Eine Minute, Sub-One-Watt-Photothermische Tumor Ablation mit Porphysomes, Eigen Multifunktionale Nanovesicles

Zusammenfassung

Wir entwickelten neuartigen multifunktionalen Eigen nanovesicles porphysomes genannt, die strukturabhängigen Fluoreszenz Selbstlöschung und einzigartigen photothermischen Eigenschaften haben, so als potente photothermische Therapie Mittel. Wir formuliert porphysomes mit Hochdruckextrusion und untersucht ihre photothermische Therapie Wirksamkeit in einem Xenotransplantat-Tumor-Modell.

Zusammenfassung

Wir haben vor kurzem porphysomes als eigen multifunktionale nanovesicles entwickelt. Ein Photosensibilisator, Pyropheophorbid α, wurde zu einer Phospholipid-konjugiert und Liposomen-wie kugelförmige Vesikel dann selbst zusammengebaut. Durch die extrem hohe Dichte von Porphyrin im Porphyrin-Lipid-Doppelschicht erzeugt porphysomes großen Extinktionskoeffizienten, Struktur-abhängige Fluoreszenz Selbstlöschung und ausgezeichnete photothermische Wirksamkeit. In unserer Formulierung wurden porphysomes mit Hochdruckextrusion hergestellt und zeigte eine mittlere Teilchengröße ca. 120 nm auf. Vierundzwanzig Stunden nach der intravenösen Injektion von porphysomes, die lokale Temperatur des Tumors schnell auf 1 Minute Belichtung von 750 mW (1,18 W / cm ^2), 671 nm-Laser-Bestrahlung erhöhte sich von 30 ° C bis 62 ° C. Nach der vollständigen thermischen Ablation des Tumors, Schorf gebildet und heilte innerhalb von 2 Wochen, während in den Kontrollgruppen die Tumoren weiter zu wachsen und alle erreichten das definierte end Punkt innerhalb 3 Wochen. Diese Daten zeigen, wie porphysomes können als starke photothermische Therapie (PTT)-Mittel verwendet werden.

Einleitung

Porphysomes sind neuartige multifunktionale nanovesicles, die wir vor kurzem entwickelt, die in der Lage, multimodale Bildgebung und Therapie ¹ sind. Sie werden aus selbstorganisierten Porphyrin-Doppelschichten gebildet und enthalten eine extrem hohe Dichte von Porphyrin (über 83 000/porphysome Partikel), die große Extinktionskoeffizienten und die Ergebnisse in einzigartigen Struktur-abhängige Fluoreszenz Selbstabschreckung erzeugt. Porphysomes haben gute in-vivo-Pharmakokinetik und Bioverteilungseigenschaften: sie zeigen eine Bluthalbwertszeit von 12 Stunden folgende systematische Verwaltung und passiv sammeln sich in Xenotransplantattumoren mit 7,5% ID / g bei 24 Stunden nach der Injektion ^2.

Ihre einzigartige Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften machen porphysome ein guter Kandidat für die multimodale Bildgebung und bildgeführte Therapie. Zuallererst Porphyrin enthalten, sind porphysomes eigen für Fluoreszenz-Bildgebung von Tumoren auf die Tumorakkumulation ^1.Darüber hinaus hat jedes Porphyrin ein stabiles Chelat-Website für Radioisotope können daher leicht porphysomes mit Radioisotopen wie etwa 64Cu für PET-Bildgebung ³ gekennzeichnet werden. Darüber hinaus wird die absorbierte Lichtenergie thermisch unter Laserbestrahlung Exposition abgeführt, wenn porphysome Struktur ist intakt, so porphysomes einzigartigen photoakustische Bildgebung und PTT-Funktionen zeigen auch. Es hat sich gezeigt, dass 24 h nach der intravenösen Injektion von porphysomes, Laserbestrahlung des porphysome-Tumor akkumuliert wurde, eine schnelle Temperaturerhöhung und starke photothermische Tumor Ablation. Dies zeigte, dass porphysomes sind effiziente photothermische Verstärker mit Extinktionskoeffizienten so hoch wie Gold-Nanopartikel (AuNPs) ^ein. Auf der anderen Seite, im Vergleich mit anderen anorganischen photothermische Mittel, einschließlich AuNPs, porphysomes zeigen eine herausragende Vorteil in der biologischen Sicherheit aufgrund ihrer organischen Natur. Porphysomes enzymatisch biologisch abbaubar und induzieren minimale akute toxicity in Mäusen mit intravenösen Dosen bis zu 1000 mg / kg ^1. Außerdem ähnlich Liposomen, die große wässrigen Kern porphysomes könnte passiv oder aktiv mit therapeutischen oder Kontrastmittel geladen. Die optischen Eigenschaften und Biokompatibilität von porphysomes zeigen die multimodale Potenzial organischer Nanopartikel für Biophotonik Bildgebung und Therapie.

