Eine quantitative Assay zur Protein Studie: DNA-Wechselwirkungen, Discover Transkriptionsregulatoren der Genexpression, und identifizieren Novel Anti-Tumor-Wirkstoffe

Zusammenfassung

Wir entwickelten eine quantitative DNA-bindenden, ELISA-basierten Assay Transkriptionsfaktor-Interaktionen mit DNA zu messen. Hohe Spezifität für das RUNX2 Protein wurde mit einer Consensus-DNA-Oligonukleotid und Erkennung spezifischer monoklonaler Antikörper erreicht. Kolorimetrischen Nachweis mit einem Enzym-gekoppelten Antikörper Substrat-Reaktion wurde in Echtzeit überwacht.

Zusammenfassung

Viele DNA-Bindungsassays, wie elektrophoretische Mobilitätsverschiebungstests (EMSA), chemilumineszenten Assays Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-basierte Assays und Multiwell-basierten Assays verwendet werden, um Transkriptionsfaktor-Aktivität zu messen. Allerdings sind diese Tests nicht-quantitative, fehlt die Spezifität, kann die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotide beinhalten und kann nicht für das Screening von Inhibitoren der DNA-Bindung anpassungsfähig sein. Auf der anderen Seite, unter Verwendung einer quantitativen DNA-bindende Enzyme-linked Immunosorbent Assay (D-ELISA-Test) zeigen wir, nukleäres Protein-Wechselwirkungen mit DNA unter Verwendung des RUNX2 Transkriptionsfaktor, der auf spezifische Assoziation mit Konsensus-DNA-Bindungssequenzen auf Biotin vorliegenden hängen markierte Oligonukleotide. Vorbereitung der Zellen, die Gewinnung von Kernprotein, und das Design der Doppelstrang-Oligonukleotiden beschrieben. Avidin-beschichteten 96-well Platten mit alkalischen Puffer fixiert und mit Kernproteinen in Nukleotid-Blockierungspuffer inkubiert. Folldurch ausgiebiges Waschen der Platten spezifischen primären Antikörper und sekundären Antikörper-Inkubationen werden durch die Zugabe von Meerrettich-Peroxidase-Substrat und der Entwicklung der Farbreaktion verfolgt. Stop-Reaktionsmodus oder kontinuierliche Überwachung kinetische wurden verwendet, um quantitativ zu messen Protein-Wechselwirkung mit DNA. Wir diskutieren entsprechende Spezifität Kontrollen, einschließlich der Behandlung mit nicht-spezifischen IgG-oder Protein oder ohne primären Antikörper. Anwendungen des Assays sind beschrieben, einschließlich ihrer Nützlichkeit in Wirkstoff-Screening und repräsentativen positiven und negativen Ergebnisse diskutiert.

Einleitung

DNA-Bindungs-Assays sind nützlich bei der Messung der Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA zu interagieren. Assays für die DNA-Bindung sind elektrophoretische Mobilität Shift-Assays (EMSA), die auf radioaktiv markierten Oligonukleotide ¹ oder ² Chemilumineszenzassays abhängen. Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays ³ sowie Assays, die ^96-Well-4 wurden auch beschrieben. Jedoch ist die EMSA eine nicht-quantitativer Assay, der die Verwendung von radioaktiv markierten Oligonukleotiden erfordert. Als Kernproteine ​​assoziieren mit den spezifischen Nukleotid-Promotor-Sequenzen, sind Bindungskomplexe auf Polyacrylamid-Gelen verzögert und die spezifische Transkriptionsfaktor kann mit einem Antikörper "Supershift" validiert werden. Wir haben eine quantitative DNA-Bindungsassay unter Verwendung eines Enzyme-Linked-Immunosorbent-Format (D-ELISA), die in der Lage, die Interaktion von RUNX2 mit DNA-Bindungssequenzen entsprechend definierten Promotorelemente zu messen, ist entwickelt in RUNX2 Zielgene. Verwendung eines Anti-Antikörpers enthält RUNX2 Spezifität des Assays und der Mangel an Radiomarkierung zeichnen diesen Assay vom herkömmlichen ^{Gel-Shift-Assay-5.} Nachweis von Bindungskomplexen ist mit der Verwendung eines sekundären Antikörpers, der mit Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine HRP-Substrat Tetramethylbenzidin (TMB) in ein gefärbtes Produkt spektrophotometrische Analyse umwandelt möglich. Der Test hier berichtet die Verwendung von mutierten DNA-Oligonukleotide als Kontrolle übernehmen und kann zum Nachweis von kompetitiven oder nicht-kompetitiven Inhibitoren der DNA-Bindung verwendet werden. Das Screening von neuen Anti-Tumor-Verbindungen ist ebenfalls mit diesem Assay möglich.

