Robust 3D DNA FISH Mit Direkt markierten Sonden

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.

Zusammenfassung

3D FISH DNA hat sich zu einem wichtigen Instrument für die Analyse dreidimensionale Organisation des Zellkerns, und einige Variationen dieser Technik wurden veröffentlicht. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll, das für Robustheit, Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit optimiert wurde. Hell fluoreszierende direkt markierten Sonden durch Nick-Translation mit Amino-allyldUTP durch chemische Kopplung des Farbstoffes gefolgt erzeugt. 3D DNA FISH unter Verwendung eines Gefrier-Auftau-Schritt für Zellpermeabilisierung und einen Erwärmungsschritt zum gleichzeitigen Denaturierung der Sonde und Kern-DNA. Das Protokoll ist auf einen Bereich von Zelltypen und eine Vielzahl von Sonden (BACs, Plasmide, Fosmide oder ganzes Chromosom Paints) und ermöglicht automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebung. Mit dieser Methode routinemäßig untersucht Kernlokalisation bis zu drei chromosomalen Regionen.

Einleitung

DNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH DNA) erlaubt die dreidimensionale Visualisierung der einzelnen Genorte, subchromosomalen Domains und sogar ganze Chromosomen während allen Phasen des Zellzyklus. 2D-FISH ist für Metaphase Studien verwendet werden, während 3D FISH wurde ausgiebig genutzt worden, um die Beziehung zwischen der räumlichen Organisation des Genoms und seine Funktion während der Interphase ^(1,2 und Referenzen darin) zu untersuchen. Historisch wurden co-Assoziation Studien untersucht zehn bis Hunderte von einzelnen Stellen durch FISH durchgeführt. In jüngerer Zeit mächtig hohen Durchsatz 3C-basierte Techniken wie 4C und Hallo-C wurden ³ entwickelt, das die Untersuchung von molekularen Übersprechen zwischen vielen tausend verschiedenen loci. Während 3C-basierte Techniken und DNA FISH komplementäre Methoden sein kann, aber nicht zwangsläufig die gleichen Fragen beantworten. 3C basierte Methoden ein Ensemble Auslesen von gemischten Zellpopulationen, was eine Wahrscheinlichkeittung für Co-Verbände. Im Gegensatz dazu, während niedrige Durchsatz bieten FISH Techniken die Möglichkeit, räumliche Anordnungen von Loci oder Chromosomen in einzelnen Zellen entsprechend ihrer Entwicklungs-oder Zellzyklus-Stadien zu analysieren. Daher wird FISH weiterhin ein wichtiges Instrument für die Sondierung nuklearen Struktur-Funktions-Beziehungen.

Es gibt zwei wichtige Überlegungen bei der Durchführung von erfolgreichen 3D-FISH Experimente. Diese sind: 1. Erhalten optimal markierten Sonden und 2. Wahl der zellulären Behandlungen, einschließlich Fixierung, Pre-und Post-Hybridisierung Schritte, um Kernmorphologie so viel wie möglich zu erhalten und gleichzeitig ausreichend DNA zugänglich für Sondenhybridisierung. Effiziente Sondenmarkierung ist von entscheidender Bedeutung für die Fische. Traditionell wurde Nick-Translation verwendet worden, um entweder Hapten oder fluorophorkonjugierten Nukleotide ⁴ einzuführen. Ebenso sind kommerzielle Nick-Translation-Kits für den direkten Einbau Hapten oder Fluorophor, bu verfügbart auch für zwei-Schritt-Kennzeichnung mit aminoallyl Nukleotide und aminreaktiven Farbstoffe. Letzteres macht Farbstoff Einbau effizienter, indem DNA-Polymerase eine weniger sperrige Molekül, mit zu arbeiten. In jüngerer Zeit sind Kits zur nicht-enzymatischen Markierung von DNA entwickelt worden, die zu nutzen koordinative Bindung von Platin zu Nukleinsäuren. FISH-Sonden können sogar bereits gekauft beschriftet ⁵ werden. Während Kits und kommerziell hergestellten Sonden keinen Zweifel geben, Benutzerfreundlichkeit, sind sie deutlich teurer als der Kauf der einzelnen Komponenten und Herstellung von Sonden in-house. Wir optimierten eine kostengünstige Nicktranslation Protokoll, um direkt beschriften vielen verschiedenen BAC Sonden in mehreren Farben. Wir entdeckten, dass Gewinnung von hochreinem BAC DNA ist kritisch und führt zu einer Anforderung für nur 10-20 ng Sonde pro FISH Folie im Vergleich zu 10 - 20-fach stärker als unrein template DNA verwendet wird, was erhebliche Kosten-und Zeit- Einsparungen. Die Verwendung von Amino-allyldUTP ermöglicht flexible KennzeichnungSonden mit den verfügbaren aminreaktiven Farbstoffe (zB Alexa Fluor oder Cy-Farbstoffe) oder Haptene (zB Biotin, Digoxigenin). Hapten-markierten Sonden werden von Fluorophor-konjugierte Antikörper oder Streptavidin zu verstärken und zu visualisieren das Signal. Helle direkt markierten Sonden zeigen in der Regel weniger Hintergrundfärbung und vermeiden Sie über-Verstärkung von Signalen, also was eine genauere Darstellung der nuklearen Lokalisation und Morphologie Locus.

