Method Article

CometChip: Eine Hochdurchsatz-96-Well-Plattform für Mess DNA-Schäden in menschlichen Zellen Microarray

DOI:

10.3791/50607

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October 18th, 2014

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1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology, Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wir beschreiben hier eine Plattform, die Comet-Assay Nachweis von DNA-Schäden mit beispielloser Durchsatz ermöglicht. Die Gerätemuster Säugerzellen in einem Microarray und ermöglicht die parallele Verarbeitung von 96 Proben. Der Ansatz erleichtert Analyse der Ausgangsniveau von DNA-Schäden, die Exposition induzierten DNA-Schäden und DNA-Reparatur-Kinetik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA-schädigende Wirkstoffe können Alterung, Krankheit und Krebs fördern und sind in der Umwelt allgegenwärtig und werden in menschlichen Zellen als normale zelluläre Metaboliten produziert. Ironischerweise werden DNA-schädigende Wirkstoffe in hohen Dosen auch zur Behandlung von Krebs eingesetzt. Die Fähigkeit, DNA-Schadensreaktionen zu quantifizieren, ist daher im öffentlichen Gesundheitswesen, in der Pharmazie und in der Klinik von entscheidender Bedeutung. Hier beschreiben wir eine neuartige Plattform, die Mikrofabrikationstechniken nutzt, um Zellen in einem festen Microarray zu strukturieren. Der "CometChip" basiert auf dem etablierten Einzelzell-Gelelektrophorese-Assay (auch bekannt als Comet-Assay), der das Ausmaß der DNA-Schädigung abschätzt, indem das Ausmaß der DNA-Migration durch eine Matrix in einem elektrischen Feld bewertet wird. Die Art der Schädigung, die mit diesem Assay gemessen wird, umfasst abasische Stellen, Vernetzungen und Strangbrüche. Anstatt wie beim herkömmlichen Assay zufällig in Agarose dispergiert zu werden, werden die Zellen durch die Schwerkraft in einem Agarose-Mikrotiter-Array eingefangen. Die Plattform lässt sich außerdem von der Größe eines Standard-Objektträgers auf ein 96-Well-Format erweitern, was eine parallele Verarbeitung ermöglicht. Hier beschreiben wir die Protokolle für die Verwendung des Chips zur Bewertung von DNA-Schäden, die durch bekannte genotoxische Wirkstoffe verursacht werden, und die zelluläre Reparaturreaktion nach der Exposition. Durch die Integration biologischer und ingenieurtechnischer Prinzipien ermöglicht diese Methode robuste und empfindliche Messungen von DNA-Schäden in menschlichen Zellen und bietet den notwendigen Durchsatz für Genotoxizitätstests, Arzneimittelentwicklung, epidemiologische Studien und klinische Assays.

Introduction

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Die einzelne Zelle Gelelektrophorese (SCGE) Test (auch bekannt als der Comet-Assay) ist eine weit verbreitete Technik für die Quantifizierung von einem breiten Spektrum von DNA-Schäden, einschließlich Basis Läsionen, Leerstellen-, Einzelstrangbrüche, Doppelstrangbrüche, Vernetzungen und alkaliempfindlichen Websites. Das zugrunde liegende Prinzip des Tests ist, dass geschädigte DNA wandert leichter als unbeschädigt DNA aufgrund der Fragmentierung und Verlust der Superhelix-Struktur. Das Ausmaß der Wanderung proportional zu der Menge an DNA-Schäden, und kann unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. Bild-Capture-und Intensitätsprofil Analyse einzelner Kometen-förmige DNA dann liefern Parametermessungen wie Schwanzlänge, Schwanz Moment, und% DNA in tail, um das Niveau von DNA-Schäden innerhalb einer Zelle 1-4 offenbaren.

Derzeit gibt es zwei häufig verwendete Versionen der Comet-Assay: a) alkalischen Comet-Assay und b) neutralen Comet-Assay. Die alkalische Comet-Assay ist das am häufigstengebrauchte Version, die einen hohen pH-Puffer verwendet, um DNA vor der Elektrophorese zu entspannen und somit erkennt alle Arten von Strangbrüchen und alkaliempfindlichen Seiten. Die neutrale Comet-Assay, auf der anderen Seite weniger geübten weil es eine neutrale Puffer die Doppelhelices zu erhalten und zu erfassen Doppelstrangbrüche 2,5. Für chemische und physikalische Einwirkungen, die DSB zu induzieren, sind SSB im Konzert erstellt und werden bei sehr viel höheren Ebenen gebildet (zB γIR-induzierten ESBs sind eine Größenordnung häufiger als DSB). Für die meisten DNA-schädigenden Expositionen sind DSBs viel weniger häufig als andere Klassen von DNA-Schäden und sind daher schwerer zu erkennen. Wir haben in früheren Publikationen die Nachweisfenster der beiden Versionen 6,7 demonstriert.

Obwohl die Comet-Assay wurde routinemäßig für die Grundlagenforschung auf DNA-Schädigung und-Reparatur und Genotoxizität 1,2,8-15 verwendet wird, wurde der Test wurde berichtet, mit einer schlechten Reproduzierbarkeit durch Probe-zu-Probe, Person-zu-Person-und Labor zu Labor Variabilität. Zusätzlich wird der Test geringen Durchsatz, zum Teil, weil die Bildaufnahme und Datenanalyse sind aufwendig. Zusammen bilden diese Einschränkungen dazu beitragen, die relativ geringe Akzeptanz in großen Studien. Durch die Integration von Engineering-Technologien und Prinzipien, bringt das CometChip eine Lösung für die Probleme des Durchsatzes und Inkonsistenzen, die mit dem traditionellen Comet-Assay 6,7 zugeordnet sind. Kurz gesagt, um den Chip zu erstellen, eine Form mittels Photolithographie zu microposts mit Durchmessern so klein wie die von einer einzigen Zelle erstellen mikrofabriziert. Die Form wird dann verwendet, um geschmolzene Agarose Stempel, was zu einer Reihe von Vertiefungen, nachdem das Gel verfestigt. Chips werden entwickelt, um Forschern variabler Größe Vertiefungen mit unterschiedlichen Zelltypen kompatibel ist. Um den Chip zu laden, werden die Zellen in Medien erlaubt, in die Vertiefungen durch die Schwerkraft zu regeln; Über Zellen weggewaschen. Gefangen Zellen werden dann uns gekapselting eine dünne Schicht aus niedrigschmelzender Agarose und eine boden 96-Well-Platte wird dann auf die Gel-Oberfläche geklemmt macrowells 96, die jeweils mit Hunderten von Mikrovertiefungen auf seiner unteren Oberfläche.

Dieses Protokoll beschreibt die allgemeinen Verfahren für die Experimente mit diesem Chip, der Gelzubereitung, Zellenbelastung, Dosieren und Reparatur, Zelllyse, Elektrophorese und Fluoreszenz-Bildgebung umfassen. Wir zeigen zwei Beispiele für Dosis-Antwort-Experimente mit Lymphoblastenzellen ausgesetzt bekannten DNA-schädigenden Mitteln mit alkalischen und neutralen Versionen des Tests auf. Zwei Reparaturversuche sind ebenfalls dargestellt, um zu beschreiben, wie die Reparatur Antwortpostexpositions können mit dem System ausgewertet werden.

Protocol

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1. Herstellung von Chip

  1. Entfernen Chip-Gel aus dem Paket und in einen Ein-und rechteckige Platte, Gel Folienseite nach unten.
  2. Waschen Gel in 25 ml 1x PBS für 15 min, zwei Mal wiederholen.
  3. Set Gel auf Glasplatte und Etiketten Orientierung des Gels entsprechend.
  4. Drücken Sie vorsichtig einen umgekehrten boden 96-Well-Platte auf das Gel; stellen Sie sicher, dass alle Vertiefungen der Platte sind auch boden im Bereich des Gels.
  5. Verwenden 1.5 '' Binder Clips auf jeder Seite der Platte, um mit der Glasklemm sichern.
  6. Absaugen überschüssigen PBS-Puffer in jede Vertiefung.

2. Laden Cells

  1. Bereiten Zellsuspensionen:
    1. Für Suspensionszelllinien, verdünnte Zellsuspension in Medium bis zu einer Endkonzentration von 10 5 -10 6 Zellen / ml zu erhalten.
    2. Für adhärenten Zelllinien, folgen normalen Abnehmen / Trypsinierung Protokolle und dilute abgelösten Zellen in Medium auf eine Endkonzentration von 10 5 -10 6 Zellen / ml. Wenn Zellen aggregieren, vorbei Zellsuspension in einer Zelle Filter, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.
  2. 100 ul der Zellsuspension in jede Vertiefung der 96-Well-Platte.
  3. Platte mit der Gel-Film um das Verdampfen von Medien zu verhindern.
  4. Sodass die Zellen für mindestens 30 min in 37 ° C-Inkubator laden.
  5. Entfernen Chip von Inkubator und saugen Medien aus jeder Vertiefung.
  6. Entfernen Bindemittel Clips und boden 96-Well-Platte; halten den Chip mit der Glasplatte in einem Winkel und sanft spülen Sie mit 1x PBS, um überschüssige Zellen auf Agarose zu entfernen.
  7. Überprüfen Zellbeladung mit einer Hellfeld-Mikroskop mit einem 4X Objektiv. Wenn nicht genügend Lade beobachtet wird, wiederholen Sie die Schritte 2.1.
  8. Zeigen geladen Chip auf einer ebenen Fläche (Labortisch). Bei 37 ° C Overlay-Chip mit 1% niedriger Schmelzpunkt (LMP) Agarose, die vorgewärmt. Verwenden Sie etwa 2̵1, 3 ml LMP-Agarose ist für jeden Chip benötigt.
  9. Ermöglichen Overlay bei RT erstarren zunächst für 3 min und dann auf 4 ° C Kühlschrank bewegen für 5 min für eine vollständige Gelbildung.

3. Dosierung und Reparatur

HINWEIS: Um Baseline-DNA-Schäden Ebene zu studieren, fahren Sie mit Schritt 4 fort.

  1. Sorgfältig ausrichten Vertiefungen der Chip (von früheren Klemm erstellt) mit den Vertiefungen einer neuen boden 96-Well-Platte. Wieder drücken Sie die bodenlose 96-Well-Platte auf der Oberseite und sicheres Spannen mit Bindemittel Clips.
  2. 100 ul des chemischen gewünschte Dosis in jede Vertiefung der 96-Well-Platte; führen Dosierung / Behandlung auf Eis oder in 4 ° C Kühlschrank gewünschte Höhe der Zeit.
  3. Nach der Dosierung, saugen Chemikalien aus jeder Vertiefung und abspülen Rest chemischen mit 1x PBS. Wenn direkte Schäden hier studiert, fahren Sie mit Schritt 4 fort.
  4. Reparatur Kinetik zu untersuchen, sodass die Zellen auf dem Chip zu reparieren inMedien bei 37 ° C aufweist. Lyse (gehen Sie zu Schritt 4) zu bestimmten Zeitpunkten.
    HINWEIS: Die Reparatur kann auf dem Chip mit einem boden 96-Well-Platte befestigt geführt werden, oder der Chip kann nach dem Entfernen des bodenlosen 96-Well-Platte in einzelne Stücke geschnitten werden.

4. Lyse

  1. Bis alkalischen Comet-Assay durchzuführen:
    1. Die Arbeit der alkalischen Lyse-Puffer durch Zugabe von 1% Triton X-100, um die Lyse-Stammlösung (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10 mM Tris, pH 10) alkalisch. Bereiten Sie etwa 25 ml der Arbeits Lyse-Puffer für jeden Chip.
    2. Pre-Chill-Arbeitsalkalischen Lyse-Puffer bei 4 ° C.
    3. Tauchen Chip in kühlen Arbeitsalkalischen Lyse-Puffer und ermöglichen Lyse zu O / N in 4 ° C Kühlschrank durchzuführen.
  2. Neutral Comet-Assay durchzuführen:
    1. Machen die Arbeit neutral Lyse-Puffer durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 10% DMSO auf neutral Lyse-Stammlösung (2,5 M NaCl, 100 mM Na 2 EDTA, 10mM Tris, 1% N -Lauroylsarcosine, pH 9.5). Bereiten Sie ca. 25 ml Arbeits Lyse-Puffer für jeden Chip.
    2. Pre-warmen Arbeits neutral Lyse-Puffer bei 43 ° C.
    3. Tauchen Chip in warmen Arbeits neutral Lyse-Puffer und ermöglichen Lyse zu O / N in 43 ° C-Inkubator durchzuführen.

5. Die Elektrophorese

  1. Bis alkalischen Comet-Assay durchzuführen:
    1. Entfernen Lyse-Puffer und schnell spülen Chip mit 1x PBS.
    2. Sichere Chips in einer Elektrophorese-Kammer mit Gel-Film Seite nach unten mit doppelseitigem Klebeband.
    3. Bringen der Kammer auf einen 4 ° C kalten Raum.
    4. Füllen Sie die Kammer mit kaltem alkalischen Elektrophorese-Puffer (0,3 M NaOH, 1 mM Na 2 EDTA) auf ein Niveau, das gerade deckt das Gel.
    5. Lassen Sie für alkalische Abwickeln für 40 min.
    6. Führen Elektrophorese bei 1 V / cm und 300 mA für 30 min in einem kalten Raum. Stellen Sie die Lautstärke von Elektrophorese-Puffer in der chamber, um gewünschte Laufstrom zu erreichen.
  2. Neutral Comet-Assay durchzuführen:
    1. Entfernen Lysepuffer und spülen Chip mit neutralen Elektrophorese-Puffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, pH 8,5) für 2 x 15 min bei 4 ° C ist.
    2. Sichere Chips in einer Elektrophorese-Kammer mit Gel-Film Seite nach unten mit doppelseitigem Klebeband.
    3. Bringen der Kammer auf einen 4 ° C kalten Raum.
    4. Füllen Sie die Kammer mit kaltem neutral Elektrophorese-Puffer (2 mM Na 2 EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borsäure, pH 8,5) auf ein Niveau, das gerade deckt das Gel.
    5. Lassen Sie das Gel in Kühlraum für 60 min sitzen.
    6. Führen Elektrophorese bei 0,6 V / cm und 6 mA für 60 min in einem kalten Raum. Stellen Sie die Lautstärke von Elektrophorese-Puffer in der Kammer, um die gewünschte Laufstrom zu erreichen.

6. Fluorescent Imaging

  1. Entfernen Chip von Elektrophorese Kammer von cold Raum.
  2. Neutralisieren die Gele in Neutralisationspuffer (0,4 M Tris, pH 7,5) für 2 x 15 min in 4 ° C Kühlraum.
  3. Flecken auf der Chip mit fluoreszierenden DNA-Farbstoff der Wahl (dh, SYBR Gold, Ethidiumbromid) unter Fabrik empfohlenen Verfahren. Bild mit Fluoreszenz-Mikroskopie.

7. Datenanalyse

Kometen analysieren Bilder von Standard-Comet-Assay-Software wie Komet 5.5.

Results

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In diesem ersten Beispiel beschreiben wir den Ansatz zur Quantifizierung Ausgangsniveaus von DNA-Schäden in humanen lymphoblastoiden Zellen nach Exposition gegenüber oxidativer Schädigung unter Verwendung von H 2 O 2. Um H 2 O 2-induzierten Läsionen und Basiseinzelstrangbrüche zu beurteilen, werden alkalischen Komet Bedingungen verwendet. Nach dem Laden abgeschlossen ist, und die Zellen wurden mit Agarose-Overlay eingekapselt wurde, wird eine boden 96-Well-Platte auf die Oberfläche gedrückt wird, um mit 96 Fächern auf dem Chip zu schaffen. Jeder der 96 Vertiefungen können mit einer anderen Art oder Konzentration von Chemikalien dosiert werden. Hier vier verschiedenen Dosen von H 2 O 2 verwendet wurden und 1x PBS wurde als Negativkontrolle verwendet. Repräsentative Bilder angeordnet Kometen in 1A, wobei nicht-behandelten (oben), 50 uM (Mitte) und 100 uM (unten) H 2 O 2 -exposed Proben zeigten verschiedene Ebenen der Kometenschweife gezeigt. Analyse von Kometen Bilder können Perfor werdenmed unter Verwendung kommerziell verfügbarer Software, die allgemein quantifiziert Schadenshöhe bezogen auf die Gesamtfluoreszenzintensität und die Laufstrecke von jedem Kometenschweif. Messungen werden üblicherweise auf 50 bis 100 Kometen pro Zustand und dem Medianwert (entweder% Schwanz-DNA oder Schwanzlänge) durchgeführt wird, berechnet. 1B zeigt den Prozentsatz Schwanz-DNA-Antwort-Kurve aus den TK6 lymphoblastoiden Zell Kometen zu vier verschiedenen Konzentrationen von H ausgesetzt analysiert 2 O 2. Die Konsistenz zwischen unabhängigen Experimenten demonstriert die Wirksamkeit dieses Ansatzes bei der Beurteilung der DNA-Schadensantwort von den verschiedenen Ebenen der chemischen Behandlung in Zellen.

Bis etwa Variation zwischen Proben (zB unter macrowells) und unter Wiederholung des gleichen Experiments zu lernen, wurde zwischen den Stichproben und inter experimentellen Variabilität in 2A und 2B dargestellt. Innerhalb jedes Experiments wurde jede Vertiefung der 96-Well-Chip entspricht einer unterschiedlichen Probe und damit die wohl gut Variation zeigt die inter Probe Variante der Vorrichtung. Hier wurden TK6-Zellen in 12 Vertiefungen von 96-Well-Chip geladen mit der gleichen Dosis des H 2 O 2 behandelt wird und unmittelbar nach der Behandlung lysiert. Alle anderen experimentellen Schritte wurden parallel durchgeführt und die Mittelwerte von mindestens 50 Kometen aus jeder macrowell wurden in 2A dargestellt. Der Durchschnitt der Mediane ist 77,53% DNA in Schwanz, mit einer Standardabweichung ist 3.99%. Aus diesen Daten berechnen wir, dass der Variationskoeffizient zwischen den Proben beträgt 5,2%, was ein Vielfaches niedriger als die traditionellen Test ist, was die verbesserte Robustheit des Assays 6,16. Um über die Reproduzierbarkeit des Tests zu erfahren, setzten wir TK6 Zellen in einem Chip mit 75 um H 2 O 2 und die sofortige Ebene der DNA-Schäden zu analysieren. Dieses Experiment wurde sechsmal wiederholt und die Daten von jedem Experiment wurde in F aufgetragenBBILDUNG 2B. Unter identischen Versuchsbedingungen erhalten wir Ergebnisse, die von 41.76% auf 57.87%, als graue Balken in der Abbildung dargestellt. Der Durchschnitt von sechs Wiederholungen ist 49,57%, mit Standardfehler des Mittelwertes von nur 2,04%. Die geringe Unterschiede zwischen den Wiederholungen bedeutet, dass der Comet-Assay auf diesem neuartigen Gerät durchgeführt ist sehr gut reproduzierbar.

