Methodenartikel

Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

DOI:

10.3791/50512

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31. August 2013

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1Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine, 2Program in Molecular Medicine, University of Maryland School of Medicine, 3Department of Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, 4Department of Pharmacology & Experimental Therapeutics, University of Maryland School of Medicine, 5Department of Pathology and Biochemistry & Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Zusammenfassung

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Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.

Einleitung

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DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide 1 oder 2 Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine ​​assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Po....

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Protokoll

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Mehrere Schritte werden vor der Zeit durchgeführt und mehrere Reagenzien hergestellt und gelagert, bevor das Verfahren: (1) Zellkultur und Proteinisolierung, (2) Herstellung von Oligonukleotid (3) Herstellung von 96-Well-Platten (4) Kernextrakt Inkubation über Nacht. Vorgehensweise benötigt 2 Tagen wegen der Inkubation über Nacht von Kernprotein mit DNA-Oligonukleotiden.

1. Herstellung von Puffern

1.1 Kernproteinisolierung

  1. Hypotonischen Puffer: Zu 100 ml hypotonischen Puffer vorbereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) auf 98,3 ml H 2 O. Endkonzentr....

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Ergebnisse

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Die D-ELISA-Verfahren ist hochspezifisch für die bezeichnete DNA-Bindungsprotein, solange eine sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid drei Kopien des Konsensus RUNX2 Bindungsstelle (ACACCA) enthält, verwendet wird. Der primäre Antikörper, der das Protein Faktor erhöht auch die Spezifität. Der sekundäre Antikörper enthält kovalent gebundenen Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine klare Substrat (Tetramethylbenzidin) zu einem farbigen Produkt für einfache Erkennung (Abbildung 1) umwandelt. A.......

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Diskussion

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DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) 1 und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays 3 sowie Assays, die 96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays 2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte (32 P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungskomp.......

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Offenlegungen

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Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

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Die technische Unterstützung und Instrumentierung der Universität von Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core Facility, insbesondere Drs. Rena Lapidus und Mariola Sadowska, werden dankbar anerkannt. Die für die Entwicklung dieses Tests zuständig Arbeit wurde zum Teil durch die NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, eine VA Merit Award an AP, und von der Universität von Maryland Zigarette Restitutionsfonds (CRF) an der Marlene Stewart & vorgesehen finanziert Greenebaum Cancer Center.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Poly dI/dCGE Healthcare, Piscataway, NJUS20539-5UN1 U ~50mg
RUNX2 AntikörperMBL International Corp., Woburn, MAD130-31 mg/ml
Fab-spezifischer Peroxidase-konjugierter AntikörperSigma-Aldrich, St. Louis, MOA99177,1 mg/ml
TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin)EXALPHA Biologicals, Shirley, MAX1189S100 ml
NatriumcarbonatSigma-Aldrich, St. Louis, MO57995Plattenfixierende
SchwefelsäureVWR, West Chester, PABDH-39922-1Stopplösung
Multi-Well-PlattenGreiner Bio-One, Basel, Schweiz655996Avidin-beschichtete, schwarze Seiten
HALTThermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL78440Protease- und Phosphatase-Inhibitoren
ChemikalienVerschiedene HerstellerLaborqualität
Tabelle 1. Reagenzien
Spektralphotometer: Biotrak II Reader für sichtbare PlattenAmersham BiosciencesZur Verwendung mit der Stoppreaktionsmethode
Spektralphotometer: Bio-Tek Synergy HT Multireaktions-Mikroplatten-ReaderBio-Tek Instruments, Inc.Zur Verwendung mit kontinuierlicher kinetischer Überwachung
Tabelle 2. Ausrüstung

Referenzen

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  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al.

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Schlagwörter

Protein DNA InteractionsDNA Binding AssayTranscriptional RegulatorsAnti tumor AgentsQuantitative ELISANuclear Protein ExtractionBiotinylated OligonucleotidesStreptavidin Coated PlatesHorseradish Peroxidase DetectionSpectrophotometric Analysis

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