Es gibt verschiedene Techniken, die FISH verschiedene Fixative, Vorbehandlungen und Posthybridisierung Wäschen verwenden, aber diese in der Regel in die folgenden Kategorien fallen: Glutaraldehyd Fixierung mit NaOH Denaturierung, Formaldehyd Fixierung mit HCl Denaturierung und Fixierung mit Formaldehyd Hitzedenaturierung ^6-9 . Jeder von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Glutaraldehyd Fixierung führt zu einer guten nuklearen strukturelle Konservierung, sondern erfordert die Behandlung mit Reduktionsmitteln zu minimierendie resultierende Autofluoreszenz und NaOH Behandlung muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine ausreichende DNA Denaturierung und mögliche Schäden an der Kernstruktur ⁶ auszugleichen. Formaldehydfixierung weniger stark ist, so dass eine erhöhte Wahrscheinlichkeit von Störungen der nuklearen Architektur, sondern auch in der Regel geben stärker und zuverlässiger Signale und niedrigere Autofluoreszenz ^9. HCl-Behandlung depurinates DNA und Proteine ​​aus Streifen mit einer guten Anbindung an die DNA für die Sonden, kann aber auch zu DNA-Brüchen. Heizung physisch trennt die beiden DNA-Stränge zu einer guten Zielhybridisierung und starke Signale, kann aber einige Störung der Kernstruktur ⁸ führen. Das Ausmaß, in dem jede dieser Techniken betrifft Proteinepitope variiert stark ^6,9, was in der Forderung, experimentell für jedes Protein die optimale Protokoll in Immuno-FISH Experimente verwenden, fest.

Zwar gibt es keine "perfekte" DNA FISH technique, können sie nützlich sein, wenn alle gut beherrscht. Unser Ziel war es, ein Protokoll für robuste und reproduzierbare DNA FISH Optimierung der räumlichen Position der einzelnen Loci in einer Vielzahl von Zelltypen ¹⁰ zu untersuchen, die sich auf die Verfahren zur Erwärmung zuverlässigsten Signale. Damit und mit der Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystem Unser Ziel war die Erhöhung der Durchsatz für einzelne Zelle Analyse der atomaren Anordnungen.

Protokoll

1. Generieren Direkt markierter DNA-Sonden durch Nick Translation

Hinweis: Direkt markierten Sonden von BACs gemacht (100-250 kb) konsequent zu produzieren helle Signale. Wenn kleinere Sonden erforderlich sind, verwenden Fosmide (40-50 kb) oder auch Plasmide, die 5-10 kb Einsätze. Identifizieren BAC-Klone oder Fosmid entsprechend spezifischer Gene mit Ensemble oder UCSC Genom Browsern. Bereiten Sie hochwertige BAC DNA durch wiederholte Fällung oder verwenden Sie handelsübliche Kits. Je weniger die Zubereitung mit bakterieller genomischer DNA verunreinigt ist, wird die Sonde weniger pro Folie erforderlich. Führen Sie die Kennzeichnung in zwei Schritten: Nicktranslation Einführung aminoallyl-dUTP und chemische Kopplung eines aminreaktiven Farbstoff.

1.1. Nick Translation

Während Nick-Translation wird DNase I verwendet werden, um Single-Strang-Brüche zu erstellen. DNA Polymerase I verlängert die 3'-Enden dieser "nicks" Ersatz bestehender Nukleotide durch neue, t hiermit 'übersetzen' die nick und somit die Möglichkeit bietet, markierte Nukleotide zu integrieren. Aminoallyl-dUTP wird wegen der effizienten Einbau von DNA Polymerase I gewählt und ihr Potenzial für die spätere chemische Kopplung zu Amin-reaktive Farbstoffe oder Haptene. Es ist wichtig, die richtige Balance zwischen DNase I nicking und DNA-Polymerase I Übersetzung zu erreichen, zu viel DNase I wird in übermäßiger DNA Verdauung geben geringe Ausbeute und kurzes Fragment Größen resultieren, zu wenig produziert nicht genug Kerben für die Polymerase Übersetzung initiieren, geben große Fragment Größe und schlechte Einarbeitung aminoallyl-dUTP. Das folgende Protokoll funktioniert gut, aber es kann notwendig sein, die DNAse I aus unterschiedlichen Chargen oder verschiedener Hersteller zu titrieren.

1. Einrichten Kennzeichnung Reaktion auf Eis und Inkubation für 2 Stunden bei 16 ° C. Dabei sollte 0,5-1 ug nick-translatierten DNA und kann skaliert werden. Verdünnen DNase I 1:30 DNase I-Puffer (dh 0,3 U / ul).

1 "> Bauteile Konzentration auf Lager Volumen oder Menge BAC DNA 5-10 ug NTB-Puffer 10x 5 ul DTT 0,1 M 5 ul dNTP-Mix 10x 5 ul Aminoallyl-dUTP 0,5 mM 6 ul DNA Polymerase I 10 U / ul 1 ul DNase I 10 U / ul 1 ul (von 01.30 Verdünnung) H ₂ O bis 50 ul

2. Lauf 1 ul auf einem 2% Agarosegel, um die Größe der markierten Fragmente zu überprüfen. Während Sie das Gel laufen, halten Sie die Reaktion auf Eis. Erfolgreiche nick translation wird in einem Abstrich mit dem Großteil der Fragmente, die zwischen 150 bp und 700 bp mit einigen größeren Fragmente bei ~ 1 kb (: siehe Repräsentative Ergebnisse kritischer Schritt) führen. Falls erforderlich, fügen Sie eine weitere 1 ul einer frisch 01.30 DNase I Verdünnung und Inkubation bei 16 ° C für 15-30 min. Inkubationszeit wird nach der Menge und Qualität der BAC DNA variieren.
3. Inaktivieren DNase I durch Erhitzen auf 75 ° C für 10 min.
4. Clean-up aminmodifizierten DNA unter Verwendung eines PCR-Purification-Kit. Eluiere in 100 ul H ₂ O.
5. Ethanol Niederschlag DNA durch Zugabe von 10 ul 3 M NaOAc (pH 5,2) und 275 ul Ethanol. Lassen Sie bei -20 ° C für mindestens 1 Stunde oder über Nacht. Spin bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Minuten bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 500 ul 70% Ethanol und an der Luft trocknen. Dieser Schritt entfernt Trace Amine, die mit der Etikettierung Reaktion stören. Pellet in 6 ul H ₂ O pro 1x erste Reaktion.
6. Verwenden 1 ul, um die Konzentration der Amin-modifizierte DNA bestimmen,von Mikrovolumen UV-Spektroskopie.

