Ganze Berge Immunfluoreszenzfärbung der Neonatal Maus Retina zu untersuchen Angiogenese<em&gt; In vivo</em

Zusammenfassung

Die Neugeborenen Mausretina bietet eine gut charakterisiert physiologisches Modell der Angiogenese, die Untersuchungen der Rolle der verschiedenen Gene oder Medikamente, die Angiogenese modulieren in eine erlaubt In vivo Kontext. Immunfluoreszenzfärbung genau visualisieren die Gefäßplexus ist entscheidend für den Erfolg dieser Art von Studien.

Zusammenfassung

Angiogenese ist der komplexe Prozess der Bildung neuer Blutgefäße durch die Sprossen neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle nicht nur in der normalen Entwicklung von Organen und Geweben, sondern auch in vielen Krankheiten, bei denen die Bildung von Blutgefäßen ist dysregulated, wie Krebs, Blindheit und ischämischen Erkrankungen. Im Erwachsenenalter sind die Blutgefäße in der Regel Ruhestrom so Angiogenese ist ein wichtiges Ziel für neuartige Medikamentenentwicklung zu versuchen und zu regulieren Gefäßneubildung gezielt in Krankheit. Um besser zu verstehen, Angiogenese und geeignete Strategien zu regulieren entwickeln werden Modelle benötigt, die genau die verschiedenen biologischen Schritte, die beteiligt sind. Die Maus Neugeborenen Netzhaut bietet ein hervorragendes Modell der Angiogenese, weil Arterien, Venen und Kapillaren zu entwickeln, um eine Gefäßplexus während der ersten Woche nach der Geburt bilden. Dieses Modell hat auch den Vorteil, dass ein zwei-didimensionale (2D)-Struktur-Analyse machen einfach im Vergleich mit der komplexen 3D-Anatomie der anderen vaskulären Netzwerken. Durch die Analyse der retinalen Gefäßplexus zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Geburt, ist es möglich, die verschiedenen Phasen der Angiogenese unter dem Mikroskop zu beobachten. Dieser Artikel beschreibt eine einfaches Verfahren zur Analyse des Gefäßsystems einer Maus Netzhaut unter Verwendung von fluoreszierenden Färbung mit isolectin und vaskuläre spezifische Antikörper.

Einleitung

Die Angiogenese ist ein komplexer Entwicklungsprozess durch die Bildung neuer Blutgefäße aus einem bereits existierenden Schiffes Netzwerk definiert und ist durch mehrere Signalwege reguliert. Der prominenteste von ihnen ist der VEGF-Weg. VEGF wird von ischämischen Zellen und führt zur Einleitung der Angiogenese sprießen in benachbarte Blutgefäße freigesetzt. Die führende Endothelzellen aus einer neuen vaskulären Spross ist eine "Spitze" Zelle, die filopodia dass erreichen, in Richtung der Quelle von VEGF erzeugt und wird durch proliferierende "Stiel" Endothelzellen gefolgt. Auf diese Weise aktivierten Endothelzellen migrieren und proliferieren zu einer avaskuläre Region, wo sie neue Gefäßrohren bilden. Um diese Rohre zu stabilisieren, um den Blutfluss zu unterstützen, interagieren Endothelzellen mit Perizyten und glatte Muskelzellen, die die neuen Blutgefäße ¹ umgeben. Angiogenese ist für die Vaskularisierung des Embryos und wachsende Gewebe. Allerdings trägt es auch zu vielen pathologischencal Erkrankungen wie Krebs, während Mängel in der Angiogenese mit ischämischen Erkrankungen. Die Entwicklung effektiver medikamentöser Behandlung, die Angiogenese als Mittel zur Behandlung von Krankheiten zu regulieren ist daher von großem Interesse. Zum Beispiel wird eine wirksame anti-angiogenen Faktoren reduzieren Krebswachstum, während proangiogene Strategien verwendet werden, um Ischämie zu behandeln. Somit sind Modelle der Angiogenese wichtig, ein besseres Verständnis der Regulation der Gefäßneubildung und für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zu erhöhen oder zu verringern vaskulären Wachstum.

