Summary
Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.
Abstract
Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.
Introduction
Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis 1, 2. Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости 3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки.
Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны 4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами 7 -11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Инфицирование макрофагов H. capsulatum, C. Albicans
- 16 часа до инфицирования, семена макрофагов при желаемой плотности в 24-луночных планшетах. В этом протоколе, плотность 3,0 х 10 5 клеток / лунка была использована.
- Добавить грибковые клетки в логарифмической фазе роста в желаемом множественности инфекции (MOI). Этот протокол может вместить ряд МВД (0,2 - 5,0). Для заражения RAW264.7 макрофагов с H. capsulatum, мы использовали МВД 0.2.
- После 1,5 часов, чтобы обеспечить фагоцитоза, макрофаги мыть три раза PBS для удаления внеклеточных грибы.
- Инкубируют в течение желаемого количества часов до анализа проб. При низких МВД (0,2 в наших экспериментах), инфицированные клетки макрофаги оставаться жизнеспособными в течение нескольких дней, и образцы могут быть проанализированы примерно каждые 12-24 часа.
2. Макрофагов Лизиса
- Чтобы освободить грибов из макрофагов, не извлекайте носитель, промыть 3 раза PBS идобавить 0,5 мл стерильной воды. В этих условиях, макрофаги и будет лизировать клетки грибов будет оставаться неизменным.
- Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Передача лизата стерильную пробирку, держать на льду.
- Передача 20 мкл лизата в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии"
3. КОЕ Покрытие
- Выполните десятикратном разведении лизатов (с шагом 2,3) в средствах массовой информации.
- Плита 100 мкл каждого разведения, в двух экземплярах, на ХМ агарозном пластин. Планшеты инкубируют в увлажненной камере при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 7-8 дней.
- Вручную подсчет колоний на чашках отображения не менее 100 и не более 1000 отдельных колоний.
4. Визуализация грибов в Онлайн-макрофагов
- Для сбора живых макрофаги, мыть клетки 3 раза с PBS. Добавить 0,5 мл PBS и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C.
- Для удаления макрофагов из колодцев культуре тканей, мягко пипетку вверх и вниз несколько раз. Передача жидкости стерильную пробирку, держать на льду.
- Передача 20 мкл образца в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии".
5. Подготовка образцов для изображения цитометрии
- Внесите целевой выборки тщательно, а затем передать 20 мкл образца в ячейку одноразовые Счетную палату.
- Разрешить клетки оседают в камере в течение 30 сек.
- Вставьте счетной камеры в образ цитометром.
6. Cellometer настроек прибора
- Вставьте флуоресценции Модули Оптика: VB-535-402 и VB-660-502 в систему и убедиться, что они встали на место.
- VB-535-402 (возбуждение при 475 нм, эмиссия при 535 нм) используется для акридиноранжа и GFP обнаружения.
- VB-660-502 (excitatiна при 540 нм, эмиссия при 660 нм) используется для обнаружения пропидий йодида.
- Включите изображения цитометром и открыть соответствующее программное обеспечение.
7. Cellometer по установке программного обеспечения
- Выберите пресет "типа анализа" и "Тип клетки" в анализе выпадающего меню.
- Для жизнеспособности, анализ оптимизирован для акридинового оранжевого и пропидия иодида обнаружения.
- Для обнаружения инфекции Candida Albicans, анализ оптимизирован для GFP обнаружения.
- Выберите "Настройки" в верхнем и нажмите "Take фонового изображения", и позволяют завершения операции.
- Нажмите на кнопку "Предварительный просмотр светлого поля изображения".
8. Процедура Image Acquisition
- Введите подготовленный образец камеры в образ цитометром.
- Используйте ручку фокусировки и регулировки фокуса.
- После того как в фокусе, нажмите на кнопку "Count" и позволить операцию захвата изображения, чтобы закончить.
- Ремове одноразовых счетной камере и утилизировать надлежащим образом.
9. Анализ данных изображений
- Концентрация и жизнеспособности измерения
- После подсчета завершена, концентрации и жизнеспособности клетки-мишени, выводятся в странице результатов.
- Нажмите на кнопку "Экспорт" для экспорта данных в ФТС Express 4 для сотовых популяционный анализ GFP в эксперименте инфекции Candida Albicans.
- FCS Экспресс-анализ Candida Albicans-инфицированные клетки
- Импорт ". NXDAT" файл в ФТС Express 4 и сюжет приводит к флуоресценции гистограммы.
- Применение ворота клеточной популяции на гистограмме, чтобы определить процент населения Candida Albicans-инфицированных клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали Cellometer цитометром изображения видения для контроля роста H. capsulatum в клетки макрофагов. RAW 264.7 клетки были инфицированы H. capsulatum дрожжевых клетках и в различные моменты времени, образцы подвергали AO / PI последующим окрашиванием на основе изображения цитометрии. Параллельно образцы анализировали с помощью традиционных перечисление КОЕ. В каждый момент времени, образцы инкубировали в воде для лизиса макрофагов и освобожденных дрожжевые клетки были определены Cellometer программное обеспечение Vision (фиг.1а и 1b). Отметим, высоко сопоставимой тенденции в концентрации жизнеспособных дрожжей как обнаружено на основе изображения цитометрии и КОЕ перечисление в каждый момент времени (рис. 1в). Как и ожидалось, абсолютное количество живых дрожжей обнаружено AO / PI окрашивание было значительно выше, чем количество дрожжей, способных образование колоний на твердой среде, как определено с помощью анализа КОЕ, выделяя знакificant количества жизнеспособных но не посевных клеток.
Визуализация грибковых клеток в живых макрофаги могут быть выполнены с использованием GFP-экспрессирующих штаммов дрожжей. Костного мозга макрофаги (BMDM) были инфицированы C. Albicans дрожжевой клетки, экспрессирующие зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора ADH1 12 (фиг. 2а). Заражение BMDM с GFP-C. Albicans дрожжи при множественности инфекции (MOI) в диапазоне от 0,1-10 соответствует дополнительных увеличением интенсивности GFP в инфицированных макрофагах (2а), а также общий процент инфицированных макрофагах (рис. 2б).
Рисунок 1. Сравнение на основе образа цитометрии анализа КОЕ Перечень H. capsulatum в процессе искусственного заражения RAW 264.7 макрофагов. (а) RAW 264.7 макрофаги были инфицированы H. capsulatum дрожжей в МВД 0.2. Через 24 часа после заражения интервалы, макрофаги лизировали и жизнеспособной дрожжей оценивается AO / PI окрашивания параллельно с перечислением КОЕ. (Б) представитель светлого (BR) и FL1/FL2 (зеленый / красный) комбинированного изображения АО / PI окрашенных H . capsulatum выпустили из лизированных RAW 264.7 макрофагов. Алгоритм сегментации учитывается только АО и PI положительной дрожжей в флуоресцентные изображения в то время как большие PI-окрашенных макрофагов RAW 264.7 (красный), исключаются. Изображения были получены при 10-кратном увеличении. (С) прямое сравнение дрожжей распространения по оценкам АО / PI окрашивания и КОЕ перечисления. Линейный регрессионный анализ тенденций роста как измерено КОЕ Cellometer и анализ доходности R 2 = 0,9927./ Files/ftp_upload/50599/50599fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Рисунок 2. Количественная оценка BMDM инфекция GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. (а) Захваченные светлого (BR) (вверху) и флуоресцентные (средний) изображения GFP-С. Albicans инфицированных BMDMs на повышение МВД. Гистограммы интенсивности флуоресценции показывают увеличение интенсивности флуоресценции GFP в качестве MOI увеличивается, что представляет собой увеличение числа С. Albicans связанных с клетками BMDM (внизу). Программы, которые обозначены инфицированных BMDMs основан на применении линейного маркер в базовой интенсивности флуоресценции отображается неинфицированных населения управления (МВД = 0). (Б) Процент infectioN как функции МВД, которое показывает увеличение инфицированных BMDMs как МВД увеличивается. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза является то, что микробы для подсчета присутствуют в смешанной популяции клеток, включая клетки млекопитающих. Здесь показано, что изображение цитометрии могут быть использованы для количественного определения жизнеспособных дрожжей патогенные инфекции в течение макрофаг пробирке. Наша методика не только точно повторяет тенденции в грибкового роста и жизнеспособности наблюдались в течение в пробирке анализов макрофаг инфекции, но также показывает улучшенную чувствительность по сравнению с традиционным анализом КОЕ 13.
Изображение цитометрии предлагает несколько практических преимуществ по сравнению с любым КОЕ перечисление или проточной цитометрии для количественного определения клетках дрожжей. Когда обшивки КОЕ, лабораторные рабочие должны планшету несколько разбавлятьионов в целях обеспечения счетное число ячеек на каждой пластине, которая может быть очень трудоемким. Изображение цитометрии устраняет необходимость в нескольких разведений. Ранее мы показали, что образование колоний на твердой среде часто переменной, а при очень низких концентрациях грибов может не образуют колонии вообще, в то время как изображение цитометрии позволяет перечисление клеток независимо от концентрации 13. Способность обнаруживать и считать грибы при очень низких концентрациях может быть очень полезным на ранних стадиях низкой дозы инфекции, или во время оформления, когда числа и жизнеспособности может быть на грани обнаружения. Кроме того, данные, полученные изображения цитометрии доступны мгновенно, тогда как колонии может занять несколько дней, чтобы стать видимым. Хотя многие виды грибов могут быть обнаружены с помощью проточной цитометрии, возможность перекрестного загрязнения является проблемой в общей ванной. Счетная камера используемые в этом исследовании предлагает значительные преимущества с точки зрения биобезопасности, так как это disposabле и автономные. Кроме того, изображение цитометрии предлагает практические преимущества более низкой цене и меньше места по сравнению с обычными проточной цитометрии, которые могут быть важны для небольших научно-исследовательских лабораторий 11.
В дополнение к его практические преимущества, изображение цитометрии клеток дрожжей предоставляет информацию, которая КОЕ перечисление не может. Во-первых, КОЕ перечисление только способен обнаружить грибов, которые способны создавать роста колоний на среде выбран, которые не могут точно отражать количество жизнеспособных грибов, присутствующих в эксперименте заражение в реальном времени. Кроме того, возможность установить рост колоний на твердой среде могут отличаться при сравнении дикого типа и мутантных штаммов грибов, которые могут быть источником экспериментальной смещения 14, и эти скрытые ошибки могут быть выявлены путем сравнения цитометрии изображения и КОЕ количественного дикого типа и мутантных штаммов. После поведение конкретного штамма характеризуется бой КОЕ Перечень и изображения цитометрии, мы считаем, что изображение цитометрии можно использовать в качестве альтернативных средств грибковые количественной оценке.
Одним из ограничений изображений цитометрии в целом является то, что она не позволяет коллекцию как многие данные в том виде проточной цитометрии. Поскольку изображение цитометром происходит количественных данных из ограниченного числа захваченных изображений, трудно для системы сбора данных о сотнях тысяч до миллионов клеток на образце. Однако это ограничение можно обойти путем группирования множества образцов в один набор данных для анализа, чтобы достичь аналогичные точки данных в виде проточного цитометра. Мы также хотели бы подчеркнуть, что АО / PI окрашивания методом здесь представляет один из способов измерения жизнеспособности клеток, и не обязательно указывает на жизнеспособность сотовой и / или возможность устанавливать роста на твердой среде в любом данном образце. Таким образом, в то время как наш метод обеспечивает легкий метод живой / мертвый количественного дрожжей, онаТакже будет интересно изучить использование изображения цитометрии в комбинации с сотовым показатели обмена веществ, таких как FUN-1 15.
Программное обеспечение изображения цитометрии определяет и подсчитывает интерес клетки в зависимости от размера и формы, и, следовательно, крайне важно, чтобы эти параметры заданы тщательно в течение каждого эксперимента. При выполнении изображение цитометрии с новым штаммом дрожжей, мы предполагаем, что одно первое сравнение данных, полученных из чистой культуры дрожжей, чтобы данные, полученные подсчет смесь дрожжей, а также клетки-хозяева, чтобы гарантировать, что параметры заданы таким образом, что программное обеспечение может различать двух типов клеток.
В дальнейшем, эта работа станет основой для дальнейшего развития методов для выявления и количественной микробов через изображение цитометрии. Например, развитие имиджа цитометрические методов для обнаружения грибов в гомогенатах органа будет иметь большое использование в полевых условиях. Другой будущий задача будет заключаться в Develop и усовершенствовать изображение цитометрии методов и программного обеспечения так, что он может быть использован для количественного определения бактериальных клеток. С продвижением в оптических системах, цифровых камер, а также широкий спектр люминесцентных пятна в области, способность анализировать изображение и бактерий населения может быть реализована в изображении цитометрах, которая может обеспечить более быстрый метод концентрации и жизнеспособности или измерения жизнеспособности по сравнению с КОЕ или оптические методы плотности. Таким образом, работы, представленные здесь, проверка концепции, показывающие, что изображения цитометрии является чувствительным методом для количественного определения патогенных дрожжей. Сложности на основе изображения цитометрии программного обеспечения для анализа дает возможность анализа взаимодействий между клетками-хозяевами и патогенных грибов в высоко количественным способом. Эта технология может быть приспособлена для решения ряда вопросов исследований в области грибковых патогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы Leo Li-Ин Чан и Бенджамин Paradis являются сотрудниками Nexcelom Bioscience LLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Life Technologies | 11965-084 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 16000044 | |
| AO/PI Solution | Nexcelom Bioscience | CSK-0102 | |
| Disposable Counting Chamber | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | ||
| Cellometer Vision Software | Nexcelom Bioscience | ||
References
- Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
- Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
- Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
- Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
- Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
- Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
- Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
- Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
- Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
- Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
- Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
- Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
- Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
- Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).
