Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat

9.7K Aufrufe

⸱

DOI:

10.3791/50523

⸱

18. September 2013

 ,  , 
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven and Leuven Institute for Neuroscience and Disease (LIND)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Proteine, die sowohl GTPase und Kinase-Domänen kodieren, und die in Zellen phosphoryliert sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur LRRK1 und LRRK2 in Zellen mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um ihre Gesamtzell Phosphorylierung zu messen bietet.

Zusammenfassung

Leucin-reichen Repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) Paraloge, die eine ähnliche Domänenorganisation zu teilen, die eine Serin-Threonin-Kinasedomäne, einem Ras komplexer Proteine ​​Domain (ROC), einer C-terminalen Domäne des ROC (COR), und Leucin-reichen und Ankyrin-Repeats, wie am N-Terminus. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4 gebracht. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll, um die LRRK1 und LRRK2-Proteine ​​in Zellen, die mit 32 P-Orthophosphat zu kennzeichnen, wodurch ein Mittel, um die Gesamt Phosphorylierung dieser 2-Proteine ​​in Zellen zu messen bietet. Kurz, getaggt Affinität LRRK Proteine ​​in HEK293T Zellen, die Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, zum Ausdruck gebracht. Die 32 P-Orthophosphat von den Zellen assimiliert nach wenigenStunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate sind dabei radioaktiv markiert. Über die Affinitätsmarkierung (3xflag) die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt. Das Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Phosphorylierung von einem anderen Protein, das in Zellen exprimiert wird und durch Immunpräzipitation isoliert werden kann, zu überwachen.

Einleitung

Leucin rich repeat-Kinasen 1 und 2 (LRRK1 und LRRK2) sind Multidomänen-Paralogen, die eine ähnliche Domäne Organisation teilen. Beide Proteine ​​kodieren, eine GTPase Sequenz ähnlich der Ras-Familie von GTPasen (Ras komplexer Proteine ​​oder ROC) sowie einen C-terminalen Domäne des ROC (COR), effektiv Klassifizieren beide Proteine ​​an den Proteinfamilie ROCO 5,6. N-Terminus der ROC-COR Domain Tandem, beide Proteine ​​kodieren ein Leucin-reichen Repeat-Domäne sowie eine Ankyrin-ähnlichen Domäne, während nur LRRK2 kodiert eine zusätzliche Gürteltier domein 6-8. C-Terminus der ROC-COR, beide Proteine ​​teilen eine Serin-Threonin-Kinase-Domäne, während nur LRRK2 kodiert ein WD40-Domäne in der C-terminalen Region 8. Die genaue Rolle der zellulären LRRK1 und LRRK2 müssen noch aufgeklärt werden, aber LRRK1 in Tyrosinkinase-Rezeptor-Signal 1,2 gebracht worden, während die genetische Beweise deuten auf eine Rolle von LRRK2 in der Pathogenese von Parkinson-Krankheit 3,4.

Die Phosphorylierung von Proteinen ist eine gemeinsame Regulationsmechanismus in den Zellen. Zum Beispiel kann die Phosphorylierung essentiell für die Aktivierung von Enzymen bzw. für die Einstellung von Proteinen mit einem Signalisierungs komplex sein. Die zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 wurde umfassend charakterisiert und phosphosite Mapping hat eine Mehrheit der zellulären Phosphorylierungsstellen in einem Cluster zwischen der Ankyrin repeat und Leucin-reichen Wiederholungsdomänen auftreten 9-11 gezeigt. Obwohl LRRK1 zellulären Phosphorylierungsstellen noch nicht abgebildet werden, Beweise aus Studien mit Phosphoprotein-Färbung von Blots von immun LRRK1 Protein aus COS7-Zellen legt nahe, dass LRRK1 Protein in Zellen phosphoryliert 12.

