch ionotropen Calcium Eintrag vermittelt werden, zum Beispiel über spannungsabhängigen Calcium-Kanäle (Ca _V) und anschließender Calcium-induzierten Calcium-Freisetzung (IKRK) von ryanodine reRezeptoren (RyR). IICR und CICR sind physiologisch Calcium-Shop-Eintrag (SOCE) verknüpft. SOCE umfasst die Wirkung von STIM (Stroma interagierende Molekül), die ein Sensor für ER Calcium-Freisetzung ist. STIM hat sich gezeigt, extrazellulären Calcium Eintrag durch transient receptor potential-Kanäle (Trp) ^13, Orai Kalziumkanäle ¹⁴ und sogar spannungsabhängigen Calcium-Kanäle ¹⁵ (Abbildung 1) zu stimulieren. Loss of ER Calcium wird dynamisch durch die Wirkung der sarco-endoplasmatischen Retikulum Calcium ATPase (SERCA), die aktiv Pumpen Calcium in die ER gerettet. Das Blockieren der SERCA mit Medikamenten wie thapsigargin enthüllt einen kontinuierlichen Verlust von Kalzium ER zum Zytosol. Das ER Calcium "Leck" wird durch ER intramembrane Porenkomplexe wie Sec61 Protein-Komplex ^16,17 (Abbildung 1) verursacht.

In 1998 veröffentlichte Berridge ein Modell, das "Neuron innerhalb eines Neurons model", which schlägt ein Prinzip physiologische Rolle des ER bei der Integration von neuronalen ^Calcium-5. Dieses Modell berücksichtigt die Existenz eines kontinuierlichen ER-Membran-System bildet eine intrazelluläre "Bild" des neuronalen Plasmamembran ^5. Diese binäre eukaryotischen Membran-System wurde behauptet, eine Grundvoraussetzung für zeitliche und räumliche Integration von schnellen und langsamen Calcium-Signale in Neuronen. Calcium-Signale auftreten, die entweder gleichzeitig oder anschließend in verschiedenen Stacheln oder Dendriten des gleichen Neurons zu der Zelle soma oder Kern über das ER, wo sie bis ^5,18 summiert verliehen. Dann kann ihre Summe haben Auswirkungen auf die Erregbarkeit des Neurons, die Regulierung der Gen-Transkription oder Integration von Signalkaskaden. Somit unterstützt die ER die Integration von Calcium-Signale. Eine Voraussetzung für dieses Konzept ist die Kontinuität des ER in einer einzigen Zelle, die durch mehrere Studien in Anspruch genommen wurde und das hat zumindest für somato-d erwiesenendritic Bereichen und kurze Strecke axonalen Projektionen ^19-21. Ob es ER Kontinuität innerhalb langen axonalen Projektionen ist eine Angelegenheit der Debatte.

Strategien, um den Fluss der freien Calcium über die ER-Membran zu messen

Calcium-Signale werden am häufigsten in das Cytosol ^22,23 überwacht. Es kann daher nicht leicht zu unterscheiden, ob ^{Ca2 +} in das Cytosol von extrazellulären oder intrazellulären Speichern ^6,24 fließenden werden. Um diese Beschränkung zu überwinden, wurden methodische Strategien zur direkten ER Calcium Imaging entwickelt. Zusammenfassend sind die folgenden Strategien: (1) ER-Protein gezielt gentechnisch-Indikatoren ^25-27 Protein-basierten Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren} verwenden die Biolumineszenz Protein GFP Äquorin oder in Kombination mit einem Calcium-sensitiven Proteins.. Diese gentechnisch veränderten Ca ^{2 +-Indikatoren} (GeCIS) kannder ER mit Hilfe eines Signalpeptids ausgerichtet sein und sich aktiv an der ER mit einem Aufbewahren und Abrufen Motiv gehalten. Gemeinsame ER Ca ^{2 +-Indikatoren} basieren auf der Cameleon-Prinzip und sind die Cameleon YC4.3 ^26,28; Cameleon Split YC7.3ER ²⁹ und ³⁰ Cameleon D1. (2) Direkter Esterase-basierte Farbstoff Laden von AM-Ester niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren ^31,32. AM-Derivate der Indikatorfarbstoffe (Mag-Fura2-AM, Mag-Fluo4-AM oder Fluo5N-AM) gehen die biologischen Membranen in einem lipophilen, Calcium-und Kleinschreibung Zustand. Dann wird in das Cytosol und im ER freizugeben endogene Esterasen gespalten des AM-Estergruppe und die Ca ^{2 +-Indikator,} hinterlässt eine bestimmte Menge des aktiven Farbstoff im Cytosol und im ER. Daher ist dieser Ansatz unter den Bedingungen einer hohen Calcium-Konzentration in der ER nützlich, solange der cytosolischen Calciumkonzentration bleibt weit unter dem deNachweisgrenze der niedriger Affinität Indikatoren, insbesondere während der charakteristischen Calcium-Signale (zB nM bis niedrig uM). (3) AM-Ester Belastung in Kombination mit Plasmamembran Permeabilisierung ^32. Ein verbleibender zytosolischen Ca ^{2 +-Indikator} durch Plasmamembran Permeabilisierung mit geringen Mengen eines "mild" Reinigungsmittel (z. B. Saponin) in einem künstlichen intrazelluläre Puffer entfernt. Somit können die intrazellulären Membranen angeregt werden, zB mit IP ₃ in der intrazellulären Puffer direkt durch "Poren" in der Plasmamembran. (4) Dialyse des Cytosol unter Whole-Cell-Konfiguration und gleichzeitige Messungen von Ca ^{2 +} in das ER-Lumen und das Cytosol ^32,33. Zelle zuerst mit einer niedrigen Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Mag-Fura2 geladen AM, ratiometrischen, UV-Licht). Danach mit Hilfe eines Patch-Pipette, verbleibende cytosolic niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikator} aus dem Cytosol mit einem Puffer, der eine hohe Affinität Ca ^{2 +-Indikator} (zB Fluo-3, sichtbares Licht) dialysiert. Diese Strategie ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von zytosolischen und ER abgeleiteten Signale. (5) Gezielte-Esterase-induzierte Farbstoffbeladung ^8,34. A Carboxylesterase (CES) mit dem Lumen des ER gezielte und bietet eine hohe Esterase-Aktivität für eine effiziente Abfangen des AM-Ester Form niedriger Affinität Ca ^{2 +-Indikatoren.}