Ein grundlegendes Element der Angiogenese Forschung ist die Wahl eines geeigneten Gefäß-Modell. Viele in vitro Modelle wurden entwickelt, um die grundlegenden Schritte der Angiogenese wie endotheliale Zellmigration, Proliferation und das Überleben ^2,3 reproduzieren. Ein häufig in vitro-Assay verwendet wird, ist die Bildung eines verzweigten Netzes von Endothelzellen auf Matrigel Matrix, obwohl tsein ist nicht spezifisch für Endothelzellen, noch übernimmt sie in der Regel übernehmen die Unterstützung von Perizyten oder glatten Muskelzellen. Beurteilung der ex vivo Keimung Angiogenese mit Maus Orgelkultur wie Embryoidkörper Assay, der Aortenring-Assay und der fötalen Mittelfußknochen Assay erlaubt die Analyse von Angiogenese von Endothelzellen im Zusammenhang mit zusätzlichen Stützzellen. Allerdings sind die wichtigsten Einschränkungen dieser Assays die mangelnde Durchblutung und die Regression von Gefäßen im Laufe der Zeit, so dass eine begrenzte Fenster für die Analyse. Deshalb, um die Regulation der Angiogenese genauer zu verstehen, werden in-vivo-Modelle, wie sie in der Maus mit subkutan implantierten Schwämmen oder Matrigel Stecker entwickelt erforderlich, sowie die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell. Allerdings sind diese Modelle schwierig zu analysieren aufgrund der komplexen 3D-Architektur der neovessels. Im Gegensatz dazu hat der Zebrafisch ein ausgezeichnetes Modell für die Visualisierung der Angiogenese in der ganzen bewährt⁴ Organismus. Allerdings ist die Maus evolutionär sehr viel enger als die menschliche Zebrafisch verwandt, um die Maus ein bevorzugtes Modell in vielen Fällen. Folglich Angiogenese der postnatalen Maus Netzhaut stellt eine gut charakterisierte Methode der Wahl für die Angiogenese Forschung. Sie ermöglicht nicht nur eine physiologische Umgebung, sondern auch ein 2D Gefäßplexus, die leicht sichtbar gemacht werden können unter Verwendung von geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen. Die Architektur des Schiffes Netzwerk Endothelproliferation, sprießen, perivaskuläre Zellrekrutierung und Gefäß Umbau kann allen untersuchten mit dieser Technik werden.

In der Neugeborenen-Maus Netzhaut tritt Entwicklung der Blutgefäße der Netzhaut in der ersten Woche der postnatalen Leben. Mäuse, im Gegensatz zum Menschen, der blind geboren werden und die Netzhaut nur vascularized werden nach der Geburt. Retinal Schiffe ergeben sich aus der Mitte der Netzhaut in der Nähe des Sehnervs bei postnatalen Tag 0 (P0) und die Entwicklung von Angiogenese zur Bildung eines sehr anzuordnen,d Gefäßplexus, die Netzhautperipherie erreicht um etwa ⁵ P8. Blutgefäßen entwickeln in charakteristischer Weise mit der Kapillarplexus allmählich und ausgehend von der optischen Platte in Richtung der Peripherie ein regelmäßiges alternierendes Muster von Arterien und Venen mit einem dazwischen kapillares Netzwerk zu erzeugen. Das retinale Gefäßsystem ein ideales Modellsystem, um die Angiogenese als die Gefäße leicht identifiziert werden, da sie, was im Wesentlichen in einer 2D-Ebene wachsen zu untersuchen, wodurch es relativ einfach, die retinalen Gefäße in flach-mount Zubereitungen ⁵ untersuchen. Verfahren zur Isolierung der Maus Neugeborenen Netzhaut zur Analyse der endothelialen Zell-Antworten Spitze über mehrere Stunden ex vivo wurde ⁶ gemeldet. Alternativ erfordert eine genauere Untersuchung des gesamten Gefäßsystems der Netzhaut und damit verbundene vaskuläre Marker Immunfärbung von festen Proben Netzhaut in verschiedenen Stadien der Entwicklung.

