Summary
هنا، علينا أن نظهر كيف الخلوي صورة يمكن استخدامها لتقدير حجم الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة في الثقافة. هذه التقنية يمكن استخدامها كبديل للتعداد كفو.
Abstract
دراسات الآليات المرضية الخلوية من الخمائر المسببة للأمراض مثل المبيضات البيض، المغمدة المغمدة، والمستخفية المورمة عادة توظف إصابة الجنود الثدييات أو الخلايا المضيفة (أي الضامة) تليها الكمي باستخدام الخميرة مستعمرة تشكيل وحدة التحليل أو التدفق الخلوي. في حين كانت مستعمرة تشكيل وحدة التعداد الأسلوب الأكثر استخداما في هذا المجال، هذا الأسلوب له عيوب وأوجه القصور، بما في ذلك النمو البطيء لبعض الأنواع الفطرية على وسائل الاعلام الصلبة والكفاءة الطلاء منخفض و / أو المتغير، والذي هو مصدر قلق خاص عند مقارنة النمو من السلالات البرية من نوع ومتحولة. يمكن التدفق الخلوي توفير معلومات كمية سريع بشأن جدوى الخميرة، ومع ذلك، اعتماد تدفق cytometric الكشف عن الخمائر المسببة للأمراض كان محدودا لعدد من الأسباب العملية بما في ذلك تكاليف عالية واعتبارات السلامة الأحيائية. هنا، علينا أن نبرهن على الصورة القائمة علىمنهجية cytometric باستخدام الرؤية Cellometer (Nexcelom العلوم البيولوجية، LLC) لتقدير حجم الخمائر المسببة للأمراض قابلة للحياة في الثقافة المشتركة مع الضامة. تركز دراساتنا على الكشف عن مسببات الأمراض الفطرية اثنين الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة يستعمر الضامة السنخية بواسطة تكرار داخل يبلوع بلعم، وهنا، ونحن كميا تقييم نمو H. الخمائر المغمدة في RAW 264.7 الضامة باستخدام أكريدين البرتقال / propidium تلطيخ يوديد في تركيبة مع صورة الخلوي. لدينا وسيلة بأمانة اتجاهات النمو يلخص مقاسا مستعمرة التقليدية تشكيل وحدة التعداد، ولكن مع زيادة كبيرة حساسية. بالإضافة إلى ذلك، نقوم بتقييم مباشرة إصابة الضامة العيش مع سلالة GFP، معربا عن من C. البيض. يقدم منهجية لدينا وسيلة سريعة ودقيقة، واقتصادية للكشف والقياس الكمي لمسببات الأمراض الفطرية الهامة الإنسان في جمعية الطرافةالخلايا المضيفة ح.
Introduction
وغالبا ما تتطلب دراسات من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع مضيفيهم و / أو الخلايا المضيفة الكمي للخلايا قابلة للحياة الفطرية على دوام أو في ظل ظروف العدوى المختلفة. تعداد الوحدات تشكيل مستعمرة (كفو) هو الأسلوب المعيار الذي تم قياسه عدد الخلايا الفطرية قابلة للحياة، ولكن هذا الأسلوب له عيوب عدة والقيود. الأولى، العديد من الأنواع الفطرية هي بطيئة النمو. نمو المستعمرات مرئية على وسائل الاعلام الصلبة يمكن أن تأخذ 1-2 أسابيع، وتباطؤ ملحوظ وتيرة البحوث. الثانية، والتلاعب في عينات خلال كفو الطلاء هو عملية شاقة، حيث يجب أن يتم مطلي عدة التخفيفات لضمان وجود عدد معدود من المستعمرات. الثالث، وعدد من كفو أقل عادة من عدد من الكائنات قابلة للحياة مطلي لأن كفاءة الطلاء هو أقل بكثير من 100٪. على سبيل المثال، يمكن أن الكفاءة تصفيح لديمبرافيك الفطرية المغمدة النوسجة الممرض يكون مرتفعا كما 90٪، ولكن بشكل روتيني منخفضة مثل30٪ و هي أقل من (10٪) للذات صلة الفطرية dimorph نظيرة الكروانية البرازيلية 1، 2. كفاءة الطلاء عن المبيضات البيض هي أيضا عرضة للتقلب 3. وأخيرا، يمثل تحليل كفو للخلايا الحية فقط وتقسيم بنشاط قادرة على إنشاء النمو على وسائل الاعلام الصلبة، في حين، سيكون من المفيد في كثير من الحالات لتحديد وجود وتركيز من الخلايا الميتة غير نشط و / أو عملية الأيض.
سابقا، وقد وصفت وسائل تدفق cytometric لتقدير من العديد من الأنواع الفطرية المسببة 4-6. ولكن نظرا لاحتواء قضايا السلامة الأحيائية المشاركة مع استخدام مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) أو مسببات الأمراض على مستوى BSL3 على أجهزة قياس التدفق الخلوي المشتركة، واعتماد هذا الأسلوب كانت محدودة. مثل التدفق الخلوي، الخلوي الصورة هي طريقة حساسة وسريعة الكمي الخلية. ومع ذلك، الخلوي صورة لا يمكن أن يؤديها في جزء صغير من التكلفة مع نتائج مماثلة 7 -11. هنا، نحن تصف الأساليب لأداء الخلوي صورة من الفطريات المسببة للأمراض بالاشتراك مع الخلايا المضيفة. علينا أن نظهر طرقنا باستخدام اثنين من مسببات الأمراض الفطرية الإنسان: المغمدة النوسجة والمبيضات البيض H.. المغمدة هو الممرض الفطرية ديمبرافيك التي تسبب أمراض الجهاز التنفسي؛ في البشر، وأنها تنمو الخميرة في مهدها كما ويعيد داخل الضامة السنخية المبيضات البيض هي الأنواع المتعايشة الإنسان التي تسبب أحيانا المبيضات. وتبين لنا أن صورة الخلوي يسمح الكمي السريع لهذه الخمائر، جنبا إلى جنب مع القدرة على التصور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إصابة الضامة مع H. المغمدة، C. البيض
- 16 ساعة قبل العدوى، الضامة البذور في الكثافة المطلوبة في 24 لوحات جيدة. في هذا البروتوكول، تم استخدام كثافة من 3.0 × 10 5 خلايا / جيد.
- إضافة الخلايا الفطرية في النمو مراحل سجل في تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية). يمكن هذا البروتوكول استيعاب مجموعة من وزارة الداخلية (0،2-5،0). لإصابة RAW264.7 الضامة مع H. المغمدة، استخدمنا وزارة الداخلية من 0.2.
- بعد 1.5 ساعة للسماح للالبلعمة، وغسل الضامة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لإزالة الفطريات خارج الخلية.
- احتضان لمدة العدد المطلوب من ساعة قبل تحليل العينة. في وزارة الداخلية منخفضة (0.2 في تجربتنا)، تبقى خلايا البلاعم المصابة قابلة للحياة لعدة أيام، ويمكن تحليل عينات تقريبا كل 12-24 ساعة.
2. تحلل بلعم
- لتحرير الفطريات من خلايا البلاعم، وإزالة وسائل الإعلام، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني، وإضافة 0.5 مل ماء معقم. في ظل هذه الظروف، وسوف الضامة ليز وستبقى الخلايا الفطرية سليمة.
- احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- نقل المحللة إلى أنبوب العقيمة، والحفاظ على الجليد.
- نقل 20 ميكرولتر المحللة إلى أنبوب منفصل، ثم إضافة 20 ميكرولتر AO / حل PI. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5: "إعداد نموذج لصورة التحليل Cytometric"
3. كفو تصفيح
- أداء تخفيف عشرة أضعاف من لست] (من الخطوة 2.3) في وسائل الإعلام.
- لوحة 100 ميكرولتر من كل تخفيف من نسختين، على لوحات HMM-الاغاروز. احتضان لوحات في غرفة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 لمدة 7-8 أيام.
- العد يدويا المستعمرات على لوحات عرض ما لا يقل عن 100 وبحد أقصى 1،000 المستعمرات متميزة.
4. التصور للفطريات داخل الضامة لايف
- لجمع الضامة الحية، وغسل الخلايا 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 مل PBS واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- لإزالة الضامة من الآبار وزراعة الأنسجة، ماصة بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. نقل السائل إلى أنبوب العقيمة، والحفاظ على الجليد.
- نقل 20 ميكرولتر عينة إلى أنبوب منفصل، ثم إضافة 20 ميكرولتر AO / حل PI. الانتقال مباشرة إلى الخطوة 5: "إعداد نموذج لصورة التحليل Cytometric".
5. إعداد العينات للتحليل صورة Cytometric
- ماصة العينة المستهدفة بدقة ومن ثم نقل 20 ميكرولتر من العينة إلى الخلية القابل للتصرف غرفة الفرز.
- تسمح للخلايا ليستقر في غرفة لمدة 30 ثانية.
- إدراج عد غرفة في عداد الكريات الصورة.
6. إعداد الصك Cellometer
- إدراج بصريات الإسفار الوحدات: VB-535-402 وVB-660-502 في النظام والتأكد من انهم محبوسون في المكان.
- VB-535-402 (الإثارة في 475 نانومتر، والانبعاثات عند 535 نانومتر) يستخدم لأكريدين البرتقال وكشف GFP.
- VB-660-502 (excitatiعلى 540 نانومتر في، يتم استخدام الانبعاثات في 660 نانومتر) لكشف يوديد propidium.
- بدوره على عداد الكريات الصورة وفتح البرنامج المرافق.
7. إعداد البرامج Cellometer
- حدد مسبقا "نوع الفحص" و "نوع من الخلايا" في القائمة المنسدلة الفحص.
- للبقاء، هو الأمثل لفحص للأكريدين البرتقال وكشف يوديد propidium.
- للكشف عن عدوى المبيضات البيض، هو الأمثل لفحص للكشف عن GFP.
- حدد "خيارات" في أعلى وانقر على "خذ صورة الخلفية"، والسماح للعملية لإكمال.
- انقر على "معاينة الصورة مشرق الميدان".
8. صورة اكتساب الداخلي
- إدراج حجرة العينة المعدة في عداد الكريات الصورة.
- استخدام مقبض التركيز وضبط التركيز.
- مرة واحدة في التركيز، انقر على "الكونت"، والسماح للعملية الحصول على الصور لإكمال.
- ريموهاء الدائرة العد القابل للتصرف والتصرف بشكل مناسب.
9. صورة تحليل البيانات
- تركيز وقياس الجدوى
- بمجرد الانتهاء من عملية فرز، يتم عرض التركيز وقابلية الخلايا المستهدفة في صفحة نتائج.
- انقر على "تصدير" لتصدير البيانات إلى FCS اكسبرس 4 لتحليل السكان خلية من خلايا GFP في التجربة عدوى المبيضات البيض.
- FCS تحليل سريع من المبيضات البيض الخلايا المصابة
- استيراد ". NXDAT" الملف إلى FCS اكسبرس 4 ومؤامرة النتائج في الرسم البياني مضان.
- تطبيق بوابة سكان الخلية إلى الرسم البياني لتحديد نسب السكان من المبيضات البيض الخلايا المصابة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمنا صورة الرؤية Cellometer عداد الكريات لمراقبة نمو H. المغمدة في خلايا البلاعم. أصيب الخلايا 264.7 RAW مع H. خلايا الخميرة المغمدة وعند نقاط زمنية مختلفة، وتعرض العينات لAO / PI تلطيخ تليها تحليل cytometric المستندة إلى الصورة. في موازاة ذلك، تم تحليل عينات من قبل العد كفو التقليدية. في كل نقطة زمنية، وحضنت العينات في الماء لليز الضامة، كما تم تحديد خلايا الخميرة المحررة بواسطة برنامج الرؤية Cellometer (أرقام 1A 1B و). نلاحظ اتجاهات مماثلة للغاية في تركيز الخمائر قابلة للحياة كما الكشف عنها بواسطة تحليل cytometric المستندة إلى الصورة والعد كفو في كل نقطة زمنية (الشكل 1C). كما هو متوقع، كان العدد المطلق للالخمائر الحية الكشف عنها بواسطة AO / PI تلطيخ أعلى باستمرار من عدد من الخمائر قادرة على تشكيل مستعمرة على المتوسط الصلبة وفقا لتقييم التحليل كفو، وتسليط الضوء علامةأرقام ificant من خلايا قابلة للحياة ولكن غير الصالحة للزراعة.
التصور من الخلايا الفطرية داخل الضامة الحية يمكن إنجازه باستخدام GFP، معربا عن سلالات الخميرة. أصيب العظام نخاع المستمدة الضامة (BMDM) مع C. خلايا الخميرة البيض التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) تحت سيطرة المروج ADH1 12 (الشكل 2A). إصابة BMDM مع GFP-C. البيض الخمائر في مولتيبليكيتييس من العدوى (وزارة الداخلية) تتراوح ،1-10 يتفق مع زيادات تدريجية في كثافة GFP داخل الضامة المصابة (الشكل 2A)، وكذلك نسبة مجموع الضامة المصابة (الشكل 2B).
الشكل 1. مقارنة بين تحليل cytometric القائم على الصورة لكفو تعداد H. المغمدة خلال عدوى في المختبر من RAW 264.7 الضامة. (أ) أصيب RAW 264.7 الضامة مع H. الخمائر المغمدة في وزارة الداخلية من 0.2. في 24 ساعة بعد فترات العدوى، هي lysed الضامة والخمائر قابلة للحياة المقررة من قبل AO / PI تلطيخ بالتوازي مع كفو التعداد. (ب) الممثل brightfield (BR) وFL1/FL2 (أخضر / أحمر) الصور مجتمعة AO / PI الملون H . المغمدة أفرج عنه من هي lysed RAW 264.7 الضامة. خوارزمية تجزئة تحسب فقط AO وPI الخمائر إيجابية في الصور الفلورسنت الوقت ويستثنى من كبير PI الملطخة RAW 264.7 الضامة (الحمراء). تم القبض على الصور تحت التكبير 10X. (ج) المقارنة المباشرة لانتشار الخميرة وفقا لتقييم AO / PI تلطيخ والعد كفو. تحليل الانحدار الخطي للاتجاهات النمو مقاسا كفو والعائد تحليل Cellometer R 2 = 0.9927./ files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لعرض أكبر شخصية.
الشكل 2. الكمي للعدوى BMDM مع سلالة GFP، معربا عن من C. البيض (أ) الملتقطة brightfield (BR) (أعلى) والفلورية (وسط) صور GFP-C. البيض مصابة BMDMs إلى زيادة زارة الداخلية. رسوم بيانية للكثافة مضان تظهر زيادة في كثافة مضان GFP باسم وزارة الداخلية الزيادات، وهو ما يمثل زيادة في عدد C. البيض المرتبطة الخلايا BMDM (القاع). التعرف على البرامج BMDMs المصابة يعتمد على تطبيق علامة خطية في كثافة مضان خط الأساس الذي أبداه سكان السيطرة المعافين (وزارة الداخلية = 0). (ب) النسبة infectioن بوصفها وظيفة من وزارة الداخلية، مما يدل على زيادة في BMDMs المصابة كما MOI الزيادات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
صورة الخلوي يسمح للمستخدم التقاط صور ذات جودة عالية و، وذلك باستخدام البرمجيات المتخصصة، نفذ الكمي السريع للخلايا. واحد تحديا محتملا لاعتماد الخلوي صورة في مجال الجراثيم المرضية هو أن الميكروبات لفرزها موجودة في يسكنها خليط من الخلايا، بما في ذلك الخلايا المضيفة الثدييات. هنا، علينا أن نبرهن على الخلوي صورة يمكن استخدامها لتقدير حجم الخمائر المسببة للأمراض قابلة للحياة خلال عدوى في بلعم المختبر. منهجيتنا ليس فقط بأمانة يلخص الاتجاهات في نمو الفطريات وقدرتها على البقاء لوحظ خلال فحوصات في المختبر بلعم العدوى، ولكن يعرض أيضا تحسين حساسية بالمقارنة مع فحص كفو التقليدية 13.
صورة الخلوي يوفر العديد من المزايا العملية بالمقارنة مع تعداد إما كفو أو التدفق الخلوي لتقدير حجم خلايا الخميرة. عندما الطلاء CFUs، يجب أن العاملين في المختبرات لوحة عدة مخففالأيونات من أجل ضمان وجود عدد معدود من الخلايا في كل لوحة، والتي يمكن أن تكون كثيفة العمالة جدا. الخلوي صورة يلغي الحاجة إلى التخفيفات متعددة. سابقا، لقد أظهرنا أن تشكيل مستعمرة على وسائل الاعلام الصلبة غالبا ما يكون متغير، وبتركيزات منخفضة جدا الفطريات قد تفشل لتشكيل مستعمرات في كل شيء، في حين تمكن الخلوي صورة تعداد الخلايا بغض النظر عن تركيز 13. القدرة على كشف والعد الفطريات في تركيزات منخفضة للغاية يمكن أن تكون مفيدة جدا خلال المراحل الأولى من جرعة منخفضة من العدوى، أو أثناء إزالة الألغام، عندما الأرقام والجدوى قد تكون على هامش الكشف. بالإضافة إلى ذلك، البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة الخلوي صورة متاحة على الفور، في حين أن المستعمرات قد يستغرق عدة أيام لتصبح مرئية. بينما العديد من الأنواع الفطرية يمكن الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي، وإمكانية انتقال التلوث هو مصدر قلق في مرافق مشتركة. الدائرة العد المستخدمة في هذه الدراسة يقدم ميزة كبيرة من حيث السلامة الأحيائية، كما هو disposabجنيه ومكتفية ذاتيا. وعلاوة على ذلك، يقدم صورة الخلوي المزايا العملية لانخفاض الأسعار وأصغر بصمة بالمقارنة مع التدفق الخلوي التقليدية، والتي يمكن أن تكون هامة للبحوث أصغر المختبرات 11.
بالإضافة إلى المزايا العملية لها، الخلوي صورة من خلايا الخميرة يوفر المعلومات التي كفو التعداد لا يمكن. أولا، كفو التعداد هو فقط قادرة على الكشف عن الفطريات التي تكون قادرة على إقامة مستعمرة على النمو المتوسطة المختارة، والتي قد لا تمثل بدقة عدد من الفطريات قابلة للحياة الحاضرة في تجربة العدوى في الوقت الحقيقي. أيضا، يمكن أن القدرة على إقامة مستعمرة على نمو وسائل الاعلام الصلبة تختلف عند مقارنة السلالات البرية من نوع ومتحولة من الفطريات، والتي يمكن أن تكون مصدرا للانحياز التجريبية 14، وهذه التحيزات الخفية قد كشفت من خلال المقارنة بين الخلوي صورة وكفو الكمي لل من النوع البري ومتحولة السلالات. مرة واحدة وقد تميزت سلوك سلالة معينة التي كتبها boال كفو التعداد الخلوي وصورة، ونحن نعتقد أن الصورة الخلوي يمكن استخدامها كوسيلة بديلة للالكمي الفطرية.