Protokoll

Mehrere Schritte werden vor der Zeit durchgeführt und mehrere Reagenzien hergestellt und gelagert, bevor das Verfahren: (1) Zellkultur und Proteinisolierung, (2) Herstellung von Oligonukleotid (3) Herstellung von 96-Well-Platten (4) Kernextrakt Inkubation über Nacht. Vorgehensweise benötigt 2 Tagen wegen der Inkubation über Nacht von Kernprotein mit DNA-Oligonukleotiden.

1. Herstellung von Puffern

1.1 Kernproteinisolierung

1. Hypotonischen Puffer: Zu 100 ml hypotonischen Puffer vorbereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl _2), 333 ul (3 M KCl) auf 98,3 ml H ₂ O. Endkonzentrationen: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl _2, 10 mM KCl. Für Hypotone Puffer + NP40 (für den Einsatz in Schritt 2.11): 0,5 ml (10% NP40) auf 9,5 ml hypotonischen Puffer für die letzten 0,5% NP40.
2. Niedrigsalzpuffer: Zu 100 ml Niedrigsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 &mgr; l (1 M MgCl _2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 73 ml H ₂ O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl _2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
3. Hochsalzpuffer: Zu 100 ml Hochsalzpuffer (zur Verwendung in Schritt 2.15) vorzubereiten, 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glycerin, 150 ul (1 M MgCl _2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M EDTA) auf 47 ml H ₂ O. Endkonzentration: 10 mM HEPES, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl _2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
4. 10% NP40-Detergens: 10 ml NP40 bis 90 ml H ₂ O
5. Protease-und Phosphatase-Inhibitoren [zum hypotonischen Puffer + NP40 (Schritt 2.11), um Niedrigsalzpuffer (Schritt 2.15) und der hohen Salzpuffer (Schritt 2.15) unmittelbar vor der Verwendung]: In 2,5 ul (1 M DTT) und 50 ul Proteaseinhibitoren (100x), 5 ml jedes Puffers für Endkonzentration von 0,5 mM DTT und 1x Proteaseinhibitoren. Der Protease-Inhibitor 100x Stock Mischung beinhaltet:Natriumfluorid (Ser / Thr, saure Phosphatasen), Natriumorthovanadat (Tyr, alkalische Phosphatasen), β-Glycerophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Natriumpyrophosphat (Ser / Thr-Phosphatasen), Aprotinin (Ser Proteasen), Bestatin (Amino-Peptidasen ), E64 (Cystein-Proteasen), Leupeptin (Ser / Cys Proteasen), EDTA (Metalloproteasen).

1.2 Vorbereitung der Testplatten

1. Plattenbefestigungslösung: So bereiten Sie 500 ml Lösung werden 5,25 g Natriumcarbonat in 500 ml H ₂ O, gut mischen und pH-Wert auf 9,7 für eine endgültige Konzentration von 0,1 M Natriumcarbonat.
2. Teller Blockierlösung: Zur Herstellung von Poly Lager dI / dC Oligonukleotid, resuspendieren 1 Unit (~ 50 mg) von Poly dI / dC in 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, der 1 mM EDTA für eine Stammkonzentration von 50 ug / ul. Stock ist bis 1 ug / ul vor der Verwendung verdünnt.

1.3 Waschpuffer und Antikörperverdünnungen

HINWEIS: Streptavidin Waschpuffer verwendet werden, um Platten zwischen den Zugaben zu waschen und auf Primär-und Sekundärantikörper verdünnen.

1. Um 1 l Streptavidin Waschpuffer, mit 2.4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), auf 1 Liter Millipore-Wasser sterilfiltriert , pH 7,18. Lagern bei 4 ° C Endkonzentration: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA-Bindungspuffer

HINWEIS: Dieser Puffer wird bei -20 ° C gelagert

1. Die Bereitstellung von DNA 15 ml Bindungspuffer, fügen 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 &mgr; l (1 M DTT), 3,0 ml (60% Glycerin), 300 &mgr; l (50 &mgr; g / &mgr; l poly dI / dC) mit entionisiertem / destilliertem H ₂ O (12 ml) verdünnt. Endkonzentrationen: 12 mM HEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% Glycerin, 1 ug / ul Poly dI / dC.

2. Zellkultur und Kernproteinisolierung

t "> Hinweis: Die Herstellung erfordert etwa 3 h Stimulation von Zellen auf Experiment hängen die Anzahl der Zellen für jedes Experiment variieren und alle Volumen reflektieren ein typisches Experiment unter Verwendung von 3 × 10 ⁷ Zellen / Punkt einstellen Volumen unterzubringen... die Anzahl der Zellen tatsächlich in dem Experiment ⁶ verwendet.

1. Um Kernprotein für die DNA-Bindungsassays, die Kultur, die menschliche Zellen RUNX2 (Endothel-, Osteosarkom, Brustkrebs-Zellen) in geeigneten Medien ⁶ exprimieren.
2. Gönnen subkonfluente Zellen mit Nocodazol (0,2 ug / ml für 16 Stunden) zu den Zellen in der G2 / M Zellzyklus Grenze ⁶ verhaften. Unter diesen Bedingungen wird das Protein stabilisiert RUNX2 und maximale DNA-Bindung erreicht wird. Auf diese Weise ist genug Kernprotein für mehrere Tests und Inhibitoren können aus dem gleichen Präparat verglichen werden, zur Verfügung.
3. Für jeden Schritt, Pre-kühlen die Zentrifuge auf 4 ° C und bereiten Puffer und Chill 20 min bei 4 ° C vor der Zellernte.
4. Chill-Zellen (4 ° C) und die Durchführung Verfahren auf Eis.
5. Zentrifuge Zellen bei 1000 rpm für 5 min in einem 15 ml Polypropylen-Rundrohr.
6. Wash 1x mit eiskaltem PBS (Ca ^{2 +} und Mg ^{2 +-frei).}
7. Zentrifuge wieder und entsorgen PBS Stand.
8. Add 500 ul hypotonischen Puffer ohne Protease-Inhibitoren, wobei darauf geachtet, das Zellpellet vollständig zu suspendieren.
9. Übertragen Inhalt in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen.
10. Unmittelbar bei 5.500 rpm für 5,5 min zentrifugieren, den Überstand verwerfen und halten das Zellpellet.
11. Zellpellet in 500 ul hypotonischen Puffer, der 0,5% NP40. Hinzufügen Protease-und Phosphatase-Inhibitoren und 0,5 mM DTT (wie in Schritt 1.1.5 beschrieben).
12. Die Probe wird auf Eis für 30 Minuten ruhen.
13. Zentrifuge bei 13.000 rpm für 10 min.
14. Entsorgen Sie den Überstand (enthält die cytosolische Proteine).
15. Resuspendieren Sie das Kernpellet in jeweils geringer sal 60 ult-Puffer (um die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) und Hochsalz-Puffer (auf die Protease-Inhibitoren und 0,5 mM DTT wurden aus Schritt 1.1.5 hinzugefügt wurde) für eine Gesamtmenge von 120 ul. In 60 ul Niedrigsalzpuffer zum Pellet ersten und resuspendieren, dann fügen Sie 60 ul Hochsalzpuffer. Mischen Sie den Pellet an der Aufwirbelung unterstützen.

HINWEIS: Dieser Schritt hilft loszuwerden einige der Kernmembran-Proteine ​​und bis zur Lyse Schritt gesetzt: niedrige Salz ersten (Pellet erneut, Vortex), so hohe Salz (Vortex) optimiert diesen Schritt. Halten Extrakt auf Eis für 30 min, unter Verwirbelung nach den ersten 10 min.

16. Zentrifuge bei 12.000 rpm für 15 min; halten den Überstand mit dem Kernprotein.
17. Messen Proteinkonzentration (versuchen, um Proben bei 2-5 mg / ml zu halten), aliquoten in entsprechenden Mengen (10 ul / Röhrchen) und bei -80 ° C

HINWEIS: Geschätzte Ausbeute: 30 x 10 ⁶ cells 5 ug / ul Protein in 120 ul ergeben. 5 x 10 ⁶ Zellen 2,2 ug / ul Protein in 40 ul ergeben.

