Beurteilung Neurodegenerative Phänotypen in<em&gt; Drosophila</em&gt; Dopaminergen Neuronen durch Klettern Assays und Whole Brain Immunostaining

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir zwei Tests, die getroffen wurden, um altersabhängige Neurodegeneration dopaminerger (DA) in Neuronen zu studieren Drosophila: Das Klettern / startle-induzierten negativen Geotaxis Assay, um die funktionalen Auswirkungen der DA Neurone Degeneration und der Tyrosinhydroxylase Immunfärbung, die zur Identifizierung und zählen DA Neuronen im gesamten Gehirns Halterungen wird studieren können.

Zusammenfassung

Drosophila melanogaster ist ein wertvoller Modellorganismus zur Alterung und pathologischen degenerativen Prozessen im Nervensystem zu studieren. Die Vorteile der Fliege als experimentelles System sind seine genetischen Lenkbarkeit, kurze Lebensdauer und die Möglichkeit zu beobachten und quantitativ zu analysieren komplexe Verhaltensweisen. Die Ausprägung der Krankheitsresistenz-chromosomale Gene in spezifische neuronale Populationen der Drosophila Gehirn, können verwendet werden, um neurodegenerative Erkrankungen wie der Parkinson-und ^Alzheimer-5 zu modellieren.

Dopaminergen (DA) Neurone gehören zu den am stärksten gefährdeten neuronale Populationen in der alternden menschlichen Gehirns. Bei der Parkinson-Krankheit (PD), die häufigste neurodegenerative Bewegungsstörung, führt der beschleunigte Verlust von DA Neuronen zu einer fortschreitenden und irreversiblen Rückgang der Funktion der Bewegungsorgane. Neben Alter und der Belastung durch Umweltgifte, ist der Verlust der DA Neuronen durch spezifische Mutationen in der kodierenden verschärftoder Promotor-Regionen von mehreren Genen. Die Identifizierung solcher PD-assoziierten Allele liefert die experimentelle Grundlage für die Verwendung von Drosophila als Modell zur Neurodegeneration DA Neuronen in vivo zu studieren. Zum Beispiel, der Ausdruck der PD-verknüpft menschlichen α-Synuclein-Gen in Drosophila DA Neuronen rekapituliert einige Merkmale der menschlichen Erkrankung, z. B. progressive Verlust von DA Neuronen und sinkende Bewegungsapparates Funktion ^2. Dementsprechend ist dieses Modell erfolgreich eingesetzt, um potentielle therapeutische Targets in PD ⁸ zu identifizieren.

Hier beschreiben wir zwei Assays, die üblicherweise verwendet wurden, um altersabhängige Neurodegeneration DA Neuronen in Drosophila untersuchen: a Klettern Assay basiert auf der startle induzierten negativen Geotaxis Reaktion und Tyrosin Hydroxylase Immunfärbung der gesamten erwachsenen Gehirn montiert, um die Anzahl von Neuronen überwacht DA in verschiedenen Altersstufen. In beiden Fällen, in vivo-Expression von UAS transgenes speziell in DA Neuronen durch einen Tyrosin-Hydroxylase (TH)-Promotor-Gal4 Treiberleitung ^{3, 10} erreicht werden.

Einleitung

Die Besonderheit des hier beschriebenen Assays beruht auf der Verwendung eines Gal4 Fliege Linie, die die regulatorischen Sequenzen der Tyrosin-Hydroxylase-Gen Expression in dopaminergen Neuronen ³ erreichen ausnutzt. Tyrosinhydroxylase katalysiert den ersten und geschwindigkeitsbestimmenden Schritt in Dopamin-Synthese. TH-Immunreaktivität in der erwachsenen Fliege Gehirn Überschneidungen mit der Dopamin, was TH ein guter Kandidat, um DA Neuronen in vivo (siehe zum Beispiel ⁶⁾ zu identifizieren. Darüber hinaus ist die Expression von THGal4 präziser als andere Gal4 Linien wie DdcGal4, die regulatorischen Sequenzen enthält der Dopa-Decarb....

Protokoll

1. Startle-induzierte Negative Geotaxis Assay

1. Wählen Fliegen des gewünschten Genotyps, trennen sie nach Geschlecht, nach dem Zufallsprinzip Gruppe sie in Kohorten von 20-30 Tieren und kippen sie in neue Nahrung Fläschchen alle 2-3 Tage; Test jeder Satz von Fliegen (dh Alter abgestimmte Kohorten, eine Kohorte / Genotyp) mindestens einmal pro Woche.
2. Dreißig Minuten vor der negativen Geotaxis Test, betäuben die Fliegen mit CO ₂ und legen Sie sie in pre-markierten klar Kunststoffrohre mit zwei leeren Flaschen Nahrung (siehe Materialien Table), die an ihren Öffnungen mit durchsichtigem Klebeband (Kammer Maße: 19 cm....

Ergebnisse

Wir haben die verwendeten Assays beschrieben hier die Rolle der Beanspruchung schützende Nrf2-Signalweg in Drosophila Modell der PD ¹⁴ zu studieren. Dieses Modell beruht auf der Expression des humanen α-Synuclein-Gen in DA Neuronen mit einem TH Gal4 Treiber ^{2, 10.}

Abbildung 1 zeigt ein repräsentatives Ergebnis einer Schreckreaktion-induzierten negativen Geotaxis (Klettern)-Assay in männlichen Fliegen, die verschiedene Transgene unter der Kontro.......

Diskussion

Die hier beschriebenen Assays stellen einen nützlichen Ansatz, um die Rolle von spezifischen Genen zu untersuchen, Signalwege oder kleinen Verbindungen bei der Aufrechterhaltung der DA Neuronen in Alterung sowie bei verschiedenen Krankheiten verbunden genetischen Hintergründen (Übersicht in ^5).

Die startle induzierten negativen Geotaxis Verhalten von Drosophila wurde ausgiebig als funktionelle Auslesen für die Funktionalität des DA Neuronen in unterschiedlichen genetische.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody	Millipore	AB152
Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody	Jackson ImmunoResearch	711-026-152
Mowiol	Calbiochem	475904
DABCO	Sigma	D2522
Ausrüstung
Polystyrol-Fläschchen	VWR	89092-734	28,5 x 95 mm
Digitalkamera	Canon	PowerShot A3100IS (Modell)	12,1 Megapixel 4X Optischer Zoom
Glaskuvetten Nr. 1,5	VWR	48366 205 48393 252	Größen: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm
Glaskuvetten Nr. 2	VWR	48368-040	Größe: 18 x 18 mm
Dissektionsschalen	Electron Microscopy Sciences	70543-01	Größe: 30 mm O.D.
Dumostar Nr. 5 Pinzetten	Electron Microscopy Sciences	72705-01
Stereomikroskop	Carl Zeiss	Stemi 2000 (Modell)
Konfokalmikroskop	Leica	SP2 oder SP5 (Modell)
Materialtabelle.