In diesem Papier präsentieren wir die Synthese Verfahren Pyropheophorbid-Lipid-Konjugate, die Herstellung und die Charakterisierung Verfahren porphysomes mit Hochdruckextrusion. PTT In vivo an Mäusen ist ebenfalls durchgeführt, um die Effizienz der porphysome PTT-fähigen im Tumor zeigen, Behandlung mit einer subkutanen Xenograft-Tumormodell.

Protokoll

1. Synthese von Pyropheophorbid-Lipid

1. Kombinieren 200 mmol Pyrophäophorbid (von Spirulina Pacifica Algen hergestellt, wie zuvor beschrieben;... Zheng et al, Bioconj Chem 2002, 13 -392) ^4, 98,7 mg 16.00 lysophophatidylcholine (1-Palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero -3-phosphocholin, Avanti Polar Lipids # 855675), 76,3 mg EDC, 48,7 mg DMAP (4 - (Dimethylamino) pyridin) in 5 ml Amylen stabilisiertem Chloroform für ein Verhältnis von 1:1:2:2 Pyro: Lipid: EDC DMPA.
2. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur unter Argon 24 Stunden. Verdampfe das Chloroform unter vermindertem Druck mit einem Rotationsverdampfer unter Erwärmen auf 40 ° C. Die Mischung aus pyro-Lipid-Isomeren (pyro an der sn-1 oder sn-2-Position gebunden ist) erzeugt wird.
3. Resuspendieren pyro-Lipid-Isomerengemisch in 1 mM CaCl _2, 50 mM Tris (pH 8), 0,5% Triton X-100 und 10% Methanol in einer Konzentration von 5 mg / ml. In Phospholipase A2 (PLA2) aus Honig Bienengift bei0,1 mg / ml Konzentration und Inkubation der Lösung bei 37 ° C für 24 h bis sn-1-pyro-Lipid verdauen und um die reine sn-2-pyro-Lipid-Isomer zu produzieren.
4. Fügen Sie zusätzliche 2 Volumen Chloroform und 1,25 Vol. Methanol-Extrakt, und dann das Lösemittel am Rotationsverdampfer bei vermindertem Druck bei 40 ° C Resuspendieren Sie das Spaltprodukt in 1% MeOH in DCM und Reinigung über eine kleine Diol Silica-Säule für die isomerenreine pyro-Lipid.

2. Vorbereitung der Porphysomes

1. Auflösen Pyropheophorbid-Lipid Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-methoxy (polyethylenglykol) (PEG-2000-PE) und Cholesterin in Chloroform getrennt, und zeichnen die Konzentrationen sind.
2. Bereiten porphysome Lipidfilm in einem 12x75 mm Borosilikatglas Reagenzglas mit einem Gesamtlipidgewicht von 5 mg / Rohr durch die Kombination von 65 Mol% Porphyrin-Lipid-, 5 mol% PEG-PE-2000 und 30 Mol-% Cholesterin.
3. Trocknen der Lipidfilme unter einem Strom von NitroStoffgas und lassen Sie sie weiter unter Vakuum für 1 Stunde getrocknet. Speichern die Lipidfilme bei -20 ° C unter Argon bis zur Zukunft Hydratation und Extrusion.
4. 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM Phosphat, pH 7,4) zu jeder Lipidfilm Rohr. Einfrieren der Teströhrchen in flüssigen Stickstoff, bis sie vollständig gefroren, aufgetaut und dann das Rohr in 65 ° C Wasserbad, bis die Probe alle geschmolzen. Wirbel das Rohr für insgesamt 30 Sekunden (3x an jeder 10 sec, mit 5 sec Wiedererwärmung in 65 ° C-Wasserbad zwischen jedem Vortexen).
5. Wiederholen Sie den Frost-Tau-5 Zyklen oder mehr bei Bedarf, bis keine großen Aggregate im hydrierten Lösung beobachtet werden. Verlassen Sie die porphysome Suspension auf Eis, wenn Sie fertig.
6. Montieren Sie den Hochdruck-Extruder (10 ml) mit zwei gestapelte 100 nm Polycarbonatfilter zu einem thermostatisierten Zirkulator für 65 ° C zirkulierenden Wasserbad installiert in. Schließen Sie die thermobarrel Extruder, und schließen Sie das Extrudersystem zu einem Stickstofftank für Hochdrucksicher Versorgung.
7. Übertragen Sie die porphysome Suspension auf die Extruderkammer mit einem 9-Zoll-Glas-Transferpipette. Stellen Sie den Druck, indem Sie den Regler an der Stickstofftank Regler, bis ein Lese zwischen 200 und 300 psig wird als Anfangsextrusionsdruck beobachtet. Öffnen des Ventils des Druckreglers schrittweise bis ausreichend porphysome Strömungsrate erzielt wird oder ein Maximum von 800 psig (5.440 kPa) Druck erreicht ist.
8. Nachdem die erste Extrusions Pass abgeschlossen ist, schließen Sie die Druckregelventil und den Druck des Extruders durch Öffnen der Druckentlastungsventil am Extruder Spitze. Nachfüllen des Extruders mit der frisch extrudierten porphysome Lösung und wiederholen die Extrusion für mindestens 10 Mal, um sicherzustellen, dass die endgültige extrudierte Lösung homogen ist.
9. Bestimmung der Konzentration des endgültigen porphysome Lösung durch Messung der Absorption einer verdünnten Probe in Methanol durch UV-Vis-Spektrometer. Berechnen Sie die Konzentration mit Hilfe der folgenden Gleichung Witzh der Extinktionskoeffizient 97.000 M ^-1 cm ^-1 bei 410 nm für Pyropheophorbid-Lipid.