واحد الحد من الخلوي الصورة بشكل عام هو أنه لا يسمح جمع أكبر عدد ممكن من نقاط البيانات والتدفق الخلوي. منذ عداد الكريات صورة تستمد البيانات الكمية من عدد محدود من الصور التي تم التقاطها، فمن الصعب للنظام لجمع البيانات عن مئات الآلاف إلى الملايين من الخلايا لكل عينة. ومع ذلك، هذا القيد قد يتم التحايل عليها من خلال تجميع عينات متعددة في مجموعة واحدة من البيانات لتحليلها من أجل الوصول إلى البيانات نقاط مماثلة لتدفق عداد الكريات. ونود أيضا أن نؤكد على أن طريقة تلوين AO / PI المستخدمة هنا يمثل طريقة واحدة لقياس الجدوى الخلوية، و لا يشير بالضرورة الحيوية الخلوية و / أو القدرة على إقامة النمو على المدى المتوسط الصلبة في أي عينة معينة. لذلك، في حين يوفر طريقة لدينا طريقة سطحية من القياس الكمي لايف / الميت من الخمائر، فإنهوسوف تكون أيضا مثيرة للاهتمام للتحقيق في استخدام الخلوي الصورة في تركيبة مع مؤشرات عملية الأيض الخلوية مثل FUN-1 15.
صورة الخلوي البرمجيات يحدد وتعول الخلايا من الفائدة على أساس الحجم والشكل، وبالتالي، فمن الأهمية بمكان أن يتم تعيين هذه المعلمات بعناية خلال كل تجربة. عند تنفيذ الخلوي صورة مع سلالة الخميرة جديدة، فإننا نقترح أن الأول مقارنة البيانات التي تم إنشاؤها من ثقافة نقية الخميرة إلى البيانات التي تم إنشاؤها من العد خليط من الخمائر بالإضافة إلى الخلايا المضيفة لضمان أن يتم تعيين المعلمات من هذا القبيل أن البرنامج يمكن أن نميز بين اثنين من أنواع الخلايا.
في المستقبل، سوف يكون هذا العمل الأساس لمزيد من تطوير طرق لكشف وتحديد الميكروبات عبر الخلوي الصورة. على سبيل المثال، سوف تطور أساليب cytometric صورة للكشف عن الفطريات داخل الخليط الجهاز تكون ذات فائدة كبيرة في هذا المجال. وثمة تحد آخر يتمثل في المستقبل دevelop وصقل أساليب cytometric صورة والبرمجيات بحيث يمكن استخدامها لتقدير حجم الخلايا البكتيرية. مع التقدم في النظم البصرية، والكاميرات الرقمية، ومجموعة واسعة من البقع الفلورسنت في الميدان، القدرة على الصورة وتحليل البكتيريا السكان يمكن تنفيذها في cytometers صورة، والتي يمكن أن توفر طريقة أسرع لتركيز وقدرتها على البقاء أو حيوية القياس بالمقارنة مع كفو أو أساليب الكثافة البصرية. وباختصار، فإن العمل المقدم هنا هو إثبات صحة مفهوم الخلوي تبين أن الصورة هي طريقة حساسة لتقدير من الخمائر المسببة للأمراض. التطور من برامج التحليل cytometric المستندة إلى صورة يتيح الفرصة لتحليل التفاعلات بين الخلايا المضيفة والفطريات المسببة للأمراض بطريقة كمية عالية. ويمكن تكييف هذه التكنولوجيا لمعالجة مجموعة من الأسئلة البحثية في مجال المرضية الفطرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليو لى يينغ شان وبارادي بنيامين هم موظفون من Nexcelom العلوم البيولوجية LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