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. Affinity getaggt LRRK proteIns in HEK293T-Zellen, die einem Medium, das 32 ​​P-Orthophosphat ausgesetzt sind ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabei radioaktiv markiert. Der Affinitäts-Tag (3xflag) wird dann verwendet, um die LRRK Proteine ​​von anderen zellulären Komponenten durch Immunpräzipitation isoliert werden. Immunpräzipitate werden dann über SDS-PAGE aufgetrennt, auf PVDF-Membranen und Analyse der enthaltenen Phosphate durch Autoradiographie (32 P-Signal) und Western-Detektion (Protein-Signal) der Proteine ​​auf den Blots durchgeführt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die vorliegende Protokoll verwendet radioaktiven 32 P-markierten Orthophosphat, um zelluläre Phosphorylierung von LRRK2 folgen. Es ist wichtig, im Auge zu behalten, dass alle Operationen mit radioaktiven Reagenzien sollte unter Verwendung geeigneter Schutzmaßnahmen, um die Exposition von radioaktiver Strahlung an den Betreiber und die Umwelt zu minimieren, durchgeführt werden. Verbindungen, die Isotope, die ionisierende Strahlung aussenden können sich schädlich auf die menschliche Gesundheit und strengen Genehmigungs-und Verwaltungsvorschriften auf institutioneller und nationaler Ebene Kontrolle ihrer Verwendung. Die Experimente in diesem Protokoll wurden folgende Ausbildungs ​​in Open-Source-Strahlung Einsatz bei Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven) und nach den Richtlinien der guten Laborpraxis durch die Gesundheit, Sicherheit und Umweltabteilung an der Universität vorgesehen durchgeführt. Mehrere Schritte in unserem Protokoll sind weit wie Zellkulturen, SDS-PAGE, Western-Blotting eingesetzt und sind hier gegebenen Einzelheiten des Protokolls in unserem Labor angewendet. Es isthould darauf hingewiesen, dass genauen experimentellen Bedingungen variieren von Labor zu Labor werden, daher spezifische Maßnahmen, um die ordnungsgemäße Umgang mit radioaktivem Material zu gewährleisten, sollte auf jeden neuen Laborumgebung angepasst werden.

Die Verwendung von Open-Source-Strahlung ist die vorherige behördliche Genehmigung und die Regulierungsbehörde für Open-Source-Strahlung in der Laborforschung zuständig, ist von Land zu Land. Benutzer sollten mit ihren institutionellen Strahlenschutzbeauftragten, um zu gewährleisten, dass Verfahren, um lokale Regeln und Vorschriften entsprechen konsultieren. Informationen zu Aufsichtsbehörden gefunden werden kann: in Belgien, der Bundesagentur für Nuklearkontrolle ( http://www.fanc.fgov.be , Website in Französisch oder Niederländisch), im Vereinigten Königreich, die Health and Safety Executive ( http: / / www.hse.gov.uk / Strahlung / ionisierende / index.htm ), in den Vereinigten Staaten die NucLear Regulatory Commission ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), in Kanada die kanadische Kommission für nukleare Sicherheit ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ) und in Deutschland Das Bundesamt für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Sicherheitsmaßnahmen relevant zu dieser Protokoll haben im Text erwähnt worden ist, markiert mit dem radioaktiven Strahlensymbol ( figure-protocol-1 ).