10. Messen Sie die endgültige Größe Verteilung der porphysomes mit einem Malvern Zetasizer ZS90 durch dynamische Lichtstreuung. Verdünnen porphysome Lösung in PBS und führen drei Messungen mit jeweils 15 läuft für die gemittelten Ergebnisse.
11. Bestimmung der Fluoreszenzlöschung porphysome durch Vergleich der Fluoreszenzemission des abgeschreckten porphysome (1 mM in PBS) und nicht abgeschreckte porphysome (1 mM in 1% Triton X-100) unter Verwendung Spektrofluorometer. Nehmen Sie die Spektren vor und nach der Reinigungsmittel (Tirton X-100) hinzugefügt wird, und normalisieren das Signal zu lesen, um maximalen Fluoreszenz. Stellen Sie die Erregung bis 410 nm und Emissionswellenlängenbereich von 600-800 nm zu sein.
12. Halten porphysomes Lösung unter Argon bei 4 ° C bis zukünftige Verwendung, und schützen Sie es vor Licht durch Aluminium fÖl.

3. Herstellung von Tier Xenograft Modell

1. Kultur die KB-Zellen in RPMI-1640 (mit 10% FBS) und die Sustain-Zellen in 5% CO ₂ und befeuchteter Atmosphäre bei 37 ° C.
2. Ernte-KB-Zellen unter Verwendung von Standard-Zellkulturtechnik. Halten der Zellsuspension (20000 Zellen / ml) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) auf Eis für kurzfristige Lagerung bis zum Zeitpunkt der Injektion.
3. Bereiten Sie eine KB Xenografts auf Nacktmäusen. Bestrahlte LM-485:;: Nackte Mäuse von Charles River Laboratories, wenn sie 20 g (Kategorie # CRL NU (NCR)-Foxn1 ^nu, 6-7 Wochen alt) Diät, da Standard-Diät und Bettzeug (Harlan Laboratories # 7912; Schlafmöglichkeiten: Maiskolben-Bettwäsche, ¼ ", # 7097). Sterilisieren Sie alle Tier-Handling-Werkzeugen (Spritze, Pinzetten, Tier-und Pad) vor Experimenten. Betäuben Mäuse mit 2% Isofluran v / v in 100% Sauerstoff-Trägergas. Alle Tier Protokolle werden von der Institution (University Health Ne genehmigttwork in diesem Fall) Tierpflege und Verwendung Ausschusses.
4. Injizieren Tumorzellen subkutan in PBS an die rechte Flanke der Mäuse suspendiert. Mäuse sind bereit, nach 10 Tagen verwendet werden, wenn Tumordurchmesser von 4-5 mm und eine Dicke von 2-3 mm erreicht.