Reparatur Kinetik zu bewerten, werden Zellen erlaubt, ihre DNA in frische Medien nach der Behandlung zu reparieren. Lyse macrowells zu verschiedenen Zeitpunkten zeigt die Veränderung der DNA-Schaden über Zeit. Ein Beispiel ist in Abbildung 3 dargestellt. In diesem Experiment wurden TK6-Zellen zuerst in der Chip eingekapselt ist, mit 50 uM H 2 O 2 behandelt, und das Instandsetzen von bis zu 60 min nach der Belichtung. Zellen wurden bei 0, 20, 45 und 60 min jeweils lysiert. Repräsentative Kometen Bilder zu verschiedenen Zeitpunkten sind in Figur 3A gezeigt, und die Veränderung der DNA-Schadensstufen über der Zeit ist in Abbildung aufgetragen3B. Diese Daten ergab, dass fast alle der Schaden innerhalb von 45 Minuten nach der H 2 O 2-Behandlung repariert. Viele Variablen können die Rate der Reparatur beeinflussen, einschließlich der Art der Zelllinie und der chemischen Mittel verwendet. Daher können die Forscher Veränderungen am Protokoll (dh Verlängerung der Reparaturzeit), um zusätzliche Bedürfnisse in ihren Untersuchungen unterzubringen. Hier stellen wir ein weiteres Beispiel für Reparaturversuch mit diesen Chip, wobei TK6-Zellen werden mit einem anderen genotoxisch Mittel N-Methyl-N 'N -Nitro- -Nitrosoguanidine (MNNG) herausgefordert wird ein Alkylierungsmittel bekannt, Basis Läsionen, darunter 7-Methylguanin induzieren und 3-Methyladenin. Diese Läsionen sind umgerechnet auf Websites entweder durch spontane Depurinierung oder durch enzymatische Entfernung von DNA-Glycosylasen abasische. Die resultierende Leerstelle kann unter alkalischen Bedingungen gespalten werden und so auf dem Chip detektiert. Anfangsexposition bewirkt eine signifikante Erhöhung der Schädigung, erkennbar an der langenSchwänze, und im Laufe der Zeit diese Schwänze reduziert, wenn die Zellen wiederherzustellen intakte DNA während der Reparatur. Obwohl Alkylierung und oxidative Schädigung sowohl primär durch die Basenexzisionsreparatur Weg repariert, die Menge von Läsionen erzeugt, und die Proteine ​​in Reparatur beteiligt variieren. Diese Schwankungen können zu unterschiedlichen Umsetzungsraten führen zu Websites, sowie unterschiedlichen Geschwindigkeiten der Reparatur der entstandenen Leerstellen-abasische. In 4 Kinetik der Reparatur TK6-Zellen auf 0,1, 1 belichtet und 3 ug / ml MNNG gezeigt. Bei diesem Experiment haben wir das Experiment Zeit auf 2 Stunden nach der Exposition durch MNNG-induzierten Schäden scheint länger andauern und wird bei einer langsameren Rate gelöscht Vergleich zu H 2 O 2-induzierten Schäden.

Analyse DSB mit neutralen Bedingungen sehr ähnlich zu dem Protokoll zur Analyse von Einzelstrang-Läsionen mit den alkalischen Bedingungen. Zu Anfangsschaden Ebenen zeigen, wurden TK6 Zellen auf variable Ebenen der Gir ausgesetzt, und die resultierenden Zellen wurden lysiert und einer Elektrophorese bei einem neutralen pH-Wert (5A). Es ist bemerkenswert, dass die Morphologie der Kometenschweife unterscheidet sich von den Alkali-Testbedingungen. Zu beobachtbaren fragmentierten DNA zu erreichen unter Verwendung dieses Tests ist die IR-Dosis verwendet signifikant höher (0-100 Gy) als die erforderlich ist, um Schäden zu sehen mit den alkalischen Bedingungen Dosis. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass die Schwanzlänge ist der empfindlichste Parameter, die den Grad der DNA-Schäden bei der Verwendung der neutralen Comet-Assay 7. Die analysierte Dosis-Antwort-Kurve ist in Figur 5B dargestellt. Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüche in den Zellen beurteilt werden kann, und ist von Weingeist et gezeigt. al. 7. Zusammengenommen bietet die neutrale CometChip ein wertvolles Werkzeug für die Hochdurchsatz-Analyse von DNA-DSBs.

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Abbildung 1. H 2 O 2 Dosiswirkung von TK6 Zellen mit alkalischen Comet-Assay. (A) Angeordnete Mikrotiterplatten Kometen aus unbehandelten TK6 Lymphoblasten (oben) und TK6 Zellen bis 50 um (Mitte) und 100 uM ausgesetzt (unten) H 2 O 2 für 20 min bei 4 ° C ist. Maßstab ist 100 um. (B) H 2 O 2 Dosisantwort TK6-Zellen auf verschiedene Pegel von H 2 O 2 ausgesetzt. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten, wobei der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde in jedem Experiment erhalten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert aus drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2. Inter-Sample und Inter-Experimental Variabilität. (A) Probe zu Probe Variation. TK6 menschlichen Lymphoblasten-Zellen wurden in 12 Vertiefungen einer 96-Well-Chip geladen. Jede Vertiefung wurde zu 100 ul von 50 uM H 2 O 2 ausgesetzt für 20 min bei 4 ° C ist. Die Zellen wurden lysiert und sofort für% Tail DNA untersucht. Daten von jeder Vertiefung wird hier gezeigt. Jede Box stellt den Median mindestens 50 Einzel Kometen aus jeder Vertiefung. Der Mittelwert der 12 Wells ist 77,53%, Standardabweichung ist 3,99% und der Variationskoeffizient berechnet, um 5,2% zu sein. (B) Experiment zu Experiment Variation. TK6 menschlichen Lymphoblasten-Zellen wurden in 96-Well-Chip geladen, um 100 ul von 75 uM H 2 O 2 für 20 min bei 4 ° C ausgesetzt. Die Zellen wurden lysiert und sofort für% Tail DNA untersucht.Das gleiche Experiment wurde 6-mal wiederholt, und die Daten von jeder Wiederholung wird als graue Balken dargestellt. Jede Box stellt den Median% Schwanz-DNA von mindestens 100 einzelnen Kometen aus jeder Wiederholung. Der Durchschnitt der 6 Wiederholungen ist 49,57%, wie der Rücken bar angezeigt. Die Standardabweichung von 6 Wiederholungen ist 4,99%, und die Standardfehler des Mittelwertes berechnet, um 2,04% sein, da die Fehlerbalken in der Abbildung dargestellt.

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Abbildung 3. Reparatur von H 2 O 2-induzierten Schäden in TK6 Lymphoblasten. (A) Schematische Darstellung der Reparatur Studie mit repräsentativen Kometen. TK6-Zellen werden mit schädigenden Mitteln behandelt und in Medien bei 37 ° C vor der Lyse zu reparieren. (B) Reparatur Kinetik TK6-Zellen nach Behandlung mit 50 uM H 2 O 2 für 20 Minuten bei 4 und #176, c. Jeder Datenpunkt ist der Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten, wobei der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde in jedem Experiment erhalten. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung vom Mittelwert von der Wiederholung der Experimente. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Figur 4. Reparatur von MNNG-induzierten Schäden in TK6 Lymphoblasten. TK6-Zellen werden mit 0,1, 1 und 3 ug / ml MNNG für 30 min bei 4 ° C behandelt und in Medien bei 37 ° C bis zu 120 min nach der Reparatur Belichtung. Der mittlere Prozentsatz Schwanz-DNA von mindestens 50 einzelnen Kometen wurde für jede der drei unabhängigen Experimenten erhalten. Fehlerbalken stellen den Standardfehlerder Mittelwert von drei unabhängigen Experimenten.

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Abbildung 5. IR Dosiswirkung von TK6 Zellen mit neutralen Comet-Assay. (A) Angeordnete Mikrotiterplatten Kometen aus unbehandelten TK6 Lymphoblasten (oben) und TK6 Zellen bis 40 Gy (Mitte) und 80 Gy (unten) Gamma-Bestrahlung ausgesetzt. Maßstab ist 100 um. (B) IR-Dosiswirkung von TK6 Zellen auf verschiedenen Ebene der Gamma-Bestrahlung ausgesetzt. Jeder Datenpunkt stellt die mittleren Schwanzlänge (um) von mindestens 300 Kometen aus sechs macrowells auf dem Chip vereinigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ubiquitous Genotoxinen in der Umwelt und auch in menschlichen Zellen ausüben unvermeidlichen Stress und Schäden an zelluläre DNA. Tatsächlich wird geschätzt, dass es 1000e DNA-Schäden in menschlichen Zellen vorhanden ist im stationären Zustand 18. Verständnis Schäden und Reparaturanfälligkeit Kinetik im Menschen bringt nicht nur Einblick in die Grundlagenforschung, sondern profitiert auch die Arzneimittelentwicklung. Ironischerweise trotz der Fähigkeit der DNA-Schäden zu fördern Krebs, DNA-schädigende Mittel sind auf sehr hohem Niveau zur Behandlung von Krebs, so dass das Wissen über DNA-Schäden und Reparatur relevanten personalisierten Medizin. Die CometChip ist ein neuartiges Gerät, das Mikroforschungspraktiken nutzt, um eine langfris existierte Assay DNA-Schäden zu revolutionieren. Aufbauend auf den gleichen Prinzipien der traditionellen Comet-Assay bietet der Chip deutlich höheren Durchsatz und eine bessere Reproduzierbarkeit. Wir beschreiben hier Methoden für die Verwendung dieser Chips. Um Nutzen und Robustheit zu verdeutlichen, zeigen wir Ergebnisse herm verschiedene Experimente, in denen der Chip verwendet worden, um eine Beschädigung durch mehrere verschiedene DNA-schädigende Mittel induziert bewerten und, wo es verwendet wurde, um die DNA-Reparatur zu bewerten. Zusammen, hier vorgestellten Ergebnisse liefern hilfreiche Informationen für die Verwendung der Chips und zeigen ihre breite Anwendbarkeit, die Forschung über DNA-Schäden und Reparatur.

Einer der wichtigsten Schritte dieses Protokolls ist die effektive Zellenbelastung zu erreichen. Viele Zelllinien wurden auf diesem System getestet, darunter sowohl Federung und adhärenten Zellen. Beladungseffizienz hängt von vielen Variablen, wie Zelltyp, Zellgröße, Beladungskonzentration und Zeit. Suspensionszelllinien wie Lymphoblastoidzellen sind am einfachsten zu handhaben. Konzentration der Zellsuspension von 10 4 bis 10 6 Zellen pro 96-well variieren und Laden beendet normalerweise in 15-30 min. Höhere Zelldichte erleichtert Lade und verkürzt die Zeit für die Zellen, in die Vertiefungen abwickelt.

