Kultivierung primären Ratten Inner Medulläre Sammelkanal Cells

Zusammenfassung

Arginin-Vasopressin (AVP) steuert Feinabstimmung der Körper Wasser Homöostase durch die Erleichterung Wasserreabsorption durch renale Hauptzellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kultivierung von primären Ratten inneren medullären Sammelkanal Zellen geeignet für die Aufklärung der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen AVP-vermittelten Wasserreabsorption.

Zusammenfassung

Arginin-Vasopressin (AVP) erleichtert Wasserreabsorption durch renale Sammelkanal Hauptzellen und damit eine Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase. AVP bindet Vasopressin V2-Rezeptoren (V2R) auf der Oberfläche der Zellen und induziert dadurch Synthese von cAMP. Dies stimuliert die zelluläre Signalgebung Prozesse, die zu Veränderungen in der Phosphorylierung des Wassers Aquaporin-2 (AQP2). Protein Kinase A phoshorylates AQP2 und löst dadurch die Translokation von intrazellulären Vesikeln AQP2 in die Plasmamembran zu erleichtern Reabsorption von Wasser aus primären Urin. Aberrationen der AVP-Freisetzung aus der Hypophyse oder AVP-aktivierten Signalisierung in Hauptzellen kann zentral oder Diabetes insipidus sind; eine erhöhte Blutplasma AVP Ebene ist mit Herz-Kreislauf-Erkrankungen wie chronischer Herzinsuffizienz und das Syndrom der inadäquaten ADH-Sekretion verbunden.

Hier präsentieren wir ein Protokoll für cultivatiauf der primären Ratten inneren medullären Sammelkanal (IMCD-Zellen), die ausdrückliche V2R und AQP2 endogen. Die Zellen eignen sich zur Erläuterung molekularen Mechanismen, die der Steuerung der AQP2 und damit Entwicklung neuer Medikamente zur Behandlung von Erkrankungen mit der Fehlregulation der AVP-vermittelten Wasserreabsorption verbunden zu entdecken. IMCD Zellen aus Ratte renale inneren medullae erhalten und werden für Experimente sechs bis acht Tage nach der Aussaat verwendet. IMCD Zellen in regelmäßigen Zellkulturschalen, Flaschen und Mikrotiterplatten unterschiedlicher Formate können kultiviert werden, das Verfahren erfordert nur ein paar Stunden, und ist geeignet für Standard Zellkulturlaboren.

Einleitung

In renalen Sammelkanal Hauptzellen steuert Arginin-Vasopressin (AVP) Reabsorption von Wasser durch die Stimulierung der Insertion des Wassers Aquaporin-2 (AQP2) in die Plasmamembran. AVP bindet an das G-Protein-gekoppelten Vasopressin-Typ-2-Rezeptor (V2R) stimuliert Adenylatcyclase und somit cAMP-Bildung. Initiation dieser Signalkaskade führt zur Aktivierung der Proteinkinase A (PKA). PKA phosphoryliert AQP2 an Serin 256 (S256), das ist der Schlüssel Auslöser für seine Umverteilung von intrazellulären Vesikeln in die Plasmamembran. Die Membran Einsetzen erleichtert Wasserreabsorption entlang eines osmotischen Gradienten und Feinabstimmung Körper Wasser-Homöostase.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Vorbereitung der Kulturschalen
   1. Thaw Kollagen Typ IV O / N bei 4 ° C und löst ihn in 0,1% sterile Essigsäure. Das Volumen zu verwenden, hängt von der Art und Anzahl der Gerichte, in denen die Zellen ausgesät zu werden. Verwenden 2 pg / cm ^2.
   2. Inkubieren Gerichte mindestens 1 h bei RT und waschen zweimal mit destilliertem Wasser (A. tridest).
   3. Lassen Sie die Gerichte, um richtig zu trocknen.
2. Supplementation des Mediums
   1. Erhöhen der Blutzuckerspiegel bis zu 4,5 g / L, indem 1,75 g Glucose in 500 ml Medium. Um das Medium auf 600 mosmol einzustellen, mit 100 mM NaCl und 100 mM Har....

Ergebnisse

Die erfolgreiche Kultivierung von primären Ratten IMCD-Zellen werden in einem Monolayer 6-8 Tage nach der Aussaat (Abbildung 2) führen. Per 60 mm Kulturschale gibt es etwa 6 x 10 ⁶ Zellen. Die Zellen eng an den Kulturschalen haften, da diese mit Kollagen Typ IV, eine Basalmembran Komponente ¹⁸ beschichtet wurden. Daher wird IMCD Zellen nicht einmal lösen während mehrerer gründliches Waschen Verfahren. Bis zu 80% der kultivierten Zellen exprimieren endogen V2R und AQP2. Dies sind di.......

Diskussion

Wir präsentieren ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Kultivierung von primären Ratten IMCD Zellen. Der Ansatz liefert bis zu 21 cm ² von Zellen aus einer Ratte ^20. Der Versuch erfordert Standard Zellkulturausrüstung und kann von einer einzigen Person innerhalb von etwa 6 Stunden durchgeführt werden. Daher ist dieser Ansatz eignet sich als Standard-Labormethode.

Primäre Ratte IMCD Zellen in Kulturschalen unterschiedlicher Größe ausgesät werden, von 96-We.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Kollagen Typ IV Maus	BD Biosciences	356233
Hyaluronidase	SIGMA	H6254
Kollagenase Typ CLS-II	Biochrom AG	C2-22
DMEM + GlutMAX	Invitrogen GIBCO	21885108
Nystatin	SIGMA	N4014
Ultroser G	Cytogen	15950-017
Nicht-essentielle Aminosäuren (NEA)	Biochrom AG	K0293
Gentamicin	Invitrogen GIBCO	15710
DBcAMP	BIOLOG	D009