Hier bieten wir Ihneneine detaillierte Beschreibung eines zuverlässigen und technisch geradlinig Methode, die wir verwenden für whole mount Färbung des murinen retinalen vaskulären Plexus, von der ersten Enukleation der postnatalen Auge (siehe auch ⁷⁾ durch die Färbeprotokolle zur endgültigen Bildgebung unter dem Mikroskop.

Protokoll

Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nicht anders angegeben.

1. Enukleation und Fixierung der Augen Postnatale

1. Zeigen human getötet Maus Welpe auf seiner Seite, entfernen Sie die Haut über dem Auge mit einer Schere.
2. Mit einer Schere und Pinzette, um das Auge entkernen.
3. Platz Schere unter dem entkernten Auge, schneiden Sie den Sehnerv und das umgebende Gewebe und heben Sie die Augen. In einen 24-Well-Platte mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in 2x PBS bei Raumtemperatur durchgeführt.
4. Lassen Sie jedes Auge für 10 fix - 15 min, dann kalt 2x PBS auf Eis übertragen für 5 - 10 min. Am besten ist es Enukleationen und anschließende Fixierung staffeln, um sicherzustellen, der Grad der Fixierung ist gleich für jedes Auge.

2. Dissektion Postnatale Murine Retinas

1. Transfer-Augen in eine Petrischale mit 2x PBS mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung und unter einer disse erweiternfesselndes Mikroskop.
2. Entfernen Sie das Fett um die Augen mit einer Pinzette und Schere.
3. Pierce der Rand der Hornhaut mit einer scharfen Schere und schneiden rund um die Hornhaut und Iris und entsorgen.
4. Legen Zange zwischen Netzhaut und Lederhaut und entfernen Sie die Lederhaut kümmert sich nicht um die Netzhaut zu reißen. Die Aderhaut Schicht kann auch entfernt werden, aber, wenn es die Gefahr einer Schädigung der Netzhaut, die während dieser Stufe wird die Aderhaut kann wie es sich nicht signifikant auf die Qualität der Immunfärbung gelassen werden.
5. Entfernen Sie die Linse und den Glaskörper mit einer Pinzette.
6. Entfernen Sie die hyaloids Schiffe durch das Sammeln von ihnen zusammen in der Mitte des Auges mit feinen Pinzette dann schnell ziehen weg von der Mitte der Netzhaut (alternativ snip an der Basis der hyaloid Schiffe mit einer feinen Schere).
7. Spülen Sie die schalenförmigen Netzhaut mit PBS in einer sauberen Petrischale.
8. Stellen 4 bis 5 radiale Einschnitte erreicht etwa 2/3 des Radius der Netzhaut durch Federkraft scissors zur Schaffung eines "Blütenblatt" Form.
9. Abziehen PBS mit einer Pasteurpipette auf die Netzhaut zu glätten, und dann entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem kleinen Stück Löschpapier.
10. Langsam Pipette Kälte (-20 ° C) Methanol tropfenweise auf die Oberfläche der Netzhaut bis völlig bedeckt und dann mit zusätzlichen Flut Methanol. Dies wird dazu beitragen, um die Netzhaut zu fixieren und Permeabilisierung erleichtern. Die Netzhaut wird weiß.
11. Transfer zu einem 2-ml-Röhrchen mit einem Kunststoff-Pasteurpipette, das ausgeschnitten wurde, um die Bohrung zu erweitern.
12. Lassen Netzhaut in kaltem Methanol für mindestens 20 min, bevor Sie mit Immunfärbung. Von den Antikörpern verwendet hier nur VE-Cadherin nicht erfolgreich auf Methanol festen Netzhaut verwendet werden. In diesem Fall Netzhaut müssen gerade gehen Immunfärbung nach Schritt 9.
13. Falls erforderlich, kann Netzhaut in Methanol bei -20 ° C gelagert werden für bis zu mehrere Monate vor dem Färben.

