Summary
Qui mostriamo come citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei funghi patogeni in associazione con cellule ospiti in coltura. Questa tecnica può essere utilizzata come alternativa al CFU enumerazione.
Abstract
Studi dei meccanismi di patogenesi cellulari di lieviti patogeni come la Candida albicans, capsulatum Histoplasma e Cryptococcus neoformans comunemente impiegano infezione di ospiti mammiferi o cellule ospitante (cioè macrofagi) seguita da quantificazione lievito utilizzando formanti colonie analisi unità o citometria a flusso. Mentre unità formanti colonia enumerazione è stato il metodo più comunemente utilizzato in campo, questa tecnica ha degli svantaggi e limitazioni, tra cui lenta crescita di alcune specie fungine su supporti solidi ed efficienze basse e / o variabile placcatura, il che è di particolare interesse quando si confrontano crescita di ceppi wild-type e mutanti. Citometria di flusso può fornire informazioni quantitative relative rapida vitalità del lievito, tuttavia, adozione mediante citometria a flusso per lieviti patogeni è stato limitato per una serie di ragioni pratiche tra cui il suo biosicurezza considerazioni costo elevato e. Qui, dimostriamo una immagine basata sumetodologia citometria utilizzando la Vision Cellometer (Nexcelom Bioscience, LLC) per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali in co-coltura con macrofagi. I nostri studi si concentrano sulla individuazione di due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum colonizza macrofagi alveolari replicando all'interno del phagosome macrofagi, e qui, abbiamo quantitativamente valutare la crescita di H. lieviti capsulatum in macrofagi RAW 264.7 con arancio di acridina / ioduro di propidio colorazione in combinazione con citometria immagine. Il nostro metodo fedelmente ricapitola i trend di crescita, misurata dalla colonia tradizionale formando unità di enumerazione, ma di un significativo aumento della sensibilità. Inoltre, valutiamo direttamente infezione di macrofagi in diretta con un ceppo GFP che esprimono di C. albicans. La nostra metodologia offre un mezzo rapido, preciso ed economico per il rilevamento e la quantificazione di importanti funghi patogeni umani in associazione spiritocellule ospiti h.
Introduction
Studi di funghi patogeni, in associazione con i loro ospiti e / o le cellule ospiti richiedono spesso quantificazione delle cellule fungine vitali corso di un corso di tempo o in diverse condizioni di infezione. Enumerazione di unità formanti colonie (CFU) è il metodo standard con cui è stato misurato il numero di cellule vitali fungine, tuttavia, questa tecnica presenta diversi inconvenienti e limitazioni. In primo luogo, molte specie fungine sono a crescita lenta. La crescita di colonie visibili su terreni solidi può richiedere 1-2 settimane, rallentando notevolmente il ritmo della ricerca. Secondo, manipolazione dei campioni durante CFU placcatura è un processo laborioso, da alcuni diluizioni devono essere placcati per assicurare un numero numerabile di colonie. Terzo, il numero di CFU è tipicamente inferiore al numero di organismi vitali piastrate poiché il rendimento placcatura è ben inferiore al 100%. Ad esempio, l'efficienza di placcatura per il dimorfismo fungino agente patogeno capsulatum Histoplasma può essere alto come il 90%, ma sono di routine a partire da30% e sono ancora più basso (10%) per il relativo fungina dimorph Paracoccidioides brasiliensis 1, 2. Efficienza placcatura per la Candida albicans è soggetto a variabilità 3. Infine, l'analisi CFU rappresenta solo cellule vive e dividendo attivamente capaci di instaurare crescita su terreno solido, mentre in molti casi, sarebbe utile per determinare la presenza e la concentrazione di cellule inattive morte e / o metabolicamente.