1. Metabolische Markierung von Zellen

  1. Vorbereitung der Zellen für die Kennzeichnung.
    1. Kultur HEK293T-Zelllinien gemß Standardkulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2) in DMEM mit 8% fötalem Kälberserum und Gentamycin.
    2. Erweitern Zellen ausreichenderhalten von mindestens 1 x 10 6 Zellen pro Probe zu prüfen.
    3. Trypsinieren Zellen und Platte aus in 6-Well-Platten (35 mm Durchmesser) bei 10 6 Zellen / well.
    4. 24 Stunden nach Ausplattieren Zellen-, Express-3xflag LRRK2 Protein über Transfektion oder lentiviralen Vektor vermittelte Transduktion.
      1. Für die Transfektion mischen pro Probe 4 ug DNA (pCHMWS-3xflag LRRK2-Plasmid 13-15 oder pCHMWS-3xflag-LRRK1 Plasmid 15) und 8 ul von linearen Polyethylenimin (PEI linear, 1 mg / ml) in 80 ul DMEM (ohne Zusätze ). Lassen Sie komplexe 15-30 min dann fügen komplex, um Zellen durch Mischen gut in Medium vorhanden.
      2. Für Lentivirusvektor vermittelte Transduktion, verdünnte Lentivirusvektor Codierung 3xflag-LRRK1 oder -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, als Faustregel gilt, transduzieren mit doppelt so vielen Wandlereinheiten, dh Anzahl der funktionellen Vektorpartikel, der lentivector wie es Zellen) in das Kulturmedium. Eine Beschreibung des Produkts Ion der LV-3xflag-LRRK1 / 2 wurde bereits beschrieben 15.
    5. Wenn Zellen 80-100% konfluent (ungefähr 48 h nach der Transfektion oder Transduktion) gründlich Zellen mit vorgewärmtem (37 ° C) DMEM ohne Phosphate.
  2. Etikett Zellen mit 32 P-Orthophosphat.
    1. Beachten Sie die allgemeinen Grundsätze der Sicherheit bei der Arbeit mit Strahlung.
      1. figure-protocol-2 Führen Sie alle Operationen mit 32 P in einer bestimmten Strahlungsbereich.
      2. figure-protocol-3 Geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden sollten - unter Standard-Betriebsverfahren in unserem Labor Dazu gehören Laborkittel, Doppel-Handschuhen und Schutzbrille.
      3. g "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Alle Arbeiten mit 32 P sollte von den Benutzern von 6 mm Plexiglas-Bildschirme abgeschirmt werden, um die Exposition zu minimieren.
      4. figure-protocol-4 Persönliche Überwachungsgeräte sollte immer verwendet werden - innerhalb KUL alle zertifizierten Open-Source-Strahlung Benutzer einen Film Abzeichen auf der Brusttasche des Laborkittel, die Strahlenbelastung während der Experimente überwachen befestigt trägt.
      5. figure-protocol-5 Alle Versuchsflächen sollten für Radioaktivität vor und nach Gebrauch mit einem Geigerzähler geprüft werden.
      6. figure-protocol-6 Alle potenziell kontaminierte Verbrauchsmaterialien sollte streng nach den Richtlinien des Instituts für ra entsorgt werdenaktiver Abfallbeseitigung.
    2. Unter einer laminaren Strömung, bereiten ein Falcon-Röhrchen mit 2,1 ml DMEM ohne Phosphate (auf 37 ° C vorgewärmt) pro 6-Well-Platte von Zellen zu beschriften.
      1. Zum Beispiel, um Label Zellen in allen Vertiefungen einer 6-Well-Platte, bereiten 12,6 ml Medium (= 6 x 2.1). Dies ist es, für die 2 ml Medium pro Platte mit 6 Vertiefungen und von Zellen mit einem 5% igen Überschuss des Volumens verwendet werden.
    3. figure-protocol-7 Vorbereitung der Bank, bei der die Experimente mit ionisierender Strahlung durchgeführt. Der Arbeitsraum wird durch eine Überlaufmatte, auf der eine Schutzfolie aus einem absorbierenden Material bedeckt ist, angeordnet. Falls Sie einen Liner mit einer wasserdichten Oberfläche, legen Sie sie mit dem Absorptions Seite nach oben.
    4. figure-protocol-8 Auch bieten füreine Plexiglasbehälter auf der Arbeitsfläche und legen Sie den Schlauch von Phosphat-freiem Medium in sie.