3. Immuno / isolectin Färbung des Retinal Vascuschaftsgesetzgeber

1. Entfernen Sie vorsichtig / Methanol abgießen und vorsichtig abspülen Netzhaut kurz in PBS (in diesem Stadium die Netzhaut ist immer noch in der gleichen 2-ml-Röhrchen aus Schritt 11 oben).
2. PBS entfernen und Deckel Netzhaut mit 100 ul Perm / Blocks-Lösung (PBS + 0,3% + 0,2% Triton BSA) + 5% des entsprechenden Serums (siehe Tabelle 1) und leicht schütteln für 1 Stunde.
3. Entfernen Perm / Sperren und Inkubation Netzhaut unter leichtem Schütteln über Nacht bei 4 ° C mit 100 ul ausgewählten Primärantikörper (siehe Tabelle 1) und / oder IsolectinB4, alle durch Verdünnen in Perm / Blocks vorbereitet.
4. Entfernen Antikörper / isolectin und waschen Netzhaut 4 x 10 min in PBS + 0,3% Triton (PBSTX).
5. In einigen Fällen, z. B. nach einer Färbung mit IsolectinB4-Alexa488 oder einem direkt konjugierten primären Antikörper, einen sekundären Antikörper, nicht erforderlich, und Netzhaut kann direkt angebracht werden (Schritt 7). Bei einem nicht konjugierten primären Antikörper in Schritt 3 verwendet wurde, dann wurden 100 ul der entsprechenden fluorescent sekundären Antikörper (verdünnt 1/200 in PBSTX) zugegeben und links nach Inkubation bei 4 ° C oder für 4 h bei Raumtemperatur über Nacht.
6. Entfernen sekundären Antikörper und waschen Netzhaut 4 x 15 min in 2 ml PBSTX.
7. Übertragen Netzhaut auf Objektträger mit einem breiten Bohrung Kunststoff Pasteurpipette und entfernen Sie überschüssiges PBSTX mit saugfähigen Gewebe. Berg Netzhaut durch Zugabe von 50 ul verlängern Deckfluessigkeit auf einem Deckglas und sanft Position über die Netzhaut.
8. Die Objektträger zu Kühlschrank über Nacht bei 4 ° C, so dass sie flach und vor Licht geschützt sind, damit das Verlängern Deckfluessigkeit eingestellt.
9. Bild Netzhaut mit einem konfokalen Mikroskop oder eine Epifluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse

Nach Präparation der Netzhaut sollte wie eine flache Blume (Abbildung 1) zu suchen. Durch die Verwendung des Protokolls skizzierten können Endothelzellen gesehen mit isolectin B4-Alexa488 Färbung und Unterstützung vaskulären Muskelzellen visualisiert mit anti-alpha Glattmuskelaktin (Abbildung 2). Die Low-Power-Ansicht mit einem 5X Ziel in 2 ermöglicht einen Überblick über das vaskuläre Organisation der Netzhaut. Auch indem Sie eine andere Kombination von Antikörpern in ...

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, Bilder von gefärbten whole mount Präparaten von Neugeborenen Maus Netzhaut zu erhalten, so dass es eine leicht quantifizierbar und physiologisch relevanten Modell der Angiogenese. Zunächst wird die Maus Auge kann es ziemlich schwierig zu sezieren aufgrund seiner geringen Größe und Kugelform, so dass einige der Praxis und gute Dissektion Werkzeuge für zuverlässige Ergebnisse erforderlich sind. Präparation der Augen in 2x Konzentration PBS herg...