Gezielte-Esterase-induzierten Farbstoff Belastung (TED)

Zur Verbesserung der Ausrichtung der niedriger Affinität Ca ^{2 +} Indikatoren zur ER-Lumen, wurde TED entwickelt. TED erfordert die Überexpression eines ER gezielte Maus Carboxylesterase (CES2) (Abbildung 2), die über Expressionskonstrukte erreicht wird. Zellen, die ein rekombinantes CES-Konstrukt mit dem AM-Ester Form eines Calcium inkubiertIndikator-Farbstoff (Fluo5N-AM, Abbildung 2). Dann wird in dem ER wird der Farbstoff auf die Ca ^{2 +} umgewandeltes empfindlich, undurchlässigen Membran Ca ^{2 +-Indikator-Komplex} (Fluo5N/Ca ^{2 +)} durch die hohe Esterase daher Einfangen der Farbstoff in einer hohen Konzentration in der ER-Lumen ^{8 , 34.} Die Methode ist besonders nützlich, um ER Calcium-Freisetzung über die IICR-Bahnen zum Beispiel untersuchen, über metabotropic, purinergen-oder Glutamat-Rezeptoren ^8,34 und ER Calciumentzug visualisieren über "Leck-Kanäle" direkt, zum Beispiel nach Blockade der SERCA ^{17 , 34.} Um unsere Erfahrungen die Low-Affinität Ca ^{2 +-Indikator} Fluo5N-AM ist derzeit die beste verfügbare Indikator mit dem TED Farbstoffbeladung Strategie zu verwenden. Fluo5N-AM hat eine geringe Affinität für Ca ^{2 +} (Dissoziationskonstante K _D ~ 90 pM, Abbildung 2), ist fast nicht fluoreszierenden in seine AM-Form, sondern bietet eine hohe Fluoreszenzemission auf Calcium Bindung ^8,34. Die Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplex} mit einer Standard-Lichtquelle von ~ 490 nm, die über die normalen Farbstoffen wie FITC, Alexa 488 oder eGFP entspricht angeregt werden. Cytosolic Calcium-Signale kaum erreichen eine Konzentration in den niedrigen pM-Bereich und werden daher kaum von Fluo5N im Cytosol ³⁵ erkannt.

Um die TED Leistung zu verbessern, wurden mehrere rekombinanten Vektor-Konstrukte entwickelt (Abbildung 3). Ursprünglich ist TED Vektoren auf der kodierenden Sequenz des CES2 (Refseq Zugangsnummer NM_145603, CES2c) und am besten TED Leistung bezogen mit stabilen Expression CES Konstrukte beobachtet. New TED Vektoren exprimieren ein Kernelement CES2 fusioniert mit dem roten fluoreszierenden Proteins TagRFP-T2 ^36. Diese Vektoren haben den Vorteil, dass sie verwendet werden, um zu identifizieren transduzierten Zellen und die rote Fluoreszenz als interne Kontrolle für die Normalisierung der Veränderungen in Fluo5N/Ca ² verwenden werden ⁺ Fluoreszenz. Die rote Fluoreszenz bietet auch die Möglichkeit, die strukturellen Verteilung der ER und ER Änderungen in Dynamik unter Stimulationsbedingungen visualisieren.

Protokoll

Dieses Protokoll stellt TED angewendet, um Zelllinien, Neuronen im Hippocampus und kortikalen Gliazellen. TED Leistung ist am besten, wenn TED Vektoren sind stabil exprimiert, zum Beispiel durch lentivirale Vektoren. Ein schematischer Überblick über die TED Verfahren ist in Abbildung 4 dargestellt.

