Methodenartikel

Isolierung von humanen Hepatozyten durch eine Zwei-Schritt-Verfahren Collagenase Perfusion

DOI:

10.3791/50615

⸱

3. September 2013

 ,  ,  ,  , 
1Experimental Surgical Research, Grosshadern Hospital, Munich, 2Center for Liver Cell Research, Grosshadern Hospital, Munich, 3Hepacult LLC, Regensburg, 4Department of Surgery, Grosshadern Hospital, Munich

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

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Zusammenfassung

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Eine modifizierte Zwei-Schritt-Kollagenase-Perfusion Verfahren zur Isolierung von humanen Hepatozyten beschrieben. Dieses Verfahren kann auch auf andere Säugetierlebern, angewendet werden. Die isolierten Hepatozyten sind in hoher Ausbeute und Lebensfähigkeit, so dass sie ein geeignetes Modell für die wissenschaftliche Forschung in Bereichen wie der Leberregeneration, Pharmakokinetik und Toxikologie.

Zusammenfassung

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Die Leber, ein Organ mit einer außergewöhnlichen Regenerationsfähigkeit, führt eine breite Palette von Funktionen, wie zB Entgiftung, Stoffwechsel und Homöostase. Als solche sind Hepatozyten ein wichtiges Modell für eine große Vielfalt von Forschungsfragen. Insbesondere ist die Verwendung von humanen Hepatozyten in den Bereichen Pharmakokinetik, Toxikologie, Leberregeneration und translationale Forschung besonders wichtig. Somit stellt dieses Verfahren eine modifizierte Version einer Zwei-Schritt-Verfahren, um Collagenase-Perfusion isoliert Hepatozyten durch Seglen 1 beschrieben.

Früher wurden Hepatozyten durch mechanische Methoden isoliert. Allerdings haben enzymatischen Methoden wurde gezeigt, überlegen zu sein, wie Hepatozyten nach Isolierung behalten ihre strukturelle Integrität und Funktion. Das hier vorgestellte Verfahren passt sich das Verfahren bisher für Rattenlebern der menschlichen Leber Teile und führt zu einer großen Ausbeute von Hepatozyten mit einer Lebensfähigkeit von 77 ± 10% bestimmt. Der HauptUnterschied in diesem Verfahren ist das Verfahren der cannulization der Blutgefäße. Weiterhin kann das hier beschriebene Verfahren auch auf andere Arten von Lebern mit vergleichbaren Leber-und Blutgefäßgrößen angewendet werden.

Einleitung

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Eine Leberzellsuspension aus der Leber durch mechanische oder enzymatische Verfahren hergestellt werden. Mechanische Verfahren verwendet werden, um ganze Leberzellen herzustellen, umfassen die Leber zwingt durch Gaze 2, schüttelt ein Leberstück mit Glasperlen in einem Kahn Schüttler 3, mit Glas-Homogenisatoren mit losen Stößel 4,5 usw. Im Laufe der Jahre haben mechanische Methoden aus gefallen begünstigen aufgrund der Schäden an Zellmembranen und der Verlust der Funktion der isolierten Hepatozyten 6,7. Folglich ist die Verwendung eines enzymatischen Verfahrens derzeit die wichtigste Methode zur Isolierung von Hepat....

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Protokoll

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1. Vorbereitung der Perfusion und Isolation Lösungen

  1. Vorbereitung der für die Durchblutung der Leber Stück und die Isolierung von Hepatozyten nach Tabelle 1 erforderlichen Lösungen. Lösungen bei 4 ° C bis zur Verwendung gelagert werden.
  2. Sterilfilter alle Lösungen mit einem 0,22 um Filter.
  3. Alle Lösungen, die in Kontakt mit der Leber kommen sollte steril sein.

2. Vorbereitung der Perfusion Geräte und Lösungen

  1. Die Ausrüstung für die Durchblutung der Leber Stück sollte wie in Abbildung 1 gezeigt, eingestellt werden.
  2. Das Wasserbad sollte bei einer geeig....