Materialien

Reagenzien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Material
Pipetten aus Kunststoff 3 ml	Wissenschaftliches Laborzubehör	PIP4210	Spitze mit einer Schere entfernen, um eine
BD Falcon 24-Well-Platten	Wissenschaftliches Laborzubehör	353226
ausgewählte Petrischalen TV 90 mm	Wissenschaftliches Laborzubehör	SLS2002
Histobond-Objektträger	VWR	631-0624
Deckgläser 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Pinzette #5	World Präzisionsinstrumente	14095
Federschere 10,5 cm lang, mit geraden 8 mm Klingen	World Präzisionsinstrumente	501235	Für die Enukleation
Vannas Schere 8,5 cm lang, mit geraden 7 mm Klingen und 0,025 x 0,015 mm superfeinen Spitzen	World precision instruments	500086	Wird zum Präzieren der Netzhaut
verwendet Superfeine Vannas-Schere 8 cm lang mit geraden 3 mm Klingen und 0,015 x 0,015 mm superfeinen Spitzen World precision instruments		501778	Wird zum Präparieren von
kristallklaren’ Röhren der Netzhaut verwendet 2 ml	Starlab	E1420-2000<
Natriumphosphat zweibasisches		Sigma S0876	PBS-Reagenz
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma	P5655	PBS-Reagenz
Natriumchlorid	Sigma	S9625	PBS-Reagenz
Paraformaldehyd	Sigma	P6148	In 2x PBS auffüllen und bei -20 ° lagern; C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Eselsserum	Sigma	D9663
Ziegenserum	Vector	S-1000
Prolong Gold Anti-Fade-Reagenz	Invitrogen	P36930	Eindeckreagenz
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Verwendung bei 1:200 Verdünnung
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Anwendung bei 1:200 Verdünnung
Primary Antibodies
Anti-NG2 (Kaninchen polyklonal )	Millipore	AB5320	Weist Perizyten
Anti-GFAP (Klon GA5, Maus monoklonal)	Millipore	MAB360	Weist Astrozyten
Anti-Desmin (Klon Y66, Kaninchen monoklonal)	Millipore	04-585	Erkennt Perizyten
Anti-Collagen IV (Kaninchen polyklonal )	Chemicon	AB756P	Erkennt vaskuläre Basalmembran
Anti-Alpha Aktin-Cy3 (Klon 1A4, Maus monoklonal)	Sigma	C6198	Erkennt vaskuläre glatte Muskelzellen.
Anti-Endoglin (Klon MJ7/18, monoklonal bei Ratten)	BD Pharmingen	550546	Nachweis von Endothelzellen
Anti-CD31 (Klon MEC13.3, monoklonal bei Ratte)	BD Pharmingen	553370	Nachweis von Endothelzellen
Anti-VE-Cadherin (Klon 11D4.1, monoklonal bei Ratte)	BD Pharmingen	550548	Nachweis von Endothelzellverbindungen
Anti-Alk1 (polyklonal bei Ziegen)	R& D Systems	AF770	Erkennt Endothelzellen
Sekundäre Antikörper
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Anti-Ratten-Alexa488	Invitrogen	A11006	Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Ziegen-Anti-Ratten-Alexa594	Invitrogen	A11007	Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Ziegen-Anti-Maus-Alexa488	Invitrogen	A11029	Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Esel-Anti-Ziegen-Alexa594	Invitrogen	A11058	Alle Sekundärantikörper werden sofort nach der Ankunft aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
Mikroskope
Dissektionsmikroskop	Zeiss	Stemi SV6
Kamera	Zeiss	Axiocam HRc	Kamera für Dissektionsmikroskop
Epifluoreszierendes Mikroskop	Zeiss	Axioimager mit Apotome
Kamera	Zeiss	Axiocam HRm	Kamera für Axioimager
Konfokalmikroskop	Nikon	A1R

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