1.2. Kopplung des Fluoreszenzfarbstoffes

Fluoreszierende Markierung der Sonde wird durch chemisches Kuppeln des Farbstoffes erreicht. Alexa Fluor Succinimidylester Farbstoffe reagieren mit den Aminen der Amino-allyldUTP modifizierten DNA, um eine kovalente Bindung zu bilden, wodurch direkt markierten Sonden. Alexa Fluor 488, 555, 647 und Farbstoffe wurden für diesen Prozess erfolgreich.

1. Adjust 4 ug Amino-Allyl modifizierte DNA auf ein Volumen von 5 ul, Hitze bis 95 ° C für 5 min auf Eis kühl rasten, und fügen Sie 3 ul von 0,2 M NaHCO _3.
2. Man löst ein Aliquot von Amin reaktiven Farbstoff in 2 ul wasserfreiem DMSO bei Raumtemperatur. In 8 ul modifizierte DNA mit NaHCO _3, Vortex-, Impuls-Spin und Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde.

Hinweis: Die Amin-reaktive Farbstoffe können verwendet werden, um mehr als eine Sonde auf folgendem Schema zu markieren. Da only 10-20 ng Sonde pro Folie Kennzeichnung verwendet wird, gibt 1 ug genug Sonde für 50-100 Dias. Es ist auch möglich, Amin-modifizierte DNA für zukünftige Markierungsreaktionen Lagerung bei -20 ° C.

DNA-Menge	DNA Volumen	0,2 M NaHCO 3	Volumen der Farbstoff	Insgesamt	Genug für
4 x 1 ug	1,25 ul jeder	0,75 ul jeder	0,5 ul jeder	2,5 ul (1/4)	50-100 Folien jeweils
3 x 1,35 ug	1.67 ul jeder	1 ul jeder	0,67 ul jeder	3,34 ul (1/3)	65-130 slide jeder
2 x 2 ug	2,5 ul jeder	1,5 ul jeder	1 ul jeder	5 ul (1/2)	100-200gleitet jedes
1 x 4 ug	5 ul	3 ul	2 ul	10 ul (voll)	200-400 Dias

3. In 90 ul H ₂ O und reinigen markierten Sonde mit Hilfe eines PCR-Purification-Kit. Eluiere in 100 ul 10 mM Tris-Cl (pH 8,5).
4. Bestimmen Sonde Konzentration und Kennzeichnung Effizienz durch Mikrovolumen volle Spektrum-Spektroskopie (siehe Abbildung 2) mit Lambert-Beer-Gleichungen (Anleitung sind im Datenblatt angegeben begleiten die Alexa Fluor reaktive Farbstoffe oder können Online gefunden werden). Sonden, die 3-6 Farbstoffe pro 100 bp gut funktionieren. Probes mit niedrigeren Grad der Einarbeitung geben kann schwach FISH-Signale. Alternativ können Sie 5 ul auf einem 2% Agarosegel ohne DNA-Färbung und überprüfen Sie die Einbindung der Fluoreszenzfarbstoff mit einem Phosphoimager. Sende-Fleck das Gel mit Ethidiumbromid oder DNA-Färbung Alternativen und vergleichen markierte DNA zu Gesamt-DNA.

2. DNA FISH

Via den folgenden Schritten werden die Zellen von Interesse Objektträgern fixiert und permeabilisiert. Cellular DNA und direkt markierten Sonden werden dann auf einer heißen Platte denaturiert und über Nacht in einem lichtdichten feuchten Kammer hybridisiert.