1. Herstellung von Lösungen

Die folgenden Lösungen werden vor Beginn hergestellt und gelagert werden können, wie angegeben. Wir verwenden in der Regel sterilisiert Glas und Kunststoff und autoklaviert Wasser.

1. Bereiten HEPES-Ringer (in mm): 125 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 2 CaCl _2, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O.. Calcium-freien HEPES-Ringer besteht aus (in mM): 127 NaCl, 3 KCl, 25 HEPES, 2 MgSO ₄ .7 H ₂ O, 1,25 NaH ₂ PO ₄ H ₂ O, 10 glucose.H ₂ O und 0,1 EGTA.. Ohne Glukose diese Imaging-Lösungen können bE bei 4 ° C. Die erforderliche Menge an D-Glucose vor Gebrauch frisch zugesetzt.
2. Für TED Analyse in Neuronen im Hippocampus, wird künstliche Liquor (ACSF) empfohlen. ACSF aus (in mM) aus: 127 NaCl, 23 NaHCO _{3, 3} KCl, 2,5 NaHPO ₄ H ₂ O, 25 D-glucose.H ₂ O, 2 CaCl _{2, 2} MgCl ₂ 0,7 H ₂ 0 in ddH. ₂ 0.
3. Bereiten Fluo5N-Uhr zu einer Konzentration von 5 mM. Um Solubilisierung hinzuzufügen 8,9 ul 20% Pluronic F-127 (in DMSO bei Raumtemperatur gelagert, geschützt vor Feuchtigkeit und Licht) bis 50 ug lyophilisierten Fluo5N-AM. Dann lösen Fluo5N-AM mittels eines Wasser-Ultraschallbad für mindestens 2 min. Shop Aliquots à 0,5 ul bei -20 ° C, vor Licht und Feuchtigkeit geschützt.
4. Bereiten Antagonisten und Agonisten Bestände nach Bedarf. Zum Beispiel: a) 10 mM ATP oder ADP (in H ₂ O, metabotropic Aktivierung von Adenosin-Rezeptoren), b) 10 mM Carbachol in H ₂ O (Agonistvon muskarinischen Acetylcholin-Rezeptor), c) 30 mM Cyclopiazonsäure (CPA) in DMSO (Blocker des SERCA), d) 50 mM DHPG in PBS (metabotropen Glutamat-Rezeptor-Agonisten für mGluR _I mGluR und _5), e) 10 mM in H Glutamate ₂ O, f) 1 mM Ionomycin in DMSO (Ionophor), g) 5 mM thapsigargin in DMSO (hochaffine Blocker des SERCA). Shop Aliquots bei -20 ° C.
5. Lentivirale Vektoren: Dieses Protokoll schließt die Verwendung von lentiviralen TED Expressionsvektor Teilchen. Ihre Herstellung und Lagerung ist nicht Bestandteil dieses Protokolls. Wir verwenden lentiviralen Vektoren der zweiten Generation für die Übertragung von rekombinanten Carboxylesterasen Zelllinien, Gliazellen und Neuronen. Unsere lentiviralen System basiert auf dem Expressionsvektor FUGW ^37, und die Verpackung Plasmide pCMVΔR8.91 oder psPAX2 und Pseudotypisierung Plasmid pMD2.G ^38,39. ACHTUNG: Bedenken Sie, dass die Arbeit mit rekombinanten selbst inaktivierenden lentiviralen Vektoren erfordert die sorgfältigeBerücksichtigung der Biosicherheit Richtlinien. In vielen Ländern sind diese Vektoren als Biohazard Risikogruppe 2 eingestuft. Weitere Informationen finden Sie in http://www.addgene.org/lentiviral/ .

2. Vorbereitung und Viral Infection of Mouse Hippocampusneuronen

1. Waschen Deckgläschen in einem Glas Petrischale von 20 cm Durchmesser (100 Deckgläser pro Schale) 1x in 70% Ethanol für ca. 30 min. Schließlich, fügen Sie 100% Ethanol (pa) für 2 min. Rückstände von Ethanol und trocknen Sie die Deckgläser unter einer sterilen Haube.
2. Bereiten Sie zwei verschiedene Arten von Medien für Hippocampus Kulturen: (a) Neurobasalmedium mit B27 1.50 (b) volle Medium: Neurobasalmedium mit B27 1:50 Glutamax 1:100, 1:100 und N2 Ergänzung. Sterile Filtrat der Medien und speichern sie in der Zelle Inkubator bis zur Verwendung.
3. Einen Tag vor der Präparation werden die Deckgläser, indem zunächst eine sterile 10 mm Deckglas in jeder hergestelltenund einer 4-Well-Zellkulturschale. Danach speichern sorgfältig Mantel jedes Deckglas mit 80-100 ul 0,1% Poly-L-Lysin und die Gerichte in einem Inkubator über Nacht.
4. Am Tag der Präparation und Zellkultur, mit dem Waschen der Deckgläschen dreimal mit 100 ul HBSS beginnen und dann 100 ul Neurobasalmedium jedem Deckglas. Die Schalen werden in einem Inkubator für Gleichgewicht (z. B. bei der Präparation von Mäusen).

