Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Zusammenfassung

Induzierte pluripotente Stammzell (iPSC)-abgeleitete myogene Vorläufer sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapiestrategien zur Behandlung von Muskeldystrophien. Dieses Protokoll beschreibt Transplantations- und Funktionsmessungen, die erforderlich sind, um die Engraftmentierung und Differenzierung von iPSC-abgeleiteten Mesoangioblasten (eine Art von Muskelvorläufern) in Mausmodellen der akuten und chronischen Muskelregeneration zu bewerten.

Zusammenfassung

Patienten-abgeleitete iPSCs könnten eine unschätzbare Quelle von Zellen für zukünftige autologe Zelltherapieprotokolle sein. iPSC-abgeleitete myogene Stamm-/Vorläuferzellen, ähnlich wie pericyt-abgeleitete Mesoangioblasten (iPSC-abgeleitete Mesoangioblast-ähnliche Stamm-/Vorläuferzellen: IDEMs) können aus iPSCs hergestellt werden, die von Patienten generiert werden, die von verschiedenen Formen der Muskeldystrophie betroffen sind. Patientenspezifische IDEMs können mit unterschiedlichen Strategien(z.B. lentivirale Vektoren, menschliche künstliche Chromosomen) genetisch korrigiert und in ihrem myogenen Differenzierungspotenzial bei Überexpression des Myogenese-Reglers MyoD verbessert werden. Dieses myogene Potenzial wird dann in vitro mit spezifischen Differenzierungstests bewertet und durch Immunfluoreszenz analysiert. Das regenerative Potenzial von IDEMs wird in vivo,bei intramuskulärer und intraarterieller Transplantation in zwei repräsentativen Mausmodellen mit akuter und chronischer Muskelregeneration weiter evaluiert. Der Beitrag von IDEMs zum Wirtsskelettmuskel wird dann durch verschiedene Funktionstests an transplantierten Mäusen bestätigt. Insbesondere wird die Verbesserung der Motorkapazität der Tiere mit Laufbandtests untersucht. Die Zelltransplantation und -differenzierung wird dann durch eine Reihe von histologischen und immunfluoreszenz-Assays auf transplantierte Muskeln bewertet. Insgesamt beschreibt dieses Papier die Assays und Werkzeuge, die derzeit zur Bewertung der Differenzierungsfähigkeit von IDEMs eingesetzt werden, wobei der Schwerpunkt auf den Transplantationsmethoden und anschließenden Ergebnismaßnahmen zur Analyse der Wirksamkeit von Zelltransplantationen liegt.

Einleitung

Mesoangioblasten (MABs) sind gefäßassoziierte Muskelvorläufer, die aus einer Teilmenge von Pericyten^1-3abgeleitet sind. Der Hauptvorteil von MABs gegenüber kanonischen Muskelvorläufern wie Satellitenzellen⁴ liegt in ihrer Fähigkeit, die Gefäßwand zu überqueren, wenn sie intraarteriell geliefert werden, und trägt somit zur Skelettmuskelregeneration in Zelltherapieprotokollen bei. Diese Funktion wurde sowohl in murinen als auch in Canine Modellen der Muskeldystrophie^1,5,6bewertet und bestätigt. Diese präklinischen Studien haben die Grundlagen für eine klinische Erstphase-I/II-Studie auf der Grundlage einer intraarteriellen Transplantatio....

Protokoll

1. Bewertung des myogenen und Engraftment-Potenzials

1. In vitro: MyoD-induzierte Differenzierung
   1. Generieren Sie eine stabile Zelllinie von IDEMs, die mit dem tamoxifen-induzierbaren MyoD-ER lentiviralen Vektor transduziert werden und die Vielzahl der Infektionen titifizieren (MOI; z. B. 1, 5 und 50) unter Verwendung der in 1.1.9 (MyHC) beschriebenen Färbung als Ergebnis der Effizienz des Verfahrens.
   2. Eine 3,5 cm große Schale mit 1 ml 1% Matrigel beschichten und 30 min bei 37 °C bebrüten.
   3. Waschen Sie den Teller zweimal mit Medium, Samen 1 x 10⁵ MyoD-ER transduzierte IDEMs in der 3,5 cm Gewebekulturschal....

Ergebnisse

Die gemeldeten repräsentativen Ergebnisse folgen den wichtigsten In-vitro/in-vivo-Assays, die im Workflow in Abbildung 1dargestellt sind. 48 Stunden nach 4OH-tamoxifen Verabreichung MyoD-positive Kerne sind innerhalb von MyoD-ER transduced IDEMs in Kultur identifizierbar (Abbildung 2A). Die Zellen verschmelzen dann und differenzieren sich in mehrkernige Myoröhren (Abbildung 2B). Bei der intramuskulären Transplantation in ein murines Modell akuter Muskelverletzun.......