2.1. Tag 1

1. Probe Niederschlag
   Hinweis: Precipitate Sonden irgendwann während Tag 1. Dies kann bequem in parallel zu der Behandlung der Zellen durchgeführt werden und muss nicht zu Beginn des Tages erfolgen.
   1. Mix 10-20 ng direkt markierten Sonde, 6 ul C ₀ t-1 DNA (6 ug), 1 ul einzigen DNA aus Lachshoden (9,7 ug) und die Lautstärke auf 100 ul mit Wasser.
   2. In 10 ul 3 M NaOAc und 275 ul EtOH und vortexen. Man fällt für mindestens 1 h bei -20 ° C.
   3. Spin in Mikrozentrifuge bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Minuten bei 4 ° C. Waschen Pellet mit 70% EtOH und Spin wieder. Dry Pelletund in 5 ul deionisiertem Formamid resuspendieren. Resuspendieren für 30 min bei 37 ° C unter Schütteln bei 1000 min vor Licht geschützt (Ort Folie über dem Thermomixer).
   4. In 5 ul Dextransulfat mixen und shaken und für weitere 10 min bei 37 ° C wieder vor Licht geschützt. Pipette nach oben und unten nur vor dem Pipettieren auf Deckglas.
      Hinweis: Für Chromosom Malerei mit BAC-Sonden ganzes Chromosom Malerei Sonden, die in ready-to-use Hybridisierungsmix geliefert werden, sind eine bequeme Möglichkeit kombiniert. Resuspendieren gefällt BAC-Sonde (mit C ₀ t1 DNA und einzelsträngige DNA aus Lachs Hoden) in 10 ul Chromosom paint mix durch Auf-und Abpipettieren. Bei 37 ° C unter Schütteln bei 300-500 rpm für 10 min. Verwenden Sie 10 ul Chromosom Lack / BAC Sonden-Mix pro Spot.
2. Anbringen Cells Slides
   Hinweis: Die Zellen Neigung zu den Folien haften stark mit Zelltyp. Für jeden Zelltyp bestimmen dieoptimale Setzzeit und die Zelldichte empirisch. Um gleichbleibende Ergebnisse sollten die Zellen in einem Zell-Suspension ist.
   Zur Erhöhung der Benutzerfreundlichkeit Kreis der Bereich die Zellen auf mit einem hydrophoben Stift entdeckt werden, obwohl für die Zellen in PBS resuspendiert dies nicht unbedingt erforderlich ist. Eine hydrophobe Barriere verhindert, dass die Suspension Ausbreitung auf der Folie hält bis zu drei Proben pro Folie gut getrennt und ermöglicht die Verwendung von sehr kleinen Mengen an Antikörper-Lösung in Immuno-FISH. Auch kann die Spotting-Bereich auf ein Minimum reduziert werden, wenn Zellzahlen niedrig sind.
3. Maus fötalen Leberzellen
   1. Sammle jede E13.5 Maus fötalen Leber in ca. 1,5 ml PBS resuspendieren und durch Auf-und Abpipettieren. Spin in Mikrofuge bei 3.000 rpm für 2 min. Wiederholen Sie wäscht dreimal. Bei der letzten Wäsche, Stamm Zellen durch eine 70 um-Sieb. Die Zellen von einer Leber in 160 ul PBS und verwenden 50 μ pro Spot. Lassen Zellen für 2 min bei Raumtemperatur zu regeln.
4. Mouse ES-Zellen
   1. Maus-ES-Zellen nicht leicht kleben an der Folie. Auf einer Rutsche, Kreis der Bereich die Zellen auf mit einem hydrophoben Stift entdeckt werden. Eine Suspension von 20.000-50.000 Zellen pro 80-100 ul in normalen Kulturmedium Pipette in Kreis und lassen Sie für ca. 3 Stunden in einem befeuchteten Inkubator Hinweis anzubringen:. Alternativ können ES-Zellen auf Objektträgern kultiviert werden, sondern bilden dann Kolonien, die Automated Imaging behindern könnte.
5. Fixierten Zellen
   1. Einige Experimente erfordern die Verwendung von fixierten Zellen, die nicht mit Folien nicht anhängen, indem sich. Leichte Spinnen bei 300 rpm für 3 Minuten unter Verwendung eines Zytozentrifuge bewahrt die dreidimensionale Struktur der Zellen und sorgt dafür, dass Zellen nicht abfallen.

Zelltyp	Suspension in	Einschwingzeit	Kommentar
MausFötusleber	PBS	2 min	Auf der Bank
Maus ES	DMEM mit Ergänzungen	4 Stunden	37 ° C in befeuchteten Inkubator
Maus-Lymphozyten	PBS	2 min	Auf der Bank
Maus P20 Keimzellen	Fix in Lösung	Cytospin	Auf der Bank

3. Für 10 min: Um Zellen, sanft tauchen slide in 4% PFA (führen in Abzug VORSICHT) zu beheben. Fix-Zellen mit dem Schlitten Wohnung in einem Fach für die besten Retention von Zellen (z. B. 50 ml 4% PFA in den Deckel einer Tip-Box). Hinweis: Dieser Schritt gilt nicht für Zellen vor der Befestigung an Objektträgern fixiert gelten.

Für alle weiteren Schritte, verwenden 50 ml oder 100 ml Coplin Gläser. Achten Sie darauf, nicht auf Zellen abschaben beim Verschieben gleitet zwischen Gläsern.

4. Quench in 0,1 M Tris-Cl, pH 7,4 für 10 min bei RT.
5. Durchdringbar Zellen in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS für 10 min bei RT.
6. Zweimal waschen mit PBS für 5 min bei RT.
7. Inkubieren für mindestens 20 min in 20% Glycerin / PBS bei RT. Hinweis: An dieser Stelle können Folien in 50% Glycerin / PBS bei -20 ° C für mindestens mehrere Wochen gelagert. Es hat sich gezeigt, daß Speicher für mindestens einen Tag führt zu einem Anstieg in der Signalstärke ⁹ beobachtet. Kalibrieren in Raumtemperatur 20% Glycerin / PBS, bevor Sie fortfahren. Hinweis: Dies ist eine bequeme Punkt zu beginnen Ausfällen der Sonden (siehe 2.1.1).
8. 3x Einfrieren / Auftauen in flüssigem Stickstoff. Tauchen Sie ein Dia zu einem Zeitpunkt, in flüssigem Stickstoff mit einem kleinen Dewar. Ziehen Sie nach einigen Sekunden und einem charakteristischen Knall, und auf Küchenpapier auftauen. Warten Sie, bis opak gefrorenen Glycerin zu verschwinden dann wieder einfrieren. Bis zu 15 Dias bequem in Drehung erfolgen für drei Einfrieren / Auftauen.
9. WAsche zweimal in PBS für 5 min bei RT.
10. Inkubieren in 0,1 M HCl für 30 min bei RT.
11. Waschen in PBS für 5 min bei RT.
12. Permeabilisierung in 0,5% saponin/0.5% Triton X-100/PBS 30 min bei RT.
13. Zweimal waschen mit PBS für 5 min bei RT.
14. Equilibrieren in 50% formamide/2x SSC für mindestens 10 min bei RT.
15. Pipette Sonde auf einem Deckglas. Objektträger aus dem Glas und trocknen Sie das überschüssige Flüssigkeit um die Zelle vor Ort (e) mit einem Papiertuch. Da die Formamid trocknet schnell, darauf achten, nicht austrocknen Zellen. Für Objektträger mit zwei oder drei Zellen Flecken, gelten 10 ul Sonde pro Spot auf eine 22 mm x 50 mm Deckglas entsprechende Position auf der Folie zu erkennen. Umkehren Deckglas auf Schlitten über spot (s). Seal mit Gummi-Zement und zulassen, dass dies vollständig trocknen. Ohne Licht bei allen nachfolgenden Phasen.
16. Hitze Folien auf 78 ° C für genau 2 min auf eine Heizplatte (zB eine umgekehrte Heizblock kritischer Schritt: siehe Diskussion). Legen Sie einen Deckel (Karton oder sim Ilar) über der heißen Platte vor Licht während Denaturierung zu schützen.
17. Inkubation über Nacht bei 37 ° C in einer lichtdichten feuchten Kammer. Um befeuchten, legen Papierhandtücher in einem lichtdichten Box und mit Wasser angefeuchtet.

2.2 Tag 2

1. Bereiten Coplin Gläser mit Lösungen auf die richtige Temperatur für die nachfolgende Waschschritte. Schützen Sie Folien aus Licht so viel wie möglich bei allen nachfolgenden Schritte. Ein Kaffee kann macht einen guten lichtdichten Abdeckung für Coplin Gläser.
2. Peel off Gummizement und Ort Folie in 2x SSC bis Deckgläser lösen und abrutschen.
3. Waschen in 50% formamide/2x SSC für 15 min bei 45 ° C Deckel auf Wasserbad den Inhalt vor Licht zu schützen.
4. Waschen in 0,2 x SSC für 15 min bei 63 ° C
5. Waschen in 2 × SSC für 5 Minuten bei 45 ° C.
6. Waschen in 2 × SSC für 5 Minuten bei RT.
7. Waschen in PBS für 5 min bei RT.
8. Fleck mit DAPI (5 ug / ml in 2x SSC) für 2 min in einem entsprechenden Gefäß bei RT.

Inhalt "> Hinweis: DAPI-Lösung kann bei 4 ° C im Dunkeln für 2 Monate.

9. Entfärben in PBS für 5 min bei RT.
10. Um das Deckglas montieren, Montage Pipette Medium auf einem Deckglas. Verwenden Sie 10 ul pro Zelle vor Ort, mit 22 mm x 22 mm Deckgläser für einen Punkt, und 22 mm x 50 mm Deckgläser für zwei bis drei Flecken. Abtrocknen PBS um die Zelle vor Ort so viel wie möglich, aber darauf achten, nicht zu trocknen die Zellen. Umkehren Deckglas auf Rutsche und Dichtung mit Nagellack.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1 für Übersicht) hat mit großer Wirkung verwendet worden, um DNA FISH mit hohem Durchsatz Bilderfassung für die Analyse von genomischen Organisation kombinieren. Die Erzeugung von guter Qualität Sonden ist entscheidend für den Erfolg (siehe Diskussion). Abbildung 2 zeigt zwei wichtige Qualitätskontrollen für FISH-Sonden. Nach Nick-Translation, sollte ein Abstrich der DNA sichtbar mit der Masse der Fragmente, die zwischen 150 und 700 bp (Abbildung 2A). Nach der chemischen Kopplung kann Einarbeitung des Fluoreszenzfarbstoffs durch spektroskopische Analyse der Probe (2B) gemessen werden.

Bei der Verwendung von guten Sonden, im Anschluss an die DNA FISH Protokoll führt in der Regel hell DNA FISH-Signale mit niedrigem Hintergrund. Wir haben erfolgreich dieses Protokoll auf einer Vielzahl verschiedener Zelltypen verwendet, und entweder mit Auflicht-Fluoreszenz oder konfokalen Mikroskopen. Automated Imaging mit einem epi-fluorescence Mikroskop erfordert scharfe, leicht identifizierbar FISH-Signale mit wenig Hintergrund (Abbildung 3), während die konfokale Mikroskopie erfordert intensivere Signale. 4A zeigt repräsentative Bilder verarbeitet. Kernkoordinaten FISH-Signale erhalten werden, und die räumliche Beziehung der genomischen Regionen berechnet (Beispiel siehe 4B) werden. Wir haben auch Bildstapeln durch konfokale Mikroskopie für 3D-Modellierung der FISH-Signale in ihrem Chromosom Gebiete (Movie 1) erhalten wird.

Abbildung 1. Workflow für Sondenmarkierung und DNA FISH. Herstellung der Sonden ist in blau dargestellt. DNA FISH-Verfahren ist in schwarz mit Details in grün gegeben gezeigt.

Abbildung 2. Markierung von Sonden durch Nick-Translation und Qualitätskontrolle von markierten Sonden. A) zeigt Gel ideal Abstrich vor der Erwärmung auf DNase I (Spur 1 zu inaktivieren: DNA-Leiter, Spur 2 und 3: BACs nach Nick-Translation). Fragmente sollten in der 150-700 bp liegen. Ein weiterer Abstrich bei ~ 1 kb wird häufig mit erfolgreichen Nick-Translation Reaktionen beobachtet. B) Microvolume volle Spektrum Analyse der markierten Sonden. Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm DNA-Peak bei 260 nm mit einem zweiten Peak, entsprechend der Absorptionswellenlänge des Fluorophors die Sonde mit markierten beobachtet. Dargestellt sind drei Sonden mit einer guten Einarbeitung: Fluorophor Absorptionsspitzen sind ein ähnlicher Höhe oder höher als die DNA Gipfeln. Alexa Fluor 647 hat in der Regel höhere Absorptionals Alexa Fluor 555, was wiederum eine höhere Absorption als Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 absorbiert auch etwas Licht bei 260 nm, also die erste Spitze dieser Sonde größer ist als die anderen. Probes mit schlechten Einbau Show Fluorophor Absorption 2-3-fach niedriger als die DNA Absorption. Sonden mit einem mehr als 2-fach höher als Fluorophor peak peak DNA enthalten in der Regel nicht konjugierten Farbstoff, der Hintergrund in der FISH verursachen können.

Abbildung 3. Screenshot aus dem MetaCyte 3D FISH Imaging-Software, die eine typische Drei-Farben-FISH Experiment. Der Bildschirm ist in mehrere Teile gegliedert. A) Raw field-of-view (FOV) Bild von der Metafer / MetaCyte Dia Scan-System erfasst werden. B) Galerie von Bildern der Kerne, die un identifiziert habendergone Bildverarbeitung und Segmentierung für FISH-Signale. Verschiedene Arten von Daten können auf jeder Galerie Bild angezeigt werden. In diesem Beispiel Zellzahl wird oben links mit verschiedenen interallelic und interlocus Entfernungen rechts oben und zu beiden Seiten unter jedem Bild angezeigt. C) Slide Namen mit der Anzahl der Kerne in der Analyse. Identifiziert D) Darstellung des Schlittens mit dem durch das gescannte System. E) Erweiterung des gescannten Bereichs. Weiße Flecken darstellen identifiziert Kerne pro FOV. F) verarbeitet Daten. In diesem Beispiel maximal interallelic Abstände zwischen grünen Signale (oben) und rote Signale (unten) gezeigt. Die gezeigten Daten ist von der Maus P20 Keimzellen. Die Sonden werden auf verschiedenen Chromosomen, für HBB und Hba Gene und eine Histon-Cluster befinden. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 4. Beispiele von bearbeiteten Bilder und abgeleiteten Positionsdaten. A) verarbeitet Bilder für E13.5 Maus fötalen Leberzellen mit BAC-Sonden auf verschiedenen Chromosomen abdecken Myc und KCNQ1 Gene (sog. myc und KvDMR, grün bzw. rot). B) Tukey-Box-Whisker-Plots, die die interallelic erreichbar gefärbt Verteilung für die gleichen Loci in 600 Kerne. Interallelic Abstand wird als Bruch des Kerns 'Radius (Abstand / Radius) zu berücksichtigen Variationen in Kerngröße aufgetragen. ES Zellkerne haben einen Radius von etwa 5 um. Red Sonden wesentlich näher beieinander liegen als grüne Sonden (***: p <0,01, ungepaarten t-Test). Daten aus ^10.

Film 1. 3D-Modellierung von zwei Loci in ihrem Chromosom territory. Zwei BAC-Sonden in der Nähe von beiden Enden des Maus-Chromosom 7 befindet etikettiert wurden (rot und weit rot, (pseudo-weiß gefärbt)) und zusammen mit einem ganzen Chromosom Farbe (grün) an Maus-ES-Zellen hybridisiert. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .

Diskussion

3D FISH DNA hat sich zu einem weithin anerkannten Instrument zur räumlichen Anordnungen in den Zellkern zu analysieren. Während FISH bietet visuelle und direkte Ergebnisse, wie bei jeder Technik muss man sich bewusst sein, seine Grenzen. DNA FISH steht das inhärente Problem, dass relativ raue Behandlungen notwendig sind, um Chromatin zugänglich für FISH-Sonden, die letztlich stört Kernstruktur-genau das, was analysiert werden soll. Mehrere Strategien wurden verfolgt, um die Zugänglichkeit und Struktur Erhaltung jonglieren. In dem hier beschriebenen Protokoll wird chromosomale DNA zugänglich gemacht Frost-Tau-Permeabilisierung von Zellen und Hitzedenaturierung vor Sondenhybridisierung. Solovei, et al., (2002) analysiert Strukturveränderungen nach ähnlichen Behandlung und festgestellt, dass die durchschnittliche Verschiebung Chromatindomänen 300 nm, die die Auflösung der strukturellen Analyse beschränkt auf rund 1 Mb Regionen im Genom ⁸ war. Dies ist zwar nicht hohe Auflösung, esist ein angemessener Maßstab für die Analyse von nuklearen Position.

Eine praktische Überlegung für FISH-Analyse ist, dass die Bildaufnahme und Messungen Kernabstände sind zeitaufwendig Prozesse, die die Anzahl der Kerne, die analysiert werden können, zu begrenzen. Um zu untersuchen, seltene Ereignisse es unser Ziel, einen hohen Durchsatz Automated Imaging tun. Dann mit geeigneten Kontrollen, eine ausreichende Zahl im Vergleich zu für robuste statistische Analyse der räumlichen Beziehungen zu ermöglichen. Wir analysieren routinemäßig 600 Kerne pro Datenpunkt für das bestimmen wir die 3D-Koordinaten aller FISH-Signale innerhalb des nuklearen Volumen. Diese Daten benötigen sehr wenig Speicherplatz und erlauben für die Analyse von inter-und intra-Allel Entfernungen oder radialen Positionen zu einem späteren Zeitpunkt. Darüber hinaus kann die automatisierte Verarbeitung in einem Forscher blinden Weise das reduziert die Wahrscheinlichkeit von unbewussten Bias durchgeführt werden.

Um diese Art von hohen Durchsatz ermöglichen analysist, war es unser Ziel, eine schnelle und effiziente Art und Weise der Durchführung DNA FISH etablieren. Wir fanden das hier beschriebene Protokoll als äußerst robust, konsequent Herstellung helle Signale mit niedrigem Hintergrund. Er arbeitete für alle Zelltypen versuchten wir vorausgesetzt, wir angepasst den Schritt der Befestigung der Zellen auf den Objektträger. Darüber hinaus mit einer Ausnahme konnten alle BACs verwendeten wir in hellen Sonden gedreht werden. Wir haben auch erfolgreich eine Reihe von nuklearen Proteinen durch Antikörper-Färbung nach der DNA-FISH nachgewiesen. Während für einige Proteine ​​dies gut funktioniert, empfehlen wir gegenüber herkömmlichen Immunfluoreszenz (IF), um die Konsistenz der Antikörper-Färbung Muster zwischen IF und FISH DNA Immuno (vgl. ¹¹⁾ zu gewährleisten.

Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass Proben in verschiedenen Farben markiert die gleichen Ergebnisse erzielt. Allerdings sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werden, wenn die Wahl der Kennzeichnung Farbstoff werden. Zuerst muss die Farbe des Fluorophors zu gut nachweisbar durch das Mikroskop used. Zweitens sollte die Wellenlänge des Lichts durch die Fluorophore emittiert wird ausreichend verschieden, die das Durchscheinen in dem anderen Kanal zu vermeiden. Dies wird auf den Filtern in dem Mikroskop ab. Und drittens, zumindest in unseren Händen, produzieren einige Farben hell Signale konsequenter als andere. Wir haben immer DAPI (blau) als Gegenfärbung die Alexa Fluor 555 (rot), 488 (grün) macht verwendet, und 647 (ganz rot) eine gute Wahl für die Markierung von Sonden. Mit unseren Imaging-System, fanden wir Alexa Fluor 555 (rot) an die hellsten Signale von Alexa Fluor 488 (grün), gefolgt produzieren. Alexa Fluor 647 (bis rot) hat den Nachteil, dass sie nicht vom menschlichen Auge erkannt werden und somit keine Signale zu erkennen, wenn man sich das Mikroskop werden. Wenn also tun zweifarbige FISH, empfehlen wir die Kombination von roten und grünen Farbstoffe.

Zwei wesentliche Probleme auftreten: Zellen Abwaschen der Dias und schwache Signale. Wie gut Zellen auf den Objektträger haften ist enorm variable zw.een Zelltypen, und das beste Protokoll / Saatgut die Zellen bestimmt werden muss begleichen. Wir haben erfolgreich entweder positiv geladene oder Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (gekauft gebrauchsfertig), fand aber in der Regel eingehalten Zellen besser auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger. Wir haben auch festgestellt, dass, wenn die Zellen zu dicht ganze Landstriche würden abziehen wie ein Blatt, während Automated Imaging wurde behindert waren, wenn die Zellen zu spärlich waren. Somit, wenn die Probe nicht zu wertvoll, sollten unterschiedliche Zellzahlen geimpft, um die ideale Dichte zu bestimmen. Wenn Zellen besonders anfällig zu waschen sind, kann eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden, und FISH Schritte können durch vorsichtiges Pipettieren Lösungen direkt auf den Objektträger durchgeführt werden. Pipettieren auch drastisch reduziert das Volumen der benötigten Reagenzien, aber erheblich länger dauert, wenn dabei mehrere Folien.

Schwache Signale sind in der Regel aufgrund der schlechten Sonden und es lohnt sich zu investieren Zeit in die Herstellung guten. Saubere BAC DNA sollte verwendend als Ausgangsmaterial, das durch wiederholte Fällung oder kommerziell erhältlichen Kits erhalten werden kann. Kontamination mit bakteriellen genomischen DNA Sonde wirkt sich negativ auf Qualität und sorgfältige Behandlung während der Zell-Lyse und Filterung des Zelllysat wird benötigt, um es auf ein Minimum zu halten. Es ist jedoch nicht notwendig, eine Exonuklease-Schritt verwendet, um lineare DNA zu verdauen, da diese stark reduziert Ausbeute. Effiziente Markierung der Sonde ist von entscheidender Bedeutung. Die wichtigste Qualitätskontrolle für diesen Schritt ist die Überprüfung der Fragmentgröße nach Nick-Translation (siehe Repräsentative Ergebnisse). Eine "gute" Abstrich wird fast immer in einem bunten Sonde führen. Allerdings haben wir festgestellt, dass gelegentlich eine gewisse BAC kann nicht in eine gute Sonde verarbeitet werden, und eine andere BAC muss gewählt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist Hitzedenaturierung. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, wird die DNA nur teilweise denaturiert und Sondenhybridisierung beeinträchtigt wird. Wenn die Temperatur zu hoch ist, Kernstruktur will gestört werden mehr als nötig. In unseren Händen ist 78 ° C auf einem inversen heißen Block der idealen Kompromiss, sondern je nach der jeweiligen heißen Block verwendet.

Wir haben gute Ergebnisse mit Vectashield Eindeckmediums, fand aber, dass weniger SlowFade Gold-Hintergrund hat und bewahrt das Fluoreszenz-Signal für länger. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Hard-Set Eindeckmediums wie wir diese 3D-Struktur zu beeinflussen und um Luftblasen im Laufe der Zeit bilden gefunden.

Schließlich bieten hell fluoreszierenden direkt markierten Sonden zusammen mit der DNA-FISH hier beschriebene Verfahrensweise eine effiziente Lösung für stabile und schnelle Analyse von nuklearen Architektur, die für eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen ist.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Reagenz/Material
NTB-Puffer			Schritt 1.1.1 (Siehe Liste 'FISH-Puffer und Reaktionsmischungen' unten)
DTT	Invitrogen	D-1532	Schritt 1.1.1
dNTPs	Bioline	BIO-39025	Schritt 1.1.1 (Siehe Liste 'FISH-Puffer und Reaktionsmischungen' unten)
Aminoallyl-dUTP	Ambion	AM8439	Schritt 1.1.1
DNA-Polymerase I	New England Biolabs	M02095	Schritt 1.1.1
DNase I rekombinante RNase-freie	Roche	4716728001	Schritt 1.1.1
QIAquick PCR-Aufreinigungskit	Qiagen	28104	Schritt 1.1.4, 1.2.3
NaOAc	VWR	27653	Schritt 1.1.5, Schritt 2.1.1.2
NaHCO3	Sigma	S5761	Schritt 1.2.1
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks für Microarray-Anwendungen	Invitrogen (molekulare Sonden)	A32750, A32756, A32757	Schritt 1.2.2
DMSO (wasserfrei)	Sigma Aldrich	276855	Schritt 1.2.2
SYBR Safe DNA Gel-Färbung	Life Technologies	S33102	Schritt 1.2.4 (Alternative zu Ethidiumbromid)
Cot-1 DNA	Invitrogen	18440-016	Schritt 2.1.1.1 (Cot-1-DNA kann in großen Mengen selbst hergestellt werden und funktioniert genauso gut)
Einzelsträngige DNA aus Lachshoden	Sigma	D7656	Schritt 2.1.1.1
Deionisiertes Formamid	Sigma	F-9037	Schritt 2.1.1.3 (Gesundheitsgefahr)
Dextransulfat	Sigma Life Sciences	D8906	Schritt 2.1.1.4 (Siehe Liste "FISH-Puffer und Reaktionsmischungen" unten)
XMP-Malsonden	MetaSystems	000000-0528-837	Schritt 2.1.1.4
Poly-L-Lysin-beschichtete Objektträger	Sigma Aldrich	P0425	Schritt 2.1.2
Hydrophober Stift (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000	Schritt 2.1.2
70 μ m Sieb (Maus f– Nur Leberzellen)	BD Falcon	352350	Schritt 2.1.2.1
PFA	Sigma Aldrich	P6148	Schritt 2.1.3 (Entzündlich, ätzend, akute Toxizität, Gesundheitsgefahr) (Siehe Liste "FISH-Puffer und Reaktionsmischungen" unten)
Tris-Cl			Schritt 2.1.3 (Siehe Liste "FISH-Puffer und Reaktionsmischungen" unten)
Saponin aus Quillaja-Rinde	Sigma Aldrich	47036	Schritt 2.1.4, 2.1.11 (Akute Toxizität) (Siehe Liste "FISH-Puffer und Reaktionsmischungen" unten)
Triton X-100	Sigma	T9284	Schritt 2.1.4, 2.1.11 (Akute Toxizität, umweltgefährdend)
10 x PBS	Life Technologies (GIBCO)	70011-036	Schritt 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9,
Glycerin	Fisher Scientific	G/0650	Schritt 2.1.6
HCl	VWR	20252	Schritt 2.1.9 (Akute Toxizität, ätzend)
Formamid	Sigma Aldrich	47670	Schritt 2.1.14, 2.2.3 (Gesundheitsgefahr)
SSC			Schritt 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Siehe Liste "FISH-Puffer und Reaktionsgemische" unten)
Deckgläser 22 x 22	Menzel-Glaser	BB022022A1	Schritt 2.1.15
Deckgläser 22 x 50	Menzel-Glaser	BB022050A1	Stufe 2.1.15
Gummizement	Marabu	2901 (10 000)	Stufe 2.1.15 (Entzündlich, Gesundheitsgefahr, Gefahr für die Umwelt)
DAPI	Invitrogen Molekulare Sonden	D3571	Stufe 2.2.8 (Gesundheitsgefahr)
SlowFade Gold	Invitrogen	S36936	Stufe 2.2.10 (Einbettmedium)
Klarer Nagellack	Beliebig		Schritt 2.2.10
Ausrüstung
Nanodrop 2000	Thermo Scientific		Schritt 1.1.6, 1.2.4 (Mikrovolumenspektroskopie)
Typhoon FLA 7000 Phosphoimager	GE Life Sciences		Schritt 1.2.4
Coplin-Gläser	Sigma-Aldrich	S6016 (6EA)/S5516 (6EA)	Schritt 2.1.3 und höher
Dewar von flüssigem Stickstoff	Beliebiger Lieferant		Schritt 2.1.7
Sockel mit schwarzem Deckel (lichtdichte Kammer)	Simport	M920-2	Stufe 2.1.17
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355 000.011	Stufe 2.2.3 (oder Schüttler in einem 37 Grad verwenden; C-Raum)
Bildgebung und Bildverarbeitung
Metafer - Plattform für die Automatisierung der Bildgebung	MetaSystems		automatisierte Bildgebungssoftware
MetaCyte - Automatisierte Interphase-FISH-Analyse	MetaSystems		automatisierte Bildgebungssoftware
Axio Imager Z2	Zeiss-Epifluoreszenzmikroskop
IX81 Konfokalmikroskop (FV1000)Konfokalmikroskop	Olympus
Bitplane, Version 7.3	Imaris		Bildanalyse- und 3D-Modellierungssoftware
Wissenschaftlicher Band Imaging, Version 4.1	Huygens		Bildanalyse- und Dekonvolutionssoftware
FISH-Puffer und Reaktionsmischungen Name Composition Comments 10 x NTB-Puffer 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5 0,05 M MgCl2 0,5 mg/ml BSA dNTP Mix 0.5 mM dGTP Store 50 μ l Aliquoten bei -20 ° C 0,5 mM dATP 0,5 mM dCTP 0,125 mM dTTP 4 % PFA Wiegen Sie 4 g/100 ml PFA in PBS und erhitzen Sie es auf 62 μC. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH auf 7,0 ein, um das verbleibende PFA aufzulösen. 50 ml Aliquots bei -20 μd; C, nicht wieder einfrieren 2 %ige Saponinlösung 2 g Saponin pro 100 ml PBS durch längeres Rühren auflösen. Lösen Sie den pH-Wert auf und stellen Sie ihn mit NaOH auf 7,0 ein. Mit ddH20 auf 1 l bringen und autoklavieren. 5 ml Aliquots bei -20 ° C 20 x SSC 175,3 g NaCl und 88,2 g Natriumcitrat abwiegen und zu 80 ml ddH20 geben. Lösen Sie den pH-Wert auf und stellen Sie ihn mit NaOH auf 7,0 ein. Mit ddH20 auf 1 l bringen und autoklavieren. Dextransulfat-Mix 20 % Dextransulfat in 2 x SSC-Puffer; Die Lösung verquirlen und über Nacht auf einer Wippe mischen. Store 500 μ l Aliquoten bei -20 ° C