Dissection

Wir führen unsere Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit Richtlinien der Europäischen Union, von unseren institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.

5. Entfernen Sie das gesamte Gehirn und sezieren die hippocampi bilateral.
6. Entfernen Sie vorsichtig alle Hirnhaut und anderem Gewebe als der Hippocampus und Ort einer Hippocampus jeweils in ein 1,5 ml Röhrchen mit 450 ul HBSS. Bewahren Sie das Gewebe auf Eis, bis eine ausreichende Anzahl von hippocampi isoliert worden ist.

Zellkultur

7. In 50 ul 1% Trypsin (Worthington) zu jedem Röhrchen und Inkubation sie in einem 37 ° C Wasserbad für 15 min. Schütteln Sie die Rohre gelegentlich. Um die Verdauung Reaktion zu stoppen, fügen Sie 50 ul 1% Trypsin-Inhibitor in jedes Röhrchen und das Röhrchen mehrmals.
8. Übertragen Sie alle Gewebe von bis zu 5 hippocampi einem 15 ml Falcon-Röhrchen Vermeidung der Übertragung von Flüssigkeit. In B27-Medium (a) bis zu einem Endvolumen von 5 ml.
9. Man reibt das Gewebe mit einem Feuer polierten Pasteur Glaspipette durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. VORSICHT: Vermeiden Sie Luftblasen!
10. Spin mit 400 xg für 3 min, absaugen Überstand und Zellpellet in 5 ml B27-Medium (a).
11. Man reibt das Gewebe wieder mit der Glaspipette, und dann zweimal mit Hilfe eines 1.000 ul Kunststoff-Filter Spitze. Führen Sie diese wie in den Schritten 2.9 und 2.10 beschrieben.
12. Nach der letzten Zentrifugation Zellpellet in 2 ml volle medium (b) und verreiben Zellen mit einer 200 ul Kunststoff-Filter Spitze. Um restlichen Zellklumpen aus dem Single-Zell-Suspension zu trennen, lassen Zellklumpen niederlassen für 1-2 min.
13. Zählen von Zellen und die Berechnung der Gesamtzahl von Zellen, die für die virale Infektion benötigt. Für TED Bildgebung nutzen 25.000 Zellen pro 10 mm Deckglas.
14. Überzug zusätzlich 25.000 nicht-transduzierten Zellen als Kontrolle wird an dieser Stelle empfohlen.

Viral Infection

15. Übertragen Sie die Zellsuspension für die virale Infektion in ein frisches 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge für 3 min bei 400 x g.
16. Saugen Sie den Überstand und die Zellen in 300 ul Medium (b)
17. In eine entsprechende Menge an infektiösen lentiviralen Expressionsvektor TED Teilchen und lassen Sie die Falcon-Röhrchen bei Raumtemperatur stehen für 10 min.
18. Füllen Sie das Rohr mit Vollmedium (b) auf das Endvolumen für die Beschichtung (100 ul für jede 10 mm Deckglas) brauchte, Saugen Sie das Medium aus dem coverslip und sofort legen 100 ul Zellsuspension auf jedes Deckglas.
19. Die Schalen werden in den Brutschrank, bis alle Zellen nach unten (ca. 2 Std.) niedergelassen haben und sorgfältig füllen die Gerichte, bis sie 2 ml Medium (b) enthalten.
20. Lassen Neuronen für mindestens eine Woche wachsen. Ersetzen Sie 50% des Mediums jede Woche.

3. Kultur und Viral-Infektion der Maus kortikale Gliazellen

Vorbereitung

1. Beginnen Herstellung basalen Glia Medium (1:1-Gemisch aus DMEM/F12 mit 10% FCS, 5% HS, 1% Penicillin / Streptomycin, 0,45% Glucose) und Beschichten eines T75 Zellkulturflasche mit 4 ml 0,5 ng / ml Poly -DL-Ornithin Hydrobromid (PORN) (verdünnt in 150 mM Borsäure, pH 8,35). Nach Inkubation bei 37 ° C für 2 Stunden oder über Nacht, waschen Zellkulturkolben dreimal mit HBSS und fügen Sie 18 ml basalen Glia-Medium mit B27 01.50 und 10 ng / ml EGF. Equilibrieren die Zellkulturflasche im Brutschrank (bis zu 3 Std.).

Dissection

1. Wir führen unsere Experimente mit Mäusen in Übereinstimmung mit Richtlinien der Europäischen Union, von unseren institutionellen Tierpflege und Nutzung Ausschuss genehmigt.
2. Präparieren Sie das Gehirn einer P5-P7 Maus und entfernen Sie den Hippocampus und Hirnhäute aus beiden Hemisphären wie in 2.5 beschrieben.
3. Präparieren Sie die frontalen Kortex, schneiden Sie sie in mehrere kleine Stücke und sammeln sie in einem 1,5 ml Röhrchen mit HBSS. Bewahren Sie die Röhrchen auf Eis und gehen zum Teil Zellkultur.

Zellkultur

4. Übertragen Sie alle Gewebe aus dem Rohr in ein 15 ml Falcon-Röhrchen mit einem Feuer polierte Glaspipette.
5. In Basalmediums auf ein Gesamtvolumen von 5 ml und verreiben das Gewebe durch Pipettieren mehrmals nach oben und unten mit einer feuerpolierten Glaspipette. Nach Zentrifugation bei 300 xg für 3 min, saugen Sie den mittleren und Zellpellet in 5 ml Basismedium.
6. Wiederholen Sie Schritt 3,5 zweimal.
7. Nach der third Zentrifugation Zellpellet in 2 ml Medium mit basalen Glia B27 (1:50) und 10 ng / ml EGF.
8. Titruate erneut und übertragen Sie die Zellsuspension auf die vorbereitete T75 Zellkulturflasche und lassen Zellen wachsen für 3-4 Tage.

Waschen von Gliazellen (nach 3-4 Tagen in Kultur):

9. Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 ml PBS und energisch tippen oder leicht schlagen den Kolben ein paar Mal mit der Hand, und halten Sie ihn fest, in der anderen Hand. Durch diesen Schritt Zelltrümmer und Zellhaufen aus der Kultur entfernt.
10. Saugen Sie die PBS und fügen Sie frisches basalen Glia-Medium mit B27 (1:50) und 10 ng / ml EGF. Weitere pflegen die Kultur für 5-7 Tage, bis die Zellen 80% Konfluenz erreichen.

Splitting, Transduktion und letzte Aussaat von Gliazellen:

11. Coat 10 mm Deckgläschen mit 100 ul Poly-D-Lysin (Stammlösung: 0,1%, verdünnt 1/50 ad 20 ug / ml in PBS oder HBSS) und Inkubationsie in einem Inkubator über Nacht. Waschen Deckgläschen dreimal mit HBSS und 100 ul basalen Glia Medium. Equilibrieren Deckgläser in den Inkubator (3 h).
12. Waschen Sie die Gliazellen zweimal mit 10 ml PBS absaugen PBS und 3 ml Trypsin (TrypLE, unverwässert). Trypsinize Zellen für bis zu 1 min. VORSICHT: Vermeiden Sie zu Trypsinierung. Regel mehr als 80% der Zellen nach 1 min gelöst und das ausreichend ist, um mehrere Millionen von gesunden Zellen haben.
13. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 10 ml basalen Glia Medium, übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml Falcon-Röhrchen, bei 300 g zentrifugiert für 3 min. Saugen Sie den Überstand und Zellpellet in 5 ml Medium basalen Glia.
14. Wieder drehen und saugen Sie wie in Schritt 3.15 beschrieben, dann Zellen in 5 ml Medium basalen Glia.
15. Übertragen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen in ein 1,5-ml-Tube. 10 ^{4-2x10 4} Gliazellen sind ausreichend für ein 10 mm Deckglas. Normalerweise wird die Suspension volume, um Zellen für eine 4-Well-Schale ist weniger als 200 ul Transduktion. Dazu wird eine geeignete Menge des lentiviralen TED Expressionsvektor Partikel in die Zellen und inkubieren bei RT für 10 min. Dann füllen Sie das Fahrwerk mit basalen Glia Medium zur Aussaat Volumen (100 ul pro Deckglas).
16. Seed 100 ul von infizierten Zellen pro Deckglas und Inkubation für etwa 2 Stunden, dann fügen basalen Glia-Medium mit B27 01.50 und 10 ng / ml EGF zu einem endgültigen Volumen von 2 ml.
17. Für optimale Kulturbedingungen verwenden Zellen für Experimente an Tag 3-7 nach der Beschichtung.

4. Generierung und Kultur von Reporter-Zelllinie

TED Reporter-Zelllinien wurden auf der Grundlage von HeLa-, BHK21-, HEK293-und SH-SY5Y etabliert. Hier bieten wir Ihnen das Protokoll für HeLa-Zellen, aber das Protokoll kann an jeden anderen Zelllinie übertragen als gut.

Erzeugung stabiler HeLa-Zelllinie

1. Aufteilen einer Wildtyp HeLa-Zelllinie und Transfer 100.000 cEllen in einem Volumen von 200 ul einer 1,5-ml-Tube.
2. Dazu wird eine geeignete Menge des lentiviralen TED Expressionsvektor Teilchen auf das Rohr und die Platte die Zell-Virus-Suspension für 10 min bei RT. Dann Saatgut der Zellen in einem Gesamtvolumen von 2 ml Medium (DMEM, 10% FCS, 1% Penicillin / Streptomycin) in einer 30 mm Schale und Inkubation für 3 Tage.
3. Nach einmaligem Waschen mit PBS, Medium absaugen und fügen Sie 500 ul Trypsin (TrypLE, 2:3 in PBS). Inkubation für ca.. 3 min und dann stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 ml Medium. Übertragen Sie die Suspension in einem 15 ml Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 400 xg für 3 min.
4. Zellpellet in 200 ul Medium wieder infizieren die Zellen mit lentiviralen Partikel wie in 4.2 beschrieben. Dann Samenzellen in einer T25 Zellkulturflasche in 10 ml Medium.
5. Wachsen Zellen bis zu einer Konfluenz von 60-80% erreicht ist. Dann teilen Sie die Kultur.