Ladeparameter für adhärenten Zellen aus Suspensionszellen unterscheiden. Zelllinien, wie chinesische Hamster-Eierstockzellen (CHO), wurde gefunden, dass ähnliche Ladeeffizienz als Suspensionszellen (nach Trypsinbehandlung) aufweisen und somit verwenden ähnliche Lastbedingungen. Andere Zelltypen, wie beispielsweise Tumorzellen, die sich leicht bilden, Zellaggregate in Suspension, zusätzliche Handhabung. Passieren Zellsuspensionen durch eine einzelne Zellenfilter und Zugabe von Trypsin zum Suspensionsmedium kann die Bildung von Zellaggregaten während des Ladens zu unterdrücken. Schließlich, im Hinblick auf die Ladezeit, die Zeit für die Erfassung adhärenten Zelllinien in Vertiefungen kann von 20 min bis 1 Stunde variieren, erforderlich. Als Ergebnis, ist es empfehlenswert, die Benutzer ausführen Pilotversuche, um eine optimale Ladebedingungen, bevor Sie mit weiteren Untersuchungen zu bestimmen. Laden Wirksamkeit kann unter einer Hellfeld-Mikroskop oder durch Färbung der eingekapselten Zellen mit DAPI oder andere DNA sichtbar gemacht werden genauer aufgedecktFlecken vor der Auswertung unter dem Fluoreszenzmikroskop.

Ein wesentlicher Vorteil dieses Verfahrens und dieser Chip ist die Vielseitigkeit. Zuerst werden die Forscher nicht auf eine bestimmte Arbeitszellkonzentration beschränkt, da überschüssige Zellen werden abgewaschen, und die Microarray gewährleistet eine einheitliche Dichte Kometen. Zweitens können die Vertiefungen mit variabler Größe, um Zelltypen unterschiedlicher Größe aufzunehmen. Unter Umständen, die mehrere Zellen in einem einzigen Mikrowell erfasst, sind Multi-Zell-Kometen im Vergleich zu einzelnen Zelle Kometen 6,7 Selbst kalibriert und konsistente Ergebnisse liefern. Ein weiterer Vorteil der Musterung Zellen in einem Mikroarray ist, dass alle Kometen dann bei der gleichen Brennebene mit festen Positionen, wodurch Rauschen aufgrund unfokussiert Kometen und Erleichterung der automatisierten Bildverarbeitung und Analyse. Die wesentlichen Verbesserungen im Durchsatz und die Empfindlichkeit des CometChip vorgesehen ermöglichen die Anwendung des Assays für großformatigen Untersuchungen. Zusammengenommen bieten die Chipsa wertvolles Werkzeug für die DNA-Schadensbewertung für Forscher, Toxikologen, Ärzte und Epidemiologen.

Während der Comet-Assay ist für seine ausgezeichnete Empfindlichkeit bei der Erkennung eine Vielzahl von DNA-Schäden bekannt ist, leidet dieser Test auch von geringen Spezifität. Über dieses Protokoll die Reproduzierbarkeit und Durchsatz des Assays verbessert, aber nicht Fortschritt in der Spezifität zu demonstrieren. Dennoch Multiplexen der Assay mit anderen Methoden ist berichtet worden, bei der Erzielung höherer Spezifität sein. Ein Beispiel ist die Einbeziehung von gereinigtem Läsion spezifischen Enzymen. Diese Enzyme können sonst nicht nachweisbar Basis Läsionen nachweisbar in Strangbrüchen und abasische Stellen 1,19-21 konvertieren. Ein weit verbreitetes Beispiel ist die Reparatur Endonuklease Formamidopyrimidin-DNA Glykosylase (FPG), die oxidative DNA-Modifikationen 19,22 enthüllt. Da die Enzymverdauungsschritt nach der Zelllyse verwendet, kann das System behandelt werden, auf die gleiche Weise einsa traditionellen Agarose Rutsche ohne Änderungen des Protokolls. Obwohl der detaillierte Protokoll wird hier nicht beschrieben, hat diese Vorgehensweise viele traditionelle Comet-Assay Benutzer in der Vergangenheit angepasst und die Protokolle können leicht gefunden werden. In einer früheren Veröffentlichung, haben wir diese Methode, um fluoreszierende Lichtschäden 22 zu identifizieren.

Der große Vorteil dieses Verfahrens ist der Durchsatz bietet es, die Türen zu Studien, die bislang praktisch unmöglich war geöffnet. Die Fähigkeit, 96 Proben auf der gleichen Plattform Verfahren reduziert nicht nur die Arbeit und Zeit, sondern reduziert auch experimentelle Rauschen kann und verbessert die Reproduzierbarkeit. Inter Probenvariation deutlich geringer ist als die herkömmliche Schlitten zu Schlitten Variante, die 2-fach höher als die mit diesem Chip 6,7 beobachtete Variation sein. Reduziert Lärm führt auch zu einer verbesserten Empfindlichkeit, eine Erfassung von mehr feine Unterschiede zwischen den Proben. Da das Gerät verwendet ein standard 96-Well-Format, ist es mit der allgemeinen Forschungsgeräten kompatibel und HTS-Technologien. Betrachten wir eine Studie, die Bewertung der 100 Proben benötigt, unter der Annahme, daß eine durchschnittliche Forscher kann 30 Glasobjektträger über den Verlauf von mehreren Tagen ~ verarbeiten. Da jede Probe muss dreifach durchgeführt werden, würde es etwa einen Monat dauern, bis eine solche Studie, die auch zwangsläufig leiden würde von Probe zu Probe Variation abzuschließen. Im Gegensatz dazu Verarbeitung 100 Bedingungen, die jeweils in dreifacher Ausfertigung, mit diesem Chip benötigt nur ein paar Platten und kann in drei Tagen durchgeführt werden. Diese wesentliche Verbesserung des Durchsatzes öffnet die Tür zu Studien, die bisher unerreichbar waren.

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt sowohl die grundlegenden Verfahren für die Durchführung des Standard-Comet-Assay und die erforderlich, um die Plattform zu nutzen CometChip veränderten Schritte. Mit der Fähigkeit, sowohl DNA-Schädigung verbundenen Ebenen und die anschließende Reparatur Reaktion zu messen, ist der Test sehr relevanteine Vielzahl von biologischen und klinischen Anwendungen. Informationen über die Auswirkungen von spezifischen chemischen Expositionen auf dem Genom erleichtert Prävention und Behandlung. Weiterhin besteht auch großes Interesse an der Bestimmung der Veränderungen in der DNA-Schadensempfindlichkeit und Reparaturkapazität zwischen Individuen 23,24. Diese Technik bietet die für solche groß angelegte Studien erforderlich Durchsatz. Kenntnisse über inter-individuelle Variationen ist entscheidend für die Identifizierung empfindlichen Menschen und für die Gestaltung von individualisierten Therapien oder Verhinderungen Strategien. Zusammengenommen ist die hier vorgestellte Technologie bietet einen hohen Durchsatz, objektive und quantitative Analyse von DNA-Schäden Plattform, die das Potenzial zu einem Standardverfahren in naher Zukunft hat.

Disclosures

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Der CometChip wurde an Trevigen, Inc. lizenziert, basierend auf einer Patentanmeldung, die Wood, Weingeist, Bhatia und Engelward umfasst.

Acknowledgements

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Diese Arbeit wurde in erster Linie durch 5-UO1-ES016045 unterstützt mit teilweiser Unterstützung von 1-R21-R44-und ES019498 ES021116. DMW wurde von der Ausbildungsförderung in NIEHS Umwelttoxikologie T32-ES007020 unterstützt. Ausrüstung wurde vom Zentrum für Umweltgesundheitswissenschaften P30-ES002109 vorgesehen.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UltraPure LMP Agarose (niedriger Schmelzpunkt)Invitrogen16520Mehrere Lieferanten
Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1xGibco by life technologies14190Mehrere Lieferanten
Crystalline NaClMacron Chemicals7581-06Mehrere Lieferanten
Crystalline Na2EDTAMacron Chemicals4931-04Mehrere Lieferanten, Reizstoff
Kristallin Tris (base)Sigma-AldrichT1503Mehrere Lieferanten, Reizend
Kristallin Tris (Säure)J.T.Baker4106Mehrere Lieferanten
Kristallin N-LauroylsarcosinSigma-AldrichL9150Mehrere Lieferanten, Hochgiftig beim Einatmen, Reizstoff
Triton X-100Sigma-AldrichX100Mehrere Lieferanten, Gesundheitsschädlich durch Verschlucken., Reizend
Dimethylsulfoxid (DMSO)Sigma-AldrichD4540Mehrere Lieferanten, Brennbare Flüssigkeit, Zielorganwirkung
Kristallines NaOHMacron Chemicals7708-06Mehrere Lieferanten, Korrosiv
SalzsäureVWRBDH3871Mehrere Lieferanten, Korrosiv
Kristalline BorsäureSigma-AldrichB6768Mehrere Lieferanten, Zielorganwirkung, Teratogen, Fortpflanzungsgefahr
CometChipTrevigenIn der Entwicklung für den Vertrieb, kontaktieren Sie Trevigen direkt, um die erforderlichen Materialien zu erhalten
1-Well-SchaleThomas Scientific73521-420
Bodenlose 96-Well-PlatteVWR655000-06
1,5-Zoll-HeftklammernHeftklammernMehrere Lieferanten
GlasplatteTag HardwareAngepasst an die Größe der 96-Well-Platte
Eule Horizontales ElektrophoresesystemVWR27372-131Mehrere Lieferanten
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050Mehrere Lieferanten

References

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CometChipDNA DamageComet AssayHigh throughput ScreeningMicroarrayed CellsAlkaline LysisElectrophoresisFluorescence ImagingGenotoxicity TestingCell Loading

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