4. In-vivo-Photothermische Therapie

1. Inject porphysomes (mit 750 nmol pyro bei 200 ul Volumen) intravenös über die Schwanzvene. Führen Laserbestrahlung 24 Stunden nach der Injektion von porphysomes.
2. In diesem Abschnitt führen alle Verfahren in einem geschlossenen Laserschutzraum. Laserschutzbrillen tragen während der Laserbestrahlung.
3. Stellen Sie den Laserbestrahlungsgeräte. Halten Sie die Laserfaser und einen Diffusor mit einer Klammer auf einem Ständer. Stellen Sie die Laserleistung auf niedrigem Niveau, und schalten Sie den Laser. Stellen Sie die Höhe der Laserfaser, eine Bestrahlungsfläche von 9 mm im Durchmesser erreichen (DPSS-Laser, LaserGlow Technologies, Toronto, Kanada), kalibrieren die Laserleistung von 750 mW (1,18 W / cm ²⁾ mit apower Meter an und schalten Sie den Laser, um die Tiere vor.
4. Anesthetize die Tiere mit 2% Isofluran v / v in 100% Sauerstoff Trägergas durch Nasenkegel offensichtlich kein Abfangen von Isofluran eine Gefährdung der menschlichen Gesundheit Gefahr). Bestätigen Sie, dass das Tier tief genug durch Ausführen einer Prise Zeh mit einer Pinzette oder den Fingern Hinterpfoten Tier betäubt. Die Tiere sind bereit für Laserbestrahlung, wenn sie nicht mehr auf dieses Verfahrens sind.
5. Überwachen Sie die Temperatur Tumor durch eine Infrarot-Wärmebildkamera (Mikroshot, LumaSense Technologies). Legen Sie die Kamera in der Nähe des Tumors, konzentrieren sie gut und nehmen eine vorge PTT Bild sowie eine regelmäßige Weißlichtbild vor PTT Bestrahlung beginnt.
6. Schalten Sie den Laser wieder zu 750 mW und erhöhen die Lichtleistung. Positionieren Sie den Tumor in der Mitte des Laserstrahls auf der Tumor vollständig abgedeckt zu bekommen, und die Startzeitbestrahlung. Nehmen Sie die Tumortemperatur Bild alle 5 Sekunden eine Minute Laserbehandlung. Schalten Sie den Laser bei 1 min. Stop die Gaszufuhr von 2% Isofluran, bis das Tier aus der Narkose erholt warten und ihn wieder in den Käfig.
7. Halten Mäusen bei Normothermie Tierraum unter 0.12 h dunkel und Licht-Zyklus nach von der University Health Network genehmigten Tier Protokolle. Inject Buprenorphin (0,05 mg / kg, subkutan zweimal am Tag für eine Woche nach der Laserbestrahlung, um die Schmerzen von der Narbe zu reduzieren. Alle zwei Tagen, sind die Tumordurchmesser mit einer Schieblehre und ein Foto. Berechnen Sie das Tumorvolumen mit Hilfe der folgende Gleichung: V = π / 6 · a · b ^2, wobei a der Längsdurchmesser, und b der kurzen.
8. Opfere die Tiere, indem sie in CO _2-Kammer, wenn der lange Durchmesser des Tumors erreicht 10 mm, wie es der definierten Endpunkt in unserem Labor. Führen Genickbruch nach dem CO2-Behandlung. Zeichnen Sie die Überlebenskurve.

Ergebnisse

Pyrophäophorbid ist mit dem Phospholipid als stabile Lipid-Monomer (1a) konjugiert und die Konjugate durch Selbstorganisation zu porphysomes durch Membranextrusionsverfahren zu bilden, das eine Hochdruck-Extruder. Es ist normalerweise schwierig, porphysome-Lipid-Suspension in den ersten 3 Zyklen der Extrusion mit relativ langsamen Fließgeschwindigkeit zu extrudieren. Als weitere Extrusionen werden wiederholt, die Strömungsgeschwindigkeit der extrudierten Lösung allmählich erhöht, und der Druck kann bei ...

Diskussion

Bei der Entwicklung von Drug-Delivery-Technologien, sind multifunktionelle Nanopartikel derzeit in weiten Untersuchungen für eine genaue Überwachung der Drug-Delivery-Fahrzeug unter Beibehaltung einer hohen Wirkstoff Nutzlast. Porphyrin beladene Liposomen wurden zur besseren pharmakokinetischen Eigenschaften und effiziente Lieferung als direkte Verabreichung von Porphyrin entwickelt worden, aber Hindernisse vorhanden sind, einschließlich der begrenzten Beladungsmenge von Porphyrin und schnelle Verteilung von Liposomen v...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Rotationsverdampfer	Thermo-Savant	SPD131DDA
Votex	Scientific Industries	SI-0236	Modellnummer: G560
Hochdruckextruder	LIPEX, Northern Lipids Inc.	T.001	10 ml Thermobarrel Extruder
Zirkulatoren mit beheiztem Bad (thermostatisierter Zirkulator)	Thermo SCIENTIFIC	SC100-S5P
Polycarbonat-Filter	Avanti Polare Lipide	610005	Porengröße 100 nm und Membrandurchmesser 19 mm
Zetasizer	Malvern Instruments	ZS90
UV/sichtbares Spektralphototmeter	Varian Deutschland	Cary 50 Bio UV/ Visible Spektralphotometer
Spektrofluorometer	HORIBA Scientific	FluoroMax-4
Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)	Hitachi	H-7000
Zellkultur-Inkubator	SANYO	MCO-18AIC
Powermeter	Thorlabs	PM100D	mit Sensor S142C
671nm Laser	LaserGlow Technologies	LRS-0671_PFN-02000-05	S/N:10097270
Infrarot-Thermometer	Mikroshot, LUMASENSE Technologies	9102409
Laserschutzbrille	LaserGlow Technologies	AGF6602XX	Optische Dichte: 1,5+ bei 630-700 nm