TED Reporter-Zelllinien

6. TED Reporter-Zelllinien werden beibehaltened in jedem Standard-Medium, zB DMEM, 5% oder 10% FCS und 1% Penicillin / Streptomycin verwendet wird.
7. Platte eine entsprechende Anzahl von Zellen in einer 4-Well-Platte mit steriler 10 mm-Deckgläschen (siehe oben), z. B. 10000 bis 20000 Zellen pro Deckglas.
8. Wachsen Zellen für mindestens zwei Tage vor ihrer Verwendung für TED Bildgebung.

5. Vorbereitung für die Live-Imaging Verfahren bei einem inversen Mikroskop

1. 1. Vorwärmen HEPES-Ringer auf Raumtemperatur und fügen D-Glucose.
   2. Regulieren Sie den ACSF (ohne Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +)} auf Raumtemperatur und fügen D-Glucose. Lüften Sie den ACSF mit Carbogen für 5 Minuten. Dann fügen Sie 1 M Stammlösungen von CaCl ₂ und MgCl _2, um Endkonzentrationen von je 2 mm.
2. Starten Sie die Live-Aufnahmen Mikroskope und alle Computerprogramme.
3. Starten Perfusion auf einem "Dummy"-Bildgebung Kammer und Gleichgewicht des Rohrsystems.
4. Regulieren Sie den Inline-Lösung Heizung und die Imaging-Kammer im Mikroskop Bühne. Befestigen Sie den Imaging-Kammer in einem Heizeinsatz.
5. Equilibrieren das System auf 32-37 ° C, bevor Sie den Ladevorgang starten Farbstoff. VORSICHT: Um ein versehentliches Fluss der Perfusion Lösung in die Mikroskop-System verwenden wir Haargummis um die Ziele und Elastomer-Silikon-Blatt (1mm), um die Mikroskoptisches schützen zu vermeiden.

6. Dye Loading entweder Zelltyp

1. Resuspendieren 1 Aliquot Fluo5N-AM (siehe 1.3) in 100 ul vorgewärmte Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF).
2. Löslich Fluo5N-Uhr in der Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF) in einem Wasser-Ultraschallbad für 90 sec.
3. Verwenden Sie eine frische 4 - oder 24-Well-Platte und Transfer 400 ul vorgewärmte Imaging-Lösung zu einem gut. Fügen Sie die Farbstoff-Lösung auf die gleiche auch auf 500 ul einer 5 uM Lösung zu kommen.
4. Vorsichtig ein Deckglas mit Zellen (z. B.10-18 mm im Durchmesser) in den Brunnen, Zellen nach oben.
5. Inkubieren für einen angemessenen Zeitraum in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 ° C (mittlerweile vorzubereiten Bildgebung Einstellungen am Mikroskop Stufe). Typische Farbstoff-Ladezeiten sind für Neuronen und Gliazellen 7-15 min und für Zelllinien 10-20 min.

Entscheidend: Dye-Ladezeiten und Farbstoffkonzentration nach Zelltyp, Zelldichte und Experiment-Bedürfnisse ab! Lange Inkubationszeit in Anwesenheit des Farbstoffs kann schädlich für die Zellen, insbesondere primäre Neuronen und Gliazellen primäre und das ist entscheidend für die physiologische Reaktion auf Reize. Lange Inkubationszeiten (z. B. 30 min) wird nur für ER Calcium Lokalisierung Experimente nützlich, um die Verteilung von ER Calcium in kleinen subzellulären Strukturen, z. B. feine Neuriten oder Stacheln zu untersuchen. In einigen Experimenten kann ein Gemisch aus 1/3 Wachstumsmedium mit bildgebenden Lösung helfen Zellen während Fluo5N-AM schützenLaden.

6. Augenblicklich übertragen das Deckglas in eine andere Zelle Kultur gut mit Imaging-Lösung (HEPES-Ringer oder ACSF) und starten Sie die Montage der Zellen in der bildgebenden Kammer.

7. ER-Calcium Live Cell Imaging mit einem Inverted Laser konfokalen

1. Verwenden Sie einen Pinsel zu Hochvakuumfett einem bildgebenden Kammer beantragen. Das Fett wird benötigt, um das Deckglas auf dem Boden der Perfusionskammer fixieren. Wir verwenden selbstgemachte Bildgebung Kammern für 10-12 mm Deckgläser mit einem kleinen Volumen, wodurch hohe Perfusion Geschwindigkeiten von bis zu 15-fach Puffer Austausch pro Minute. Ein kommerziell erhältliches Perfusionskammer für 18 mm Deckgläser, können von Warner Instrumente (RC-49FS) erworben werden. Diese Kammer kann auch Feld-Stimulation der Nervenzellen.
2. Pick-up das Deckglas mit den Fluo5N-beladenen Zellen und fügen Sie einen kleinen Tropfen Imaging-Lösung (50-100 ul) auf die Zellen, Zellen mit Imaging-Lösung bedeckt zu halten.Schalten Sie das Deckglas auf den Kopf und montieren Sie die Zellen in der Bildgebung Kammer. Um das Deckglas in das Silizium-Kleber drücken, verwenden Sie ein Wattestäbchen (zB Q-Tips).
3. Wischen Sie verbleibende Puffer aus dem Boden des Deckglas mit Wattestäbchen. ACHTUNG: Vorsichtig abwischen Restfeuchte bei Verwendung eines Öl-Objektiv mit hoher numerischer Apertur für hochauflösende Bildgebung. Restliches Salz wird am besten durch Wasser entfernt. Unbeabsichtigter Abstrich von Fett kann mit Aceton oder reinem Ethanol entfernt werden.
4. Tauschen Sie den "Dummy"-Bildgebung Kammer mit dem experimentellen Bildgebung Kammer. Waschen Sie die Zellen für 5-10 min durch kontinuierliche Perfusion.
5. Waschen der Zellen für 5 - 10 min durch kontinuierliche Perfusion.
6. Für Zellauswahl verwenden eine minimale Menge an Laserbeleuchtung, hohe Abtastraten (2-4 Hz), ein kleines Bild Größe und eine hohe Verstärkung.
7. ACHTUNG: Bei der Auswahl der Fluo5N-markierten Zellen nicht verwenden Überschuss von Licht oder direkte Beleuchtung mit epifluorescent Licht. Helle Beleuchtung der Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe} bewirkt, dass der komplette Verlust der ER-spezifische Fluoreszenz innerhalb von 2-4 Sekunden (Abbildung 5).
8. Richten Sie das Mikroskop nach dem geplanten Experiment. Zur Orientierung sind repräsentativer für die Abbildung mit verschiedenen TED Vektoren in Tabelle 1 angegeben. Für invertierten konfokalen Laser-Scanning-Mikroskopie, verwenden wir ein Olympus IX81 Mikroskop mit einer FluoView 1000 konfokale System, das mit Diodenlaser (473 nm, 15 mW; 559 nm, 20 mW) ausgestattet ist, kombiniert und einer spektralen Detektor-System.
9. Zu Beginn des Experiments dokumentieren die Zellen von Interesse durch hochauflösende x, yz Bildstapeln.
10. Führen x, yt Bildgebung ER Calcium Dynamik unter den spezifischen experimentellen Bedingungen zu überwachen. Typische Einstellungen für unser System sind in Tabelle 2 aufgeführt.
11. Überwachen Sie Änderungen in ER Calcium unter kontinuierlicher Perfusion mit Imaging-Lösung. Typische Puffer Wechselkurse sind exemplarily: (a) Waschen der Zellen und store-Depletion durch SERCA Block: 1,5 ml / min, (b) ATP / DHPG Stimulation: 3 ml / min.
12. Erwerben Sie digitale Bilder bevorzugt mit 12-Bit (4096 Graustufen). Für parallele Bildgebung Fluo5N/Ca ^{2 +} und RFP, 8-Bit-Bilder (256 Grauwerte) können Sie Ihr System von Datenüberlauf retten.
13. Lagern leben Zelle Zeitreihe Bilder (x, yt) oder 3D-Bild Stapel (x, yz) (für die zelluläre Verteilung von Fluo5N/Ca ^{2 +-Komplexe)} in einem kompatiblen Format ImageJ (zB tiff).

8. Bildverarbeitung und Datenanalyse

1. Öffnen Sie das Bild Stapel in der ImageJ Programm. Bei mehrfarbigen Bildgebung, teilen Sie die RGB-Kanäle, wenn sie von ImageJ gefragt.
2. Identifizieren Sie Ihre Region (en) von Interesse (ROI) durch eine sorgfältige Prüfung der Bildstapeln (z. B. mit Hilfe einer Intensität gegen Zeit-Diagramm)
3. Nutzen Sie die Zeit-Series Analyzer Plugin zum Auslesen der durchschnittlichen Pixel-Intensität in einer ROI (F _roh). Depending auf Zweck ziehen ROIs um entweder die komplette ER oder kleine Regionen des ER ER zB von Dendriten der peripheren Zelle Regionen. Auch gehören 1-3 ROI in Gebieten ohne Zellen für Hintergrundsubtraktion.
4. Berechnen Sie die durchschnittliche Hintergrundfluoreszenz (F _b) durch Berechnung der mittleren Fluoreszenz des Hintergrundes ROI und subtrahieren den Hintergrund Wert F _b aus den F _Rohwerte, die F _roi Wert zu erhalten.
5. Berechnen F _0, welche die basale Fluoreszenz der Zellen ist, durch Berechnen des Mittelwerts von zehn bis 30 Fluoreszenzwerte für jeden ROI in einem Ruhezustand.
6. Berechnen Sie die Hintergrund-korrigierten relativen Veränderungen in der Fluoreszenz durch AF / F ₀ durch die Formel:

7. Anwesend relativen Veränderungen in fluoreszierenNCE als Spur mit AF / F ₀ für den Y-Achse und die Zeit für die X-Achse.