3. Vorbereitung der Doppel Oligonukleotid

1. Entwerfen komplementäre Oligonukleotide mit kompatiblen Halbstellen an den Enden. Für RUNX2 diese sind: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-Biotin (Sinn) und 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-Biotin (Antisense).

HINWEIS: Pilotversuche festgestellt, dass drei RUNX2 Bindungsstellen und Single-Ende Biotin ergab die meisten reproduzierbare Ergebnisse.

2. 5x herzustellen Annealing-Puffer: In 300 &mgr; l (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 &mgr; l (1 M MgCl _2), 10 &mgr; l (1 M DTT) und 260 &mgr; l H ₂ O (600 &mgr; l final).
3. Zu 200 pmol von jedem Einzelstrang-oligonucleotide (3 ul), fügen Sie 12 ul 5x Annealing-Puffer und 45 ul H ₂ O für insgesamt 60 ul (200 pmol/60 ul).
4. Hitze bei 95 ° C für 5-10 min in einem Heizblock.
5. Abkühlen auf 65 ° C langsam (durch Einstellen der Temperatur auf 65 ° C, dauert es 15 min), dann auf Raumtemperatur langsam durch Abschalten der Leistung der Wärmeblock (oder indem Sie in 50 ml 65 ° C Wasser in einem Becherglas auf Eis, dies dauert 15-20 min).

4. Herstellung von 96-Well-Platten

HINWEIS: Verwenden Sie keine Milchproteine ​​in den Waschpuffer.

1. Fix Platte mit Befestigungslösung (0,1 M Natriumcarbonat): add 300 ul /.
2. Inkubation für 2 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur (RT) oder kein Schütteln bei 4 ° C (O / N).
3. Waschen Platte 3x mit Streptavidin Waschpuffer (WB): add 300 ul / jeder Zeit.
4. Hinzufügen Biotin-markierten doppelsträngigen Oligonukleotids (3 Konsensus-Bindungsstellen pro Nukleotid) für 2 h with Schaukel (1,25 nmol / gut; 100 ul / Vertiefung).
5. 3x Waschen mit kaltem WB: add 300 ul / und dann sofort die Platte umzukehren in eine Senke und tupfen Sie die Kanten auf einem Papiertuch nach jeder Zugabe.

HINWEIS: Verwenden Sie keine Pipettenspitzen, um Flüssigkeit von den Platten zu entfernen, da dies zu kratzen Avidin: Biotin: DNA-Komplexe aus den Vertiefungen. Tun Sie dies für alle nachfolgenden Waschschritte.

5. Inkubation mit Kernextrakt

HINWEIS: Sie ersetzen nicht Lachs oder Hering-Sperma-DNA für die Poly dI / DC-Blockpuffer. Vermeiden Sperrplatten mit Milchproteinen. Beide Blockierungsmittel führen zu einer hohen Hintergrundwerten.

1. Inkubation mit spezifischen Transkriptionsfaktor aus der Kernextrakt (90 ul /) erstellt. Erstellen Sie einen Master-Mix mit Kernextrakt (DNA-bindendes Protein, 3-9 g / gut) + Poly dI / dC (1 ug / ul von einer 50 ug / ul Lager) in 1x DNA-Bindungspuffer. Volumen wird als die Gesamtzahl der benötigtenBrunnen erforderlich (90 ul / Vertiefung).
2. Einem potentiellen Inhibitor, wie z. B. Vitamin D3 (Fig. 2) oder CADD Verbindung 5221975 (Fig. 3) oder der geeigneten Verdünnung der Lösungsmittelkontrolle, wie Ethanol, wird in diesem Schritt zugegeben.
3. Legen Sie die Platte auf Schaukel Plattform, O / N bei 4 ° C
4. 3x Waschen mit WB: add 300 ul /

6. Zugabe des primären Antikörpers

HINWEIS: Primärantikörperverdünnungen sollte frisch zubereitet werden - Speicher wird nicht empfohlen.

1. Verdünnen RUNX2-spezifische monoklonale Antikörper (Lager 1 ug / ul) 5.1, 000 in Streptavidin-Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug.
2. Inkubation für 1 h bei RT auf einer Schwingplattform.
3. 3x Waschen mit WB, fügen Sie 300 ul /.

7. Zugabe von sekundärem Antikörper

HINWEIS: Sekundärantikörperverdünnungen können sto seinrot bei 4 ° C über Nacht bei Bedarf am nächsten Tag.