Diskussion

iPSCs können auf unbestimmte Zeit erweitert werden, wobei ihr Selbsterneuerungspotenzial erhalten bleibt und so in eine breite Palette von Zelllinien¹²differenziert werden. Aus diesem und anderen Gründen gelten iPSC-abgeleitete Stamm-/Vorläuferzellen als vielversprechende Quelle für autologe Gen- und Zelltherapieansätze¹³. Eine zuvor veröffentlichte Arbeit der Autoren berichtete über die Erzeugung von Maus- und humanen myogenen Vorläufern aus iPSCs mit einem Phänotyp, der dem von Pericyt-abgeleitete.......

Materialien

• MegaCell Dulbecco's Modified Eagle Medium (MegaCell DMEM)
• 5% fötales Rinderserum (FBS)
• 2 mM Glutamin
• 0,1 mM β-Mercaptoethanol
• 1% nichtessentielle Aminosäuren
• 5 ng/ml humaner basischer Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF)
• 100 I.E., Penicillin
• 100 mg/ml, Streptomycin

• Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)
• 10% FBS
• 2 mM Glutamin
• 0,1 mM β-Mercaptoethanol
• 1% nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA)
• 1% ITS (Insulin/Transferrin/Selen)
• 5 ng/ml Mensch bFGF
• 100 I.E. ml Penicillin
• 100 mg / ml Streptomycin
• 0,5 μ Möl- und Linolensäure
• 1,5 μ M Fe²⁺ (Fer-In-Sol)
• 0.12 μ M Fe³⁺ (Ferlixit)

• DMEM
• 20% FBS
• 2 mM Glutamin
• 5 ng/ml humanes bFGF
• 100 IE ml Penicillin
• 100 mg/ml Streptomycin

• DMEM
• 2% Pferdeserum (HS)
• 100 IE ml Penicillin
• 100 mg/ml Streptomycin
• 2 mM Glutamin

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
REAGENZIEN
MegaCell DMEM	Sigma	M3942
DMEM	Sigma	D5671
IMDM	Sigma	I3390
Pferdeserum	Euroclone	ECS0090L
Fötales Rinderserum	Lonza	DE14801F
PBS Calcium/Magnesium frei	Lonza	BE17-516F
L-Glutammin	Sigma	G7513
Penicillin/Streptomicin	Sigma	P0781
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010
ITS (Insulin-Transferrin-Selen)	Gibco	51500-056
Nichtessentielle Aminosäurelösung	Sigma	M7145
Fer-In-Sol	Mead Johnson
Ferlixit	Aventis
Ölsäure	Sigma	01257-10 mg
Linolsäure	Sigma	L5900-10 mg
Mensch bFGF	Gibco	AA 10-155
Anbaufaktoren reduziert Matrigel	Becton Dickinson	356230
Trypsin	Sigma	T3924
Natriumheparin	Mayne Pharma
Trypanblau-Lösung	Sigma	T8154	SCHÄDLICH
Patentblauer Farbstoff	Sigma	19, 821-8
EDTA	Sigma	E-4884
Paraformaldehyd	TAAB	P001	SCHÄDLICH
Tamoxifen	Sigma	T5648
4-OH Tamoxifen	Sigma	H7904
pLv-CMV-MyoD-ER(T)	Addgen	26809
Cardiotoxin	Sigma	C9759	SCHÄDLICHES
Povidon-Jod
Tragachant Kaugummi	MP Biomedicals	104792
Isopenthan	VWR	24.872.323
Tissue-tek OCT	Sakura	4583
Saccharose	VWR	27.480.294
Objektträger aus polarisiertem Glas	Thermo	J1800AMNZ
Eosin Y	Sigma	E4382
Hämatoxylin	Sigma	HHS32
Masson's Trichrome	Bio-Optica	04-010802
Maus Anti Myosin Schwerkette Antikörper	DSHB	MF20
Maus Anti Lamin A/C Antikörper	Novocastra	NLC-LAM-A/C
Hoechst 33342	Sigma Fluka	B2261
Kaninchen Anti Laminin Antikörper	Sigma	L9393
MATERIALIEN UND AUSRÜSTUNG
>Adsorbierbares antibakterielles Nahtmaterial 4-0	Ethicon	vcp310h
30 G Nadelspritze	BD	324826
Laufband	Columbus Instrument
Steromikroskop	Nikon	SMZ800
Inverses Mikroskop	Leica	DMIL LED
Isofluran-Einheit	Harvad Apparatus
Glasfaser	Euromecs (Holland)	EK1
Heizkissen	Vet Tech	C17A1
Skalpelle	Swann-Morton	11REF050
Chirurgische Zange	Fine Scientific Tools		5/45
Hochtemperatur-Kauterisator	Bovie Medical	AA01
MEDIA COMPOSITION<
Tabelle 1. Liste der Reagenzien, Materialien, Geräte und Medien.

td colspan="4">Die Zusammensetzung des Mediums ist unten aufgeführt. HIDEMs Wachstumsmedium: Alternativ, wenn einige der oben genannten Reagenzien nicht verfügbar sind, können HIDEMs gezüchtet werden in: MIDEMs Wachstumsmedium: Differenzierungsmedium: