Permeabilisierung der anhaftenden Zellen mit einem Inertgas Jet

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren für die vorübergehende Permeabilisierung der adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl. Diese Technik erleichtert die Übertragung von genetischem Material und Biomolekülen in adhärente Säugetierzellen durch die Verwendung von mechanischen Kräften, um die Plasmamembran zu stören.

Zusammenfassung

Verschiedene Zell Transfektion Techniken existieren und diese können bis zu drei Kategorien unterteilt werden: Virus-, chemische und mechanische. Dieses Protokoll beschreibt ein mechanisches Verfahren zur zeitlich permeabilisiert adhärenten Zellen unter Verwendung eines inerten Gasstrahl, der die Übertragung von in der Regel nicht durchlässig Makromolekülen in Zellen erleichtern können. Wir glauben, dass diese Technik durch Verleihen von Scherkräften an der Plasmamembran von adhärenten Zellen, was die temporäre Bildung von Mikroporen. Wenn diese Poren erzeugt werden, werden die Zellen dann durchlässig genetische Material und anderen Biomolekülen. Die beteiligten mechanischen Kräfte nicht Gefahr laufen, dauerhaft beschädigen oder Ablösen Zellen von ihrem Substrat. Es ist daher ein enger Bereich des inerten Gasdynamik in denen die Technik effektiv ist. Eine inerte Gasstrahl hat bei permeabilisierenden verschiedenen adhärenten Zelllinien, einschließlich HeLa, HEK293 und menschlichen Bauchaorta-Endothelzellen effizient erwiesen. Dieses Protokoll für die p angemessenermeabilization von adhärenten Zellen in vitro und, wie wir gezeigt haben, in vivo, welche es für die Forschung und möglicherweise in zukünftige klinische Anwendungen verwendet werden. Es hat auch den Vorteil, permeabilisierenden Zellen in einem räumlich restriktiv, was beweisen könnte, um ein wertvolles Forschungsinstrument sein.

Einleitung

Mit der Entwicklung der Biomedizin und das Verständnis der Zellmechanik, die Lieferung von Biomolekülen in Zellen ist unerlässlich geworden, um viele Forschungsfelder und medizinische Therapien. Verschiedene Techniken wurden entwickelt, um Fremdmolekülen durch die Plasmamembran und in das Zell-Cytosol einzuführen. Virale, chemische oder mechanische Techniken: Diese können in der Regel entweder als klassifiziert werden. Viral Techniken genetisches Material wie DNA und RNA mittels viraler Vektoren ¹ transfizieren. Viral-Techniken sind in der Regel hohe Wirkungsgrade in bestimmten Zelllinien haben, aber sie haben das Potenzial für Immun-und Entzündungsreaktionen ^2. Allgemeine chemische Transfektion Methoden gehören Fällung mit Calciumphosphat ^3, bakterielle Exotoxine ⁴ und ⁵ Lipofektion. Diese Techniken haben sich als wirksam erwiesen, jedoch ergeben sich gewisse Probleme wie Zelltoxizität und Nicht-Spezifität. Weiterhin Techniken wie Calciumphosphate Niederschlag gefunden Transfektion Wirkungsgrade bis zu 70%, aber nur in bestimmten Zelllinien, primären Zellen selten in ^6. Dies ist bemerkenswert, da zunehmende Forschungsanstrengungen werden in primären Zellen, insbesondere bei der Gestaltung verschiedene Behandlungen für die klinische Anwendung und die Untersuchung der DNA-Funktion setzen.

Zeitliche Unterbrechung der Zellmembran durch mechanische Reize ist eine Alternative zur Einführung von Fremdmolekülen in die Zellen. Techniken umfassen: Mikroinjektion von Molekülen ^7, Elektroporation unter Verwendung eines elektrischen Feldes, um die Membran ^8,9 stören Sonoporation mit Ultraschallwellen, um die Zellmembran ^10-12, Partikelbeschuss stören, wie durch das "Gen-Kanone", die Teilchen gebunden schießt nachgewiesen Gene in der Zelle ^13, und in jüngster Zeit die Anwendung von Schubspannung, die gezeigt worden ist, zeitlich permeabilisiert Säugerzellen ^14,15. Obwohl Mechanikeral Methoden vermeiden einige der oben genannten Probleme, werden sie in der Regel durch geringere Wirkungsgrade und sehr komplexen und spezialisierten Setups begleitet. Ein Atmosphärendruck-Glimmentladung Brenner (APGD-t) wurde an der McGill mit dem anfänglichen Ziel der Funktionalisierung von Oberflächen-und Abnahme adhärenten Zellen in vitro ¹⁶ entwickelt. Serendipitously wurde entdeckt, dass eine lebend / tot-Färbung verwendet wurde, irgendwie in die von Zellen ohne Permeabilisierung Mittel versetzt entnommen. Außerdem schien dies nur in eingeschränkten Bereichen der Vertiefungen, die mit der Fackel Pfad übereinstimmen passiert aufgetreten. Untersuchung der Permeabilisierung Fähigkeiten des APGD-t fortgesetzt und in Kontrollstudien wurde festgestellt, daß die Träger inerten Gasstrahl des Plasma ohne Anregung war auch in der Lage, Zellen zu permeabilisieren. Dies wider die anfängliche Hypothese, dass die durch den Plasmastrahl reaktiven Spezies vorübergehend das Membranfunktion beeinträchtigt und schlug vor, einfach die mechanischeschen Kräfte waren ausreichend, um Zellpermeabilisierung verursachen. Von hier, in unserem Labor weiter Studien zu versuchen und zu quantifizieren und charakterisieren die Permeabilisierung Effizienz eines inerten Gasstrahl sowie Blick auf seine Fähigkeiten Transfektion ^16.

Durch diese Untersuchungen wurde gefunden, dass Mikroporen in der Tat in Form der Plasmamembran, und diese Poren neigen dazu, innerhalb von etwa 5 Sekunden ¹⁵ verschließen. Wir haben Nützlichkeit der Technik der in vitro und in vivo in der Chorioallantoismembran eines Hühnerembryos zeigten.

Protokoll

1. Entwicklung von LabVIEW-Programm

1. Ein Massendurchflussregler (MKS M100B Masse-Flo-Controller) mit dem Heliumgasleitung angebracht, um eine präzise Gasflussrate zu gewährleisten. Diese Einheit wird von einer Eingangsspannung gesteuert wird, die zwischen 0 und 5 V. Eine Steuerschleife in der LabVIEW-Programm bestimmt die erforderliche Spannung zu einem bestimmten Zeitpunkt. Schnittstelle zwischen dem Computer und der Mengendurchflusssteuerung wird durch eine Datenerfassungseinrichtung (NI USB-6009) durchgeführt und eine 12-V-Stromversorgung versorgt den Massendurchflussregler.
2. Zwei Positionierungslinearführungen werden verwendet, um die Bewegung der Platte mit 6 Vertiefungen, einer für jede Richtung zu steuern. Jede Einheit besteht aus einer MA15-Serie Velmex Unislide Versammlung gekoppelt mit einem Schrittmotor und die beiden Baugruppen werden von einem einzigen Velmex VXM Schrittmotor-Controller gesteuert. Der Controller ermöglicht die manuelle Joggen jedes Motors oder akzeptiert eine Reihe von externen seriellen Befehle, deren Kombination ermöglicht gezielte Bewegung patterns. Mehrere Muster können in die LabView-Programm programmiert werden, dass der Benutzer nur die gewünschte Brennergeschwindigkeit sowie die Pfad Abmessungen liefern.