Ergebnisse

Dieses Protokoll stellt eine unterbrechungsfreie Ansatz für die direkte Bildgebung der freien ER Calcium. Low-Affinität synthetischen Ca ^{2 +} Indikatoren gelöst und eingeschlossen in das ER-Lumen mit Hilfe eines ER gezielt rekombinanten Esterase Enzymaktivität. Verbesserte Belastung der Ca ^{2 +-Indikator} Farbstoffe zum ER-Lumen ermöglicht eine direkte und schnelle Darstellung von ER Kalzium-Speicher der Dynamik.

Zelltypen für TED

Die Durchführbar...

Diskussion

Die Vor-und Nachteile des TED Verfahren wurden ausgiebig in den letzten Publikationen ^34,35 diskutiert. Im Vergleich zu anderen oben beschriebenen Verfahren umgeht das Problem der TED zu stören und Perfusion der Zellen. Darüber hinaus müssen zwei Aspekte hervorgehoben werden. Das Prinzip der TED für ER Calcium Imaging erfordert (1.) Die gezielte Expression eines aktiven Carboxylesterase in das ER-Lumen mit Hilfe von TED Vektor-Konstrukte und (2.) Die effiziente und bevorzugte Freisetzung von niedriger Affinit...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
(S)-3,5-DHPG (Dihydroxyphenylglycin)	Tocris	0805
5';-ATP-Na2, ATP Dinatriumsalzhydrat	Sigma	A26209-1G
B-27 Ergänzung,50x	Invitrogen	17504-044
Carbamoylcholinchlorid (Charbachol)	Sigma	C4382-1g
Cyclopiazonsäure (CPA)	Aufstieg wissenschaftlich	Asc-300
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Sigma	D2650
DMEM mit Glutamax	Invitrogen-Gibco	31966-047
Dulbecco's PBS ohne Ca/Mg 1x	PAA	H15-002
Fötales Kälberserum	Invitrogen-Gibco	10270-106
Fluo-5N-AM, 10 x 50 μ g	Invitrogen	F14204
Glutamate	Ascent scientific	Asc-049
Glutamax	Invitrogen	35050-038
Ham's F12 Nährstoffmischung	Invitrogen-Gibco	21765-029
Hank's BSS(1x) ohne Ca, ohne Mg, mit Phenolrot, HBSS	PAA Laboratories	H15-010
Pferdeserum	SHD3250YK	Linearis
Ionomycin Ca2+ Salz	Ascent scientific	Asc-116
murine EGF	PreproTech	315-09
N2 Supplement 100x	Invitrogen	17502-048
Neurobasales Medium	Invitrogen-Gibco	21103-049
Pluronic F127, geringe UV-Absorption, 2g	Invitrogen	P6867
Poly-DL-Ornithinhydrobromid PORN	Sigma	P8638
Poly-D-Lysinhydrobromid	Sigma	P7280
Poly-L-Lysin	Sigma	P2636
Thapsigargin	Calbiochem	586005-1mg
TryLE Express	Invitrogen	12605-028
Trypsin	Worthington	LS-003707
Trypsininhibitor aus Glycin MAX (Sojabohne)	Sigma	T6522<
Konfokales System: inverses Laser-Scanning-Mikroskop: FV1000 mit IX81	Olympus		anwenderspezifische Konfiguration
Konfokales System: Laserkombinierer FV10 und Diodenlaser (405, 473, 559, 635)	Olympus		benutzerspezifische Konfiguration
Konfokales System: Scankopf FV10-SPD mit Spektraldetektor	Olympus		benutzerspezifische Konfiguration
Heizregler TC-344B	Warner Instruments	64-0101	zur Steuerung der In-Line-Lösungsheizung
NIH ImageJ Software	WS Rasband, ImageJ, US National Institutes of Health, http://rsb.info.nih.gov/ij/, 1997--2006
Ziel: UAPON20XW340 NA 0,7 WD 0,35	Olympus	N2709100
Ziel: UPLFLN40XO	Olympus	N1478700
Ziel: UPLSAPO60XO/1.35, WD=0.15	Olympus	N1480700
Perfusionskammer, inverse	Perfusionskammer
, RC-49FS	Warner Instruments	W4 64-1709
Perfusionssonde: PT-49	Warner Instruments	64-1730	für Perfusion
Schlauchpumpe MiniPlus 3 (4 Kanäle)	Gilson	n.a.Perfusionspumpe
Einzel-Inline-Lösungserhitzer SH-27B	Warner Instruments	64-0102	gesteuert über Heizungsregler
Saugrohre: ST3R	Warner Instruments	64-1407	für Perfusion
Heizeinsatz: Tempocontrol 37-2 digital 2-Kanal	Pecon	n.a.