In precedenza, i metodi di citometria a flusso per la quantificazione dei vari patogeni specie fungine è stata descritta 4-6. Tuttavia, a causa di problemi di contenimento biosicurezza coinvolti utilizzando il livello di biosicurezza 2 (BSL2) o patogeni BSL3 livello sul citofluorimetri condivisi, l'adozione di questa tecnica è stato limitato. Come la citometria a flusso, citometria immagine è un metodo sensibile e rapido di quantificazione delle cellule. Tuttavia, citometria immagine può essere eseguita ad una frazione del costo con risultati paragonabili 7 -11. Qui, descriviamo i metodi per l'esecuzione di citometria a immagine di funghi patogeni in associazione con cellule ospiti. Dimostriamo nostri metodi che utilizzano due funghi patogeni umani: capsulatum Histoplasma e Candida albicans H.. capsulatum è un patogeno fungino dimorphic che causa la malattia respiratoria, negli esseri umani, cresce come lievito in erba e si replica all'interno di macrofagi alveolari Candida albicans è una specie commensali umani che causano occasionalmente candidosi.. Abbiamo dimostrato che la citometria a immagine consente una rapida quantificazione di questi lieviti, insieme con la capacità di visualizzazione.
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Protocol
1. L'infezione dei macrofagi con H. capsulatum, C. albicans
- 16 ore prima dell'infezione, macrofagi sementi alla densità desiderata in piastre da 24 pozzetti. In questo protocollo, è stata utilizzata una densità di 3,0 x 10 5 cellule / pozzetto.
- Aggiungi cellule fungine in fase di crescita logaritmica ad una molteplicità desiderato di infezione (MOI). Questo protocollo può accogliere una gamma di MOI (0,2-5,0). Per l'infezione di macrofagi RAW264.7 con H. capsulatum, abbiamo utilizzato un MOI di 0,2.
- Seguendo 1,5 ore per permettere la fagocitosi, i macrofagi lavare tre volte con PBS per rimuovere funghi extracellulari.
- Incubare per numero desiderato di ore prima dell'analisi del campione. A partire MOI (0,2 nel nostro esperimento), cellule di macrofagi infettati rimangono vitali per diversi giorni, ed i campioni possono essere analizzati circa ogni 12-24 hr.
2. Macrofago Lysis
- Per liberare i funghi da macrofagi, rimuovere i supporti, lavare 3 volte con PBS, eaggiungere 0,5 ml di acqua sterile. In queste condizioni, i macrofagi e lisare cellule fungine rimarranno intatti.
- Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferimento lisato di provetta sterile, tenere in ghiaccio.
- Trasferire 20 microlitri di lisato un tubo separato, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: "Preparazione del campione per analisi di citometria immagine"
3. CFU placcatura
- Eseguire dieci volte diluizione dei lisati (dal punto 2.3) in media.
- Tavola 100 ml di ogni diluizione, in duplice copia, su piastre HMM-agarosio. Incubare le piastre in una camera umidificata a 37 ° C con 5% di CO 2 per 7-8 giorni.
- Contare manualmente le colonie su piastre di visualizzazione di un minimo di 100 e un massimo di 1.000 colonie distinte.
4. Visualizzazione dei funghi all'interno dei macrofagi in diretta
- Per raccogliere i macrofagi vivo, lavare le cellule 3 volte con PBS. Aggiungere 0,5 ml di PBS e incubare per 30 min a 4 ° C.
- Per rimuovere i macrofagi da pozzetti di coltura dei tessuti, pipettare delicatamente su e giù parecchie volte. Trasferimento liquido provetta sterile, tenere in ghiaccio.
- Trasferire 20 ml del campione in una provetta separata, quindi aggiungere 20 microlitri AO / soluzione di PI. Passare direttamente al punto 5: "Preparazione del campione per analisi di citometria immagine".
5. Preparazione del campione per l'analisi di citometria Immagine
- Pipettare accuratamente il campione di riferimento e quindi trasferire 20 ml di campione nella camera di conta cellulare usa e getta.
- Permettono alle cellule di stabilirsi nella camera per 30 sec.
- Inserire il conteggio da camera nel citometro immagine.