2. Vorbereitung der Ausrüstung

1. Öffnen Sie sowohl die Helium-Flasche und Atemregler.
2. Schalten Sie den Motor-Controller.
3. Öffnen Sie das LabView Programm und alle Bedingungen zu überprüfen.
4. Achten Sie darauf, die Plattform zentriert ist. Um zu überprüfen, sehen sich an Motorstufe und sicherstellen, dass jeder Wagen ist entweder nicht in der Nähe der Bühne Ende. Entweder haben das Programm Mitte die Wagen oder manuell, indem Sie die Jogging-Bedienelemente auf der Vorderseite der Motorsteuerung anpassen.
5. Wenn dies der erste Lauf des Tages, ist es empfehlenswert, das Programm einmal ohne Zellen laufen, um sicherzustellen, das Setup richtig funktioniert.

3. Herstellung des Gasstrahls Kapillardüse Höhe

1. Entfernen Sie die Kapillare aus der Halterung und die Höhe Null Zifferblatt.
2. Legen Sie die 6-Well-Platte on die Plattform.
3. Ersetzen und senken den Gasstrahl Kapillare auf den Grund des Brunnens, bis es das Deckglas trifft. Sichern Sie die Kapillare in die Halterung.
4. Über die Höhe Zifferblatt, erhöhen die Kapillare 3 mm. Markieren Sie diese Höhe auf der Kapillare Basis.
5. Heben Sie die Kapillare auf eine sichere Höhe und dann die 6-Well-Platte.

4. Zellpermeabilisierung Protokoll

1. Kultur adhärenten Zelllinie, auf Glasabdeckung Konfluenz rutscht in einer 6-Well-Platte mit Standard-Kulturtechniken. Für HeLa-Zellen, Samen Platten mit 6 Vertiefungen mit 2 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung und Inkubation für 48 h vor der Behandlung.
2. Bereiten Sie entsprechende Volumen der Lösung, die das gewünschte Vektor. Für hrGFPII-1, eine Konzentration von 50 ng / ul in 1x PBS bietet eine starke Fluoreszenzsignal in HeLa-Zellen 24 Stunden nach der Transfektion. Für Dextran Studien wird 80 pg / ml 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran empfohlen. Von nun an wird diese Lösung zu einer bezeichnets "Vektor-Lösung."
3. Entfernen von Zellkulturmedien von gut und spülen dreimal mit 1x PBS.
4. Pipettieren 1370 ul Vektor Lösung in Schritt 4.2 in gut vorbereitet. Dies sollte in einer Flüssigkeitstiefe von ca. 1,3 mm führen.
5. Zeigen die auch den Vektor enthaltenden Lösung in der Mitte der Plattform. Senken Sie den Gasstrahl Düse auf die zuvor markierten Ebene einen Düsenhöhe von 3 mm über der Folie angezeigt wird.
6. Stellen Helium Strömungsgeschwindigkeit in der LabView-Programm und wählen Sie die gewünschte Bewegungsmuster verwendet werden. Wählen Sie "Ausführen", wenn Sie bereit sind, um die Permeabilisierung Protokoll beginnen. Es wird eine anfängliche Verzögerungszeit, während der die Massenstrom-Steuer bereitet die notwendige Strömungsgeschwindigkeit bereitzustellen. Sobald die entsprechende Durchflussmenge erreicht ist, wird der LabView-Programm die Schrittmotoren zu aktivieren, die auch in der gewünschten Permeabilisierung Muster zu bewegen. Sobald die Plattform angehalten hat, warten Sie etwa 30 Sekunden und entfernen Sie den Vektor-Lösung.Hinweis: Optimale Permeabilisierung erfolgt an einem Staudruck von 100 bis 200 Pa am Düsenaustritt je nach Durchmesser der Kapillare.
7. Gut mit 1x PBS waschen dreimal.
8. Füllen gut mit frischem Kulturmedium.
9. Wiederholen Sie die Schritte von 4,3 bis 4,6 für die gewünschte Anzahl von Experimenten. Hinweis: Achten Sie darauf, Kontrollproben, die von Brunnen, die mit dem Vektor-Lösung ohne den Gasstrahl wird über sie laufen bestehen gefüllt sind. Die Lösung ist in den Kontrollvertiefungen für ca. 1 min dann zu den Schritten 4.5 und 4.6 gehen.
10. Arbeiten Sie mit einem hrGFP Transfektionsexperiment, kehren 6-Well-Platte für 24 Stunden Inkubator, damit transfizierten Material von den Zellen transkribiert werden. Wenn Sie mit einem Dextran Permeabilisierung Experiment zurück 6-Well-Platte für 15 min Inkubator.

5. Cell Imaging

1. Wenn gewünscht, unmittelbar vor der Bildgebung, Kontrastfärbung mit entsprechenden Live / Dead-Färbung, um den Zelltod zu evaluieren.
2. Bild Zellen mit angemesriate Mikroskop der Transfektion / Permeabilisierung Wirksamkeit zu untersuchen.

Ergebnisse

Permeabilisierung von HeLa-Zellen mit 10 kDa grün fluoreszierenden Dextran mit einem Heliumgasstrahl mit einem Innendurchmesser von 0,86 mm Kapillare ist in Fig. 1 gezeigt. Die Zellen wurden unmittelbar nach Permeabilisierung mit 2 ul / ml EthD-1-Lösung (LIVE / DEAD Lebensfähigkeit / Zytotoxizität Kit), um den Zelltod zu visualisieren gegengefärbt. Unmittelbar nach Gegenfärbung wurden die Deckgläser angebracht und abgebildet. Diese Figur zeigt Ergebnisse der Ausführung des Heliumgasstrahl auf drei versc...

Diskussion

Schutzgasstrahl Permeabilisierung ist eine nützliche Technik für adhärenten Zell Transfektion. Es bietet die Möglichkeit, Biomoleküle in Zellen unter Verwendung von mechanischen Kräften, die die Notwendigkeit einer potentiell schädlichen Chemikalien oder virale Vektoren beseitigt übertragen. Die Technik könnte möglicherweise geben Forscher und Kliniker eine effiziente und relativ einfache Möglichkeit, genau Transfektion von Zellen. Die Selektivität der Permeabilisierung ist auch einzigartig so dass die Forscher nur best...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Vitality hrGFPII-1	Agilent Technologies Canada	240143-57	Grün fluoreszierendes Protein für Transfektionsexperimente an HeLa-Zellen
Dextran, AlexaFluor 488; 10.000 MW, anionisch, fixierbar	Life Technologies Inc.	D22910	Dextran für Permeabilisierungsexperimente
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Life Technologies Inc.	L3224	zur Gegenfärbung von Säugetierzellen
Prolong Gold Antifade Reagenz	Invitrogen	P36930	zum Einbetten von Objektträgern bei der Bildgebung
ultrahochreinem Helium	Praxair Canada Inc.	HE 5.0UH-T
Hyclone DMEM/Medien mit hohem Glukosegehalt - 500 ml	Thermo Scientific	SH30022.01	für HeLa-Zellen
Fötales Rinderserum	Invitrogen	26140079	Für DMEM-Medien
Penicillin-Streptomycin, flüssiges	Invitrogen	15140-122	Für DMEM-Medien
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x			Hergestellt im Labor
			Tabelle 1. Liste der erforderlichen Reagenzien
6-Well Clear TC-behandelte Mikroplatten	Corning	3506
#1 22 x 22 Deckgläser	Fisher	12-542B
Glaskapillaren	World Precision Instruments		WPI Dimensionierungsinformationen
ID (mm): 1, 0,86, 0,68, 0,5 Bestellnummer #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100
Masse-Flo-Regler	MKS	M100B01314CS1BV	Massendurchflussregler, Serie M100B, erfordert ein externes 12-V-Netzteil
USB-6009 Datenerfassungsgerät	National Instruments	779026-01
UniSlide-Baugruppe mit Schrittmotor und Steuerung	Velmex		Serien MA15 UniSlide-Baugruppen, ausgestattet mit Vexta 1,8" Schrittmotoren von Velmex und gesteuert von einer VXM-Schrittmotorsteuerung
			Tabelle 2. Liste der benötigten Geräte

von Zwei