    5. figure-protocol-9 Die Führung ausgekleideten Behälter mit dem Fläschchen von 32 P-markierten Orthophosphat aus dem Kühlschrank und bringen es auf die Radioaktivität Bank. Überwachen Sie den Behälter für radioaktive Kontamination von außen mit einem Geigerzähler.
    6. figure-protocol-10 Verdünnt mit 32 P markiertem Orthophosphat in das Rohr von DMEM ohne Phosphate in einer Konzentration von 24 &mgr; Ci / ml.
      1. Hinweis: bei 2 ml pro 6-well-Platte gut von Zellen entspricht dies 5 Ci 32 P-markierten Ortho / cm 2 kultivierten Zellen.
      2. figure-protocol-11 Haltendas Rohr in der Plexiglas-Glas.
    7. figure-protocol-12 Der Behälter ist mit dem Rest der 32 P-Orthophosphat markiert und in den Kühlschrank zu ersetzen.
    8. figure-protocol-13 Die 6-Well-Platten mit Zellen aus dem Inkubator und auf der Radioaktivität Bank beschriftet werden.
    9. figure-protocol-14 Mediumüberstand entfernen und entsorgen. 2 ml der Phosphat-freiem Medium mit 32 P markiert Ortho / gut.
    10. figure-protocol-15 Legen Sie die Kulturplatten in eine Plexiglas-Box dann den Behälter fo überwachenr radioaktive Kontamination von außen mit einem Geigerzähler.
    11. figure-protocol-16 Übertragen Sie die Plexiglas-Box mit Zellen einer eukaryotischen Zelle Inkubator Isotopen metabolische Markierung gewidmet.
    12. figure-protocol-17 Inkubation für 1-20 Stunden bei 37 ° C in 5% CO 2.
      1. Im allgemeinen wird eine Einarbeitungszeit von 3 h oder mehr empfohlen. Die optimale Inkubationszeit kann durch Zeitverlaufsexperimente für jedes spezifische Protein nach Wunsch zu beurteilen.
    13. figure-protocol-18 Optional: Behandlung von Zellen mit Verbindung.
      1. In Experimenten mit Verbindungsbehandlung (wie ein Kinase-Inhibitor), eine Verbindung nach einem Behandlungsschritt in enthaltenentbindet den Inkubationszeit ohne Verbindung, um die Kennzeichnung zu ermöglichen. Nach der gewünschten Inkubationszeit werden die Perspex-Box die Kulturplatten aus dem Inkubator entfernt und die Radioaktivität Bank gebracht.
      2. figure-protocol-19 Markierungsmedium von vorgewärmtem phosphatfreie Medium in dem die Verbindung in der gewünschten Konzentration verdünnt ist, ersetzt. Entsorgen Medium in einer 50 ml Tube für die Abfallsammlung, die in der Plexiglasgefäß gegeben wird.
      3. figure-protocol-20 Zellen werden in der Perspex-Box ersetzt und in der Zelle Inkubator für die gewünschte Kontaktzeit gesetzt.
  3. figure-protocol-21 Sammeln Lysaten von labeführte Zellen.
    1. figure-protocol-22 Entfernen Medium von Zellen und entsorgen in den Abfallsammelröhrchen, die in der Plexiglasgefäß gegeben wird.
    2. figure-protocol-23 Spülen Sie Zellen 2x mit eiskaltem TBS (Tris 50 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4, 2 ml / Spülung), Verwerfen Spüllösung in einem Abfallsammelrohr in der Plexiglasgefäß gegeben.
    3. figure-protocol-24 0,5 ml eiskaltem Immunpräzipitation (IP) Lyse-Puffer in jede Vertiefung und sammeln Lysat durch Pipettieren Lysat nach oben und unten, um alle Zellen lysiert lockern.
      1. Vorbereitung der erforderlichen Menge von IP-Lysispuffer (0,5 ml / Probe plus 5% Überschuß) vor der Zeit, indem der Protease-Inhibitor-Cocktail und PhosphataseInhibitor-Cocktail frisch kurz vor der Verwendung.
      2. Die Zusammensetzung des Lysepuffers ist 20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton, 10% Glycerin, Protease-Inhibitor-Cocktail-und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail.
    4. figure-protocol-25 Transfer des Lysats in ein Mikrozentrifugenrohr und Inkubation auf Eis für mindestens 10 min.
    5. figure-protocol-26 Zentrifugieren Sie die Lysate in einer Mikrozentrifuge bei> 5000 g für 10 min.
    6. figure-protocol-27 Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.