6. Configurazione strumento Cellometer
- Inserire l'ottica di fluorescenza Moduli: VB-535-402 e VB-660-502 nel sistema e fare in modo che siano bloccati in posizione.
- VB-535-402 (eccitazione a 475 nm, emissione a 535 nm) è utilizzato per il rilevamento e arancio acridina GFP.
- VB-660-502 (excitation a 540 nm, emissione a 660 nm) è utilizzato per il rilevamento ioduro di propidio.
- Accendere il citometro immagine e aprire il software di accompagnamento.
7. Software Setup Cellometer
- Selezionare il preset "Reazione" e "Tipo di cella" nel menu a scomparsa del saggio.
- Per la viabilità, il saggio è ottimizzato per arancio di acridina e la rilevazione ioduro di propidio.
- Per il rilevamento di infezione da Candida albicans, il saggio è ottimizzato per il rilevamento GFP.
- Selezionare "Opzioni" nella parte superiore e fare clic su "Sfondo prendere l'immagine", e consentire il completamento dell'operazione.
- Fare clic su "Anteprima Bright-Campo di immagine".
8. Acquisizione di immagini di Procedura
- Inserire la camera del campione preparato nel citometro immagine.
- Utilizzare la manopola di messa a fuoco e regolare la messa a fuoco.
- Una volta a fuoco, fare clic su "Conte", e consentire l'operazione di acquisizione di immagini da completare.
- Remove la camera di conteggio monouso e smaltire in modo appropriato.
9. Immagine Data Analysis
- La concentrazione e la misurazione della vitalità
- Una volta che il conteggio è completato, la concentrazione e la vitalità delle cellule bersaglio vengono visualizzati nella pagina di risultato.
- Fare clic su "Esporta" per esportare i dati in FCS Express 4 per l'analisi popolazione di cellule GFP nel esperimento infezione da Candida albicans.
- FCS analisi express di Candida albicans cellule infette
- Importare il file ". NXDAT" in FCS Express 4 e riportare i risultati in un istogramma di fluorescenza.
- Applicare cancello popolazione cellulare per l'istogramma per determinare le percentuali di popolazione di Candida albicans cellule infette.
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Representative Results
Abbiamo usato il Cellometer Vision immagine citometro a monitorare la crescita di H. capsulatum in macrofagi. 264.7 cellule RAW sono state infettate con H. cellule di lievito capsulatum e in vari momenti, i campioni sono stati sottoposti ad AO / PI colorazione seguita da analisi di citometria basata sulle immagini. In parallelo, i campioni sono stati analizzati con tradizionale enumerazione CFU. Ad ogni tempo, i campioni sono stati incubati in acqua per lisare macrofagi e le cellule di lievito sono state identificate liberate dal software Vision Cellometer (Figure 1a e 1b). Osserviamo tendenze altamente comparabili nella concentrazione di lieviti vitali come rilevato dalla citometria basata sulle immagini e CFU enumerazione in ogni fase (figura 1c). Come previsto, il numero assoluto di lieviti vivi rilevati da AO / PI colorazione è stato costantemente superiore al numero di lieviti capaci di formazione di colonie su terreno solido come valutato mediante analisi di CFU, evidenziando segnonumeri ificant di cellule vitali ma non coltivabili.
Visualizzazione di cellule fungine all'interno di macrofagi tensione può essere realizzato utilizzando GFP che esprimono ceppi di lievito. Macrofagi del midollo osseo-derivati (BMDM) sono stati infettati con C. cellule di lievito albicans esprimenti proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore di ADH1 12 (figura 2a). L'infezione di BMDM con GFP-C. albicans lieviti a molteplicità di infezione (MOI) che vanno 0,1-10 corrispondevano ad aumenti incrementali di intensità GFP all'interno dei macrofagi infetti (Figura 2a), così come la percentuale totale dei macrofagi infetti (Figura 2b).