1. Verdünnen F _{ab-spezifische} Affinität gereinigt HRP-konjugierte Antikörper (7,1 mg / ml Stamm) bis 1:1,400 in Streptavidin-Waschpuffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml Waschpuffer. Vorbereitung für die Zugabe zu jeder Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen (90 ul / Vertiefung) in dreifacher Ausfertigung genug.
2. Inkubation 30 min bei RT auf einer Schwingplattform.
3. Wash 6x mit WB durch Umdrehen der Platte in Enke (300 ul / Vertiefung).

8. HRP-Substrat-und Produktentwicklung

1. In 50 ul TMB-Substrat pro Vertiefung direkt ab Lager Flasche.
2. Inkubation 10-20 min bei RT im Dunkeln (Stop-Reaktion-Methode) oder die Messung der Extinktion direkt (kontinuierliche Bewegungsüberwachung).

9. Reaktionsmessung

1. Stoppen Reaktionsverfahren: Für die visuelle Stopp-Reaktion, überprüfen Sie Farbwechsel von blau und klar zu stoppen Reaktion mit 50 ul Schwefelsäure.
2. Messung der Extinktion bei 450 nm mitdie Biotrak II Visible Plattenleser Spektralphotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, USA) oder ein ähnliches Instrument.
3. Kontinuierliche Überwachung kinetische Methode: Fügen Substrat nach dem letzten Waschen und kurz vor der Platzierung im Spektralphotometer (nicht die Reaktion zu stoppen).
4. Extinktion bei 635 nm mit dem Bio-Tek Synergy HT Multi-Reaktionsmikroplatten-Reader Spektralphotometer (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) oder ein ähnliches Instrument.

Ergebnisse

Die D-ELISA-Verfahren ist hochspezifisch für die bezeichnete DNA-Bindungsprotein, solange eine sequenzspezifischen, doppelsträngigen Oligonukleotid drei Kopien des Konsensus RUNX2 Bindungsstelle (ACACCA) enthält, verwendet wird. Der primäre Antikörper, der das Protein Faktor erhöht auch die Spezifität. Der sekundäre Antikörper enthält kovalent gebundenen Meerrettich-Peroxidase (HRP), die eine klare Substrat (Tetramethylbenzidin) zu einem farbigen Produkt für einfache Erkennung (Abbildung 1) umwandelt. A...

Diskussion

DNA-Bindungstests verwendet werden, um die Fähigkeit der Transkriptionsfaktoren, mit DNA in Wechselwirkung zu messen. Assays für die DNA-Bindung umfassen elektrophoretische Mobilitätsverschiebung (EMSA) ¹ und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) basierende Assays ³ sowie Assays, die ^96-Well-4 wie Chemilumineszenzassays ^2. Die EMSA ist nicht quantitative und verwendet radioaktiv markierte ⁽³² P) Oligonukleotiden. Diese sind mit Kernproteinen inkubiert und Bindungskomp...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Poly dI/dC	GE Healthcare, Piscataway, NJ	US20539-5UN	1 U ~50mg
RUNX2 Antikörper	MBL International Corp., Woburn, MA	D130-3	1 mg/ml
Fab-spezifischer Peroxidase-konjugierter Antikörper	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	A9917	7,1 mg/ml
TMB-Substrat (Tetramethylbenzidin)	EXALPHA Biologicals, Shirley, MA	X1189S	100 ml
Natriumcarbonat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	57995	Plattenfixierende
Schwefelsäure	VWR, West Chester, PA	BDH-39922-1	Stopplösung
Multi-Well-Platten	Greiner Bio-One, Basel, Schweiz	655996	Avidin-beschichtete, schwarze Seiten
HALT	Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL	78440	Protease- und Phosphatase-Inhibitoren
Chemikalien	Verschiedene Hersteller	Laborqualität
Tabelle 1. Reagenzien
Spektralphotometer: Biotrak II Reader für sichtbare Platten	Amersham Biosciences		Zur Verwendung mit der Stoppreaktionsmethode
Spektralphotometer: Bio-Tek Synergy HT Multireaktions-Mikroplatten-Reader	Bio-Tek Instruments, Inc.		Zur Verwendung mit kontinuierlicher kinetischer Überwachung
Tabelle 2. Ausrüstung