2. Analysieren Markierung von Proteinen in der Nähe

  1. figure-protocol-28 Isolieren des Proteins von Interesse Immun (IP).
    1. figure-protocol-29 Übertragen Sie die Mikrozentrifugenröhrchen mit Lysate zentrifugiert wieder auf Eis und Pipette den Überstand in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 10 ul Bettvolumen von äquilibriertem Flag-M2-Agarose-Perlen.
      1. Bereiten Sie die Rohre mit äquilibriertem Flag-M2-Agarose-Perlen vor der Zeit.
      2. Dazu pipettieren ein Volumen von Flag-M2-Agarose Gülle entsprechend 10 ul Bettvolumen pro Probe plus 5% Überschuss.
        1. Generell entspricht ein 10 ul Bettvolumen von Perlen zu 20 ul Gülle. Finden Sie in der Artikeldatenblatt für weitere Details.
      3. Äquilibrieren die Perlen durch Spülen 3x in 10 Volumen (bezogen auf Schüttvolumen) von IP-Lyse-Puffer.
      4. Verteilen äquilibriert Perlen gleichmäßig auf 10 ul Bettvolumen / Rohr in so viele Rohre, da es Proben. Beschriften Sie die Röhrchen mit einer Kennung für jede Probe.
    2. figure-protocol-30 Übertragen Sie die Reaktionsgefäße bis 50-ml-Röhrchen (ca. 6 Mikro tubes/50 ml Tube) mit einer radioaktiven Strahlensymbol gekennzeichnet und auf Eis zu halten.
    3. figure-protocol-31 Übertragungs Proben auf eine Drehvorrichtung hinter einer Plexiglasabschirmung in dem bestimmten Bereich eines kalten Raum über Kopf Mischen bei 4 ° C für 1-20 Stunden.
    4. figure-protocol-32 Übertragen Sie die Proben zu einem bestimmten Arbeitsbereich auf Eis.
    5. 50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Spin down das Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einem Abfallsammelröhrchen.
    6. figure-protocol-33 Waschen Sie die Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen durch Resuspendieren in 1 ml IP-Waschpuffer.
      1. Zusammensetzung der IP-Waschpuffer: 25 mM Tris pH 7,5, NaCl 400 mM, Triton 1%. Es wird empfohlen, auch Protease-und Phosphatase-Inhibitoren in der Waschpuffer für Proteine ​​empfindlich gegen Abbau durch Co-Reinigung von Proteasen oder Dephosphorylierung durch Co-Reinigung von Phosphatasen.
      2. figure-protocol-34 Spin down die Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einen Abfallsammlungtion Röhre.
      3. figure-protocol-35 Wiederholen Sie den Waschschritt 3x.
    7. figure-protocol-36 Nach den Waschschritten Dynabeads in 1 ml IP Spülung Puffer (Tris 25 mM pH 7,5, MgCl 2 10 mM, Dithiothreitol (DTT), 2 mM, Triton 0,02%, beta-Glycerophosphat 5 mM Na 3 VO 4 0.1 mM).
    8. figure-protocol-37 Spin down das Protein gebunden Flag-M2-Agarose-Perlen in einer Mikrozentrifuge (1000 g, 1 min) und den Überstand verwerfen in einem Abfallsammelröhrchen. Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer.
    9. figure-protocol-38 Resuspendieren Perlen in 40 & mu; l IP-Probe SDS-Ladepuffer (Tris-HCl 160 mM, pH 6,8, 2% SDS, 0,2 M DTT, 40% Glycerin, Bromphenolblau 2 mg / ml).
      1. Proben können sofort analysiert oder in einem -20 ° C Gefrierschrank für Hinter Analyse gespeichert werden.
        1. figure-protocol-39 Für die Lagerung von Proben bei -20 ° C, Ort Proben in Rohrhalter oder Kisten in einer Plexiglas-Box in einer radioaktiven Strahlensymbol gekennzeichnet Gefrierschrank für die Lagerung von radioaktiven Proben gewidmet.
    10. figure-protocol-40 Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.
  2. figure-protocol-41 Resolve IP Proben über SDS-PAGE und blot auf eine PVDF-Membran.
    1. figure-protocol-42 Wärme Proben in Ladepuffer auf 95 º C für 2 min und zentrifugieren für 1 min bei> 1.000 × g, um die Kügelchen zu pelletieren.
    2. figure-protocol-43 Bereiten Sie die Protein-Gel-Elektrophorese-Modul auf der Radioaktivität einer Bank hinter Plexiglas-Bildschirm.
    3. figure-protocol-44 Laden Sie die Proben auf einem 3-8% Tris-Acetat-SDS-PAGE-Gelen.
      1. Diese Art von Gel zur Lösung mit hohem Molekulargewicht (HMW)-Proteinen geeignet. Andere Typen Gel kann auch geeignet sein, wie einem 4-20% Bis-Tris-Tricin-Gel oder-Glycin 4-20% Gelen.
      2. Fügen Sie eine Molekulargewichtsmarker, die sich auf Größen von HMW-Proteine ​​zu erkennen ist.
    4. figure-protocol-45 Führen Elektrophorese bei 150 V für 1 Stunde.
    5. figure-protocol-46 Nach der Elektrophorese, entfernen Sie das Gel aus dem Kunststoffgehäuse und übertragen das Gel in einen Behälter mit Western-Blot-Transferpuffer.
      1. Zusammensetzung der Western-Blot-Transferpuffer: 50 mM Tris, 40 mM Glycin, 0,04% SDS, 20% Methanol.
      2. figure-protocol-47 Abgeschnittenen Teile des Gels, die herausragen, wie die gut Separatoren und unteren Teil des Gels, der herausragt.