Figura 1. Confronto di analisi di citometria basata sull'immagine per CFU enumerazione di H. capsulatum durante l'infezione in vitro di macrofagi RAW 264.7. (a) macrofagi RAW 264.7 sono stati infettati con H. lieviti capsulatum ad una MOI di 0,2. A distanza di 24 ore intervalli dopo l'infezione, i macrofagi sono stati lisati e lieviti vitali valutati da AO / PI colorazione in parallelo con CFU enumerazione. (B) Rappresentante campo chiaro (BR) e FL1/FL2 (verde / rosso) immagini combinate di AO / PI macchiato H . capsulatum rilasciato da lisati macrofagi RAW 264.7. Un algoritmo di segmentazione contava solo AO e PI lieviti positivi nelle immagini fluorescenti, mentre le grandi PI macchiati di macrofagi RAW 264.7 (rosso) sono esclusi. Le immagini sono state catturate con un ingrandimento di 10 volte. (C) il confronto diretto di lievito proliferazione come valutato da AO / PI colorazione e CFU enumerazione. Analisi di regressione lineare delle tendenze di crescita come misurato da CFU e analisi Cellometer resa R 2 = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "target =" _blank "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Figura 2. Quantificazione di infezione con un ceppo BMDM GFP che esprimono di C. albicans. (a) Captured campo chiaro (BR) (in alto) e fluorescenti (al centro) immagini di GFP-C. albicans infettati BMDMs ad aumentare MOI. Istogrammi di intensità di fluorescenza mostrano un aumento dell'intensità di fluorescenza GFP come i MOI aumenta, il che rappresenta un aumento del numero C. albicans associati con le cellule BMDM (in basso). Il software ha identificato BMDMs infetti sulla base di applicazione di una marcatura lineare l'intensità di fluorescenza di base visualizzata dalla popolazione di controllo non infetto (MOI = 0). (B) Percentuale infection in funzione di MOI, che mostra un aumento BMDMs infetti come MOI aumenta. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
Citometria a immagine consente di catturare immagini di alta qualità e, utilizzando software specializzati, eseguire una rapida quantificazione delle cellule. Una sfida potenziale all'adozione di citometria immagine nel campo della patogenesi microbica è che sono presenti in una popolazione mista di cellule, comprese le cellule ospiti di mammifero i microbi da contare. Qui, dimostriamo che citometria immagine può essere utilizzato per la quantificazione dei lieviti patogeni vitali durante l'infezione in vitro dei macrofagi. La nostra metodologia non solo fedelmente ricapitola le tendenze in crescita fungina e la vitalità osservato durante in vitro dei macrofagi saggi di infezione, ma mostra anche maggiore sensibilità rispetto al tradizionale saggio di CFU 13.
Citometria Immagine offre diversi vantaggi pratici rispetto sia con enumerazione CFU o citometria a flusso per la quantificazione delle cellule di lievito. Quando placcatura CFU, personale di laboratorio deve piastra parecchi dilutioni al fine di garantire un numero numerabile di celle su ogni piatto, che può essere molto alta intensità di lavoro. Citometria immagine elimina la necessità di più diluizioni. In precedenza, abbiamo dimostrato che la formazione di colonie su terreno solido è spesso variabile, ed a concentrazioni molto basse funghi possono non riuscire a formare colonie affatto, mentre citometria immagini consente enumerazione di cellule indipendentemente dalla concentrazione di 13. La capacità di rilevare e contare i funghi a concentrazioni molto basse può essere molto utile durante le prime fasi di una infezione a basso dosaggio, o durante il gioco, quando i numeri e la sostenibilità può essere al margine della rilevazione. Inoltre, i dati generati mediante citometria di immagine sono disponibili immediatamente, mentre le colonie possono richiedere diversi giorni per diventare visibili. Mentre molte specie fungine possono essere rilevati mediante citometria di flusso, la possibilità di contaminazione crociata è una preoccupazione in servizi in comune. La camera contaglobuli utilizzato in questo studio offre un vantaggio significativo in termini di biosicurezza, come è disposabLe e indipendente. Inoltre, citometria immagine offre i vantaggi pratici del prezzo inferiore e un ingombro inferiore rispetto a citometria di flusso convenzionale, che può essere importante per laboratori di ricerca minori 11.
Oltre ai vantaggi pratici, citometria a immagine di cellule di lievito vengono fornite informazioni CFU enumerazione non può. Prima, CFU enumerazione è solo in grado di rilevare i funghi che sono in grado di stabilire la crescita colonia sul mezzo scelto, che può non rappresentare esattamente il numero di funghi vitali presenti in un esperimento un'infezione in tempo reale. Inoltre, la possibilità di stabilire la crescita di colonie su terreno solido può differire confrontando ceppi wild-type e mutanti di funghi, che può essere una fonte di distorsione sperimentale 14, e questi pregiudizi nascosti può essere rivelata dal confronto di citometria immagine e quantificazione dei CFU ceppi wild-type e mutanti. Una volta che il comportamento di un particolare ceppo è stato caratterizzato da bo° CFU enumerazione e citometria immagine, riteniamo che la citometria immagine può essere utilizzata come un mezzo alternativo di quantificazione fungina.
Una limitazione di citometria immagine in generale è che non permette di raccolta come numero di punti dati citometria a flusso. Poiché il citometro immagine deriva dati quantitativi provenienti da un numero limitato di immagini catturate, è difficile per il sistema di raccogliere dati su centinaia di migliaia a milioni di cellule per campione. Tuttavia, questa limitazione può essere aggirata raggruppando campioni multipli in un set di dati per l'analisi al fine di raggiungere punti dati simili a quelli di un citometro a flusso. Vorremmo inoltre sottolineare che il metodo di colorazione AO / PI usata qui rappresenta un parametro di valutazione della vitalità cellulare, e non indica necessariamente la vitalità cellulare e / o la capacità di stabilire una crescita su terreno solido in un dato campione. Pertanto, mentre il nostro metodo fornisce un metodo facile di quantificazione vivo / morto di lieviti, essasarà anche interessante indagare l'uso di citometria immagine in combinazione con indicatori metabolismo cellulare come FUN-1 15.
Software citometria immagine identifica e conta cellule di interesse in base a forma e dimensione, e perciò, è assolutamente critico che questi parametri sono impostati con cura durante ogni esperimento. Quando si esegue citometria immagine con un nuovo ceppo di lievito, suggeriamo che un primo confronta dati generati da una coltura pura di lievito di dati generati dal conteggio una miscela di lieviti, più cellule ospiti per assicurare che i parametri vengono impostati in modo che il software può distinguere tra i due tipi di cellule.
In futuro, questo lavoro sarà la base per l'ulteriore sviluppo di metodi per rilevare e quantificare i microbi mediante citometria immagine. Per esempio, lo sviluppo di metodi di citometria di immagine per rilevare funghi entro omogenati di organi sarà di grande utilità nel campo. Un'altra sfida futura sarà quella di develop e perfezionare i metodi di citometria di immagine e software tale che può essere usato per la quantificazione delle cellule batteriche. Con l'avanzamento in sistemi ottici, fotocamere digitali, e una grande varietà di macchie fluorescenti in campo, la capacità di immagine e analizzare popolazione batterica può essere implementato in citometri di immagine, che può fornire un metodo più rapido per la concentrazione e vitalità o vitalità misurazione in confronto al CFU o metodi di densità ottica. In sintesi, il lavoro qui presentato è un proof-of-concept mostrando che citometria immagine è un metodo sensibile per la quantificazione dei lieviti patogeni. La sofisticazione del software di analisi di citometria image-based offre l'opportunità di analizzare le interazioni tra le cellule ospiti e funghi patogeni in un modo altamente quantitativa. Questa tecnologia può essere atto a risolvere una serie di domande di ricerca nel campo della patogenesi fungine.
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Disclosures
Gli autori Leo Li-Ying Chan e Benjamin Paradis sono dipendenti di Nexcelom Bioscience LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
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