    6. Bereiten Sie eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran pro Gel durch Eintauchen in Methanol für 1 min, dann in Transferpuffer.
      1. Die Membranen werden zu den s geschnitten ame Größe wie das Gel zuzüglich einer Marge von 3 mm.
    7. Legen Sie eine semi-Dry-Blotting-Modul auf der Radioaktivität Bank und nehmen Sie die Abdeckung und die obere Elektrodenplatte.
    8. figure-protocol-48 Bereiten Sie die Blotting-Sandwich auf der Oberfläche des Halbtrocken-Blotting-Modul.
      1. Befeuchten Sie einen extra dicken (2,5 mm, 7,5 x 10 cm groß) Löschfilter in Transferpuffer und auf Bodenplatte der Blotting-Modul.
      2. figure-protocol-49 Setzen Sie den Pre-wet PVDF-Membran auf der Blotting-Filter.
      3. figure-protocol-50 Legen Sie das Gel auf die PVDF-Membran, und entfernen Sie alle Luftblasen.
      4. 523/50523rad1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Füllen Sie das Blot-Sandwich durch Benetzung einen extra dicken Blot-Filter in Transferpuffer und auf der Bodenplatte des Löschmoduls. Entfernen Sie alle Luft Blasen schließlich in der Blotting-Sandwich vor.
        Bitte beachten Sie, dass die Beschreibung hier angegeben werden, mit dem BioRad Trans-Blot SD-System, bei dem Elektroden, so dass Proteine ​​wandern nach unten auf die Membran sind kompatibel. Andere Löschsysteme sind auch mit diesen Schritten mit geringfügigen Anpassungen wie jene eventuell benötigt, um eine weitere Berücksichtigung Blotting Richtung erfolgen oder, im Fall der Tank-Blotting, zusätzliche Flüssigkeit die Abfälle in der gleichen Weise wie der Elektrophoresepuffer oben angeordnet sein kompatibel.
    9. figure-protocol-51 Entfernen Sie alle überschüssigen Puffer mit einem saugfähigen Gewebe und setzen Sie die Deckplatte und die Abdeckung des semi-d ry Blotting-Modul.
    10. figure-protocol-52 Transferproteine ​​bei 15 V für 1-2 Stunden.
    11. figure-protocol-53 Während dieser Zeit reinigen die Elektrophorese-Modul.
      1. figure-protocol-54 Entsorgung radioaktiver Abfälle in speziellen Abfallbehälter, die hinter Plexiglas Schilde gespeichert sind.
      2. figure-protocol-55 Spülen Sie die Elektrophorese-Modul mit destilliertem Wasser (AD) und entsorgen das Spülwasser in der flüssigen radioaktiven Abfallbehälter.
    12. 0523/50523rad1.jpg "/> Nach der Übertragung, entfernen Sie die PVDF-Membran mit geblotteten Proteine ​​aus dem Blot-Modul.
    13. figure-protocol-56 Optional: führen Sie eine Ponceau S-Färbung von Proteinen ausgelöscht, um Proteine ​​zu visualisieren.
      1. figure-protocol-57 Übertragen Sie die Blot in eine flache-Inkubation Gefäß mit Ponceau S-Lösung und Inkubation für 5 min.
      2. figure-protocol-58 Spülen Sie 2x schnell in AD.
    14. figure-protocol-59 Trocknen der Membran.
  3. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Führen Autoradiographie.
    1. figure-protocol-60 Setzen Sie die Membran auf eine Phosphoreszenz Platte für 1-5 Tage.
    2. figure-protocol-61 Lesen Sie die 32P aus der exponierten Phosphoreszenz Platte mit einem Sturm 840 Phosphoreszenz Scanner oder gleichwertig und speichern Sie das Bild als hochauflösende TIFF.
  4. figure-protocol-62 Erkennen Protein-Ebene über Immundetektion.
    1. figure-protocol-63 Rehydrate die Membranen durch Eintauchen kurz in Methanol, dann auf einem flachen Gefäß-Inkubation mit PBS übertragen.
    2. figure-protocol-64 Blockieren die Membranen in PBS-T (PBS mit 0,1% Triton) mit 5% Milch.
    3. figure-protocol-65 Inkubation der Blots mit Anti-LRRK2 13,16 Antikörper oder Anti-Flag-Antikörper und Verfahren weiter mit geeigneten Waschschritte und sekundären Antikörper-Inkubation.
    4. figure-protocol-66 Führen Chemilumineszenzdetektion, um die relativen Proteinmengen von LRRK2 bestätigen.
  5. Quantifizieren Einbau von 32 P in LRRK2.
    1. Führen densitometrische Analyse der Banden auf dem Blot Autoradiogramme und Immunreaktivität mit der entsprechenden Software wie ImageJ-Software, ein Freeware-Programm auf der National Instit verfügbarnuten für Gesundheits-Website ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ).
    2. Berechnen Phosphatspiegel Einarbeitung als das Verhältnis des autoradiographischen Signals über die Immunreaktivität Ebene.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Um die Gesamt Phosphorylierung von LRRK1 und LRRK2 in Zellen zu vergleichen, getaggt 3xflag LRRK1 und LRRK2 wurden in HEK293T-Zellen 15 ausgedrückt. Zellen wurden in 6-Well-Platten und mit 32 P markiert und analysiert, wie oben in dem Protokoll Text beschrieben. Abbildung 1 zeigt repräsentative Ergebnisse für die metabolische Markierung von LRRK1 und LRRK2 in HEK293T-Zellen. Radioaktiven Phosphateinbau wird sowohl LRRK1 und LRRK2 beobachtet. Nach Quantifizierung der 32

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Papier stellt eine Basisprotokoll zum Testen von allgemeinen Phosphorylierung von LRRK2 LRRK1 und in Zelllinien unter Verwendung metabolische Markierung mit 32 P-Orthophosphat. Die Gesamtstrategie ist einfach. LRRK affinitätsmarkierten Proteine ​​in HEK293T-Zellen, die einem Medium mit 32 P-Orthophosphat ausgesetzt sind, ausgedrückt. Die 32 P-Orthophosphat durch die Zellen bereits nach wenigen Stunden Inkubation und alle Moleküle in der Zelle, die Phosphate assimiliert werden dabe...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Wir sind auch dankbar, dass der Michael J. Fox Foundation unterstützt diese Studie. Wir danken der Forschungsgemeinschaft - FWO Flandern (FWO Projekt G.0666.09, Senior Researcher Stipendium für JMT), die Binnenschifffahrt SBO/80020 Projekt Neuro-TARGET, die KU Leuven (OT/08/052A und IOF-KP/07 / 001) für ihre Unterstützung. Diese Forschung wurde zum Teil auch von den Fonds-Druwé Eerdekens von der König-Baudouin-Stiftung verwaltet JMT unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Phosphor-32-Radionuklid, 1 mCi, Pufferdisnatriumphosphat in 1 ml WasserPerkin ElmerNEX011001MC
Dulbecco’ s Modifiziertes Eagle Medium (D-MEM) (1X), flüssig (hohe Glukose)Invitrogen11971-025Dieses Medium enthält keine Phosphate
Anti Flag M2 affiinty gelSigmaA2220Für ein gleichwertiges Produkt mit rotem Gel (nützlich, um die Kügelchen leichter sichtbar zu machen), verwenden Sie Kat. Nr. F2426.
Extra dicker LöschfilterBio-Rad1703965
Ponceau S LösungSigmaP7170

Referenzen

  1. Hanafusa, H. Leucine-rich repeat kinase LRRK1 regulates endosomal trafficking of the EGF receptor. Nat Commun. 2, 158(2011).
  2. Titz, B., et al. The proximal signaling network of the BCR-ABL1 oncogene shows a modular organization. Oncogene. 29, 5895-5910 (2010).
  3. Cookson, M. R. The role of leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) in Parkinson's disease. Nat Rev Neurosci. 11, 791-797 (2010).
  4. Taymans, J. M., Cookson, M. Mechanisms of dominant parkinsonism; the toxic triangle of LRRK2, alpha-synuclein and tau. Bioessays. 32, 227-235 (2010).
  5. Lewis, P. A. The function of ROCO proteins in health and disease. Biol Cell. 101, 183-191 (2009).
  6. Marin, I., van Egmond, W. N., van Haastert, P. J. The Roco protein family: a functional perspective. FASEB J. 22, 3103-3110 (2008).
  7. Marin, I. The Parkinson disease gene LRRK2: evolutionary and structural insights. Mol.Biol.Evol. 23, 2423-2433 (2006).
  8. Marin, I. Ancient origin of the Parkinson disease gene LRRK2. J Mol Evol. 67, 41-50 (2008).
  9. Lobbestael, E., Baekelandt, V., Taymans, J. M. Phosphorylation of LRRK2: from kinase to substrate. Biochem Soc Trans. 40, 1102-1110 (2012).
  10. Gloeckner, C. J., et al. Phosphopeptide Analysis Reveals Two Discrete Clusters of Phosphorylation in the N-Terminus and the Roc Domain of the Parkinson-Disease Associated Protein Kinase LRRK2. J Proteome Res. 9, 1738-1745 (2010).
  11. Nichols, R. J., et al. 14-3-3 binding to LRRK2 is disrupted by multiple Parkinson's disease-associated mutations and regulates cytoplasmic localization. Biochem J. 430, 393-404 (2010).
  12. Greggio, E., et al. Mutations in LRRK2/dardarin associated with Parkinson disease are more toxic than equivalent mutations in the homologous kinase LRRK1. J.Neurochem. 102, 93-102 (2007).
  13. Taymans, J. M. LRRK2 Kinase Activity Is Dependent on LRRK2 GTP Binding Capacity but Independent of LRRK2 GTP Binding. PLoS One. 6, 23207-23 (2011).
  14. Daniëls, V. Insight into the mode of action of the LRRK2 Y1699C pathogenic mutant. J Neurochem. 116, 304-315 (2011).
  15. Civiero, L. Biochemical characterization of highly purified leucine-rich repeat kinases 1 and 2 demonstrates formation of homodimers. PLoS One. 7, e43472(2012).
  16. Taymans, J. M., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Distribution of PINK1 and LRRK2 in rat and mouse brain. J.Neurochem. 98, 951-961 (2006).
  17. Lewis, P. A. Assaying the kinase activity of LRRK2 in vitro. J Vis Exp. , (2012).
  18. Lobbestael, E. Immunohistochemical detection of transgene expression in the brain using small epitope tags. BMC Biotechnol. 10, 16(2010).
  19. Davies, P., et al. Comprehensive Characterization and Optimization of Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Monoclonal Antibodies. Biochem J. , (2013).
  20. West, A. B. Parkinson's disease-associated mutations in LRRK2 link enhanced GTP-binding and kinase activities to neuronal toxicity. Hum.Mol.Genet. 16, 223-232 (2007).
  21. Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Sci Transl Med. 4, 164ra161(2012).
  22. Li, X., et al. Phosphorylation-dependent 14-3-3 binding to LRRK2 is impaired by common mutations of familial Parkinson's disease. PLoS One. 6, e17153(2011).
  23. Dzamko, N., et al. Inhibition of LRRK2 kinase activity leads to dephosphorylation of Ser(910)/Ser(935), disruption of 14-3-3 binding and altered cytoplasmic localization. Biochem J. 430 (910), 405-413 (2010).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tags

LRRK1LRRK2ImmunpräzipitationSDS-PAGEAutoradiographieWestern BlotHEK293T-ZellenPhosphorylierungsanalyseRadioisotopendetektion
Metabolische Markierung von Leucin Rich-Repeat-Kinasen 1 und 2 mit radioaktivem Phosphat
Kontaktieren Sie uns
Der Bibliothek empfehlen

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Urheberrecht © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.