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Ergebnisse

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Perfusion-Setup

Die Leberdurchblutung erforderliche Ausrüstung sollte nach 1 gesetzt werden.

Die Lebensfähigkeit und Rendite von isolierten menschlichen Hepatozyten

Die durchschnittliche Lebensfähigkeit von isolierten humanen Hepatozyten betrug 77 ± 10% und die durchschnittliche Rendite der Hepatozyten war 13 ± 11 Millionen Hepatozyten / g Leber, mit Werten als Mittelwert ± Standardabweichung. Die Zahl der Hepatozyten-Isoli.......

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Diskussion

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Dieses Protokoll führt zu der Isolierung von humanen Hepatozyten mit hohen Lebensfähigkeit und Reinheit. Um diese Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, mit einem geeigneten Stück Leber starten. Das Stück Leber sollte intakt Glisson-Kapsel auf allen Oberflächen außer ein Schnittfläche haben. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die bestimmte Charge von Collagenase verwendet werden, wie verschiedene Chargen können deutliche Unterschiede in der Lebensfähigkeit von Hepatozyten nach Aufschluss 11 führen. Deshalb so.......

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Offenlegungen

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Optimierung des Protokolls wurde teilweise durch einen Zuschuss aus hepacult GmbH finanziert. Dr. Wolfgang Thasler ist einer der Gründer der hepacult GmbH und bleibt eines der Mitglieder des Vorstandes in dieser Gesellschaft. Die Beschäftigung von Maresa Demmel ist teilweise durch hepacult. Maria Hauner wird durch hepacult GmbH beschäftigt. Hepacult ist ein Spin-off biotechnologische Firma aus der Universität, der humanen Hepatozyten mit Zustimmung und offenen Zugang zu Forschungszwecken bietet.

Danksagungen

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Diese Arbeit von der Human Tissue and Cell Research Foundation, die menschliche Gewebe für die Forschung macht möglich gemacht. Und hepacult GmbH Finanzielle Unterstützung für diese Arbeit wurde vom Bundesministerium für Bildung und Forschung (: Virtual Liver Network, Förderkennzeichen 0315759 Zuschuss Name) erhalten. Unser Dank gilt auch den technischen Assistenten aus dem Klinikum Großhadern Gewebebank für die Sammlung der Leberproben und die technischen Assistenten aus der Zellisolierung Core Facility für die Durchführung der Leberdurchblutung und Hepatozyten Isolation zu gehen. Insbesondere möchten wir Natalja Löwen für den Nachweis dieses Verfahren in dem Video ....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
BlasenfalleGaß ner Glastechnik 
Glasummantelter KondensatorGaß ner Glastechnik 
41 &/�; C WasserbadJulabo35723-H24/EG 
37°; C WasserbadGFL1083 
Druckgasflasche (95 % O2/5 % CO2)Linde 
Gasdurchlässiger SchlauchNeolab2-4440 
SchlauchpumpeIsmatecIP65 
Skalpellfeder320010 
PinzetteOmnilab5171014 
Konuskolben 1 LSchott Duran2121654 
Konuskolben 5 LSchott Duran2121673 
BecherSchott Duran2110654 
200 ml ZentrifugenröhrchenBecton Dickinson352075 
KristallisationsschaleOmnilab5144063 
Gebogene Spülkanülen mit KugelspitzenErnst Kratz GmbH1464LL/ 1465LL A+B/ 1472LL 
MikrogefäßklemmenErnst Kratz GmbH
Bü chner TrichterCarl RothHT38.1 
Nylon Mesh 210 μ mNeolab4-1413 
Nylon Mesh 70 μ mNeolab4-1419 
0,22 μm m SterilfilterPeske99505 
500 ml FlaschenSchott Duran2180144 
1 L FlaschenSchott Duran2180154 
HämozytometerPeske06-0001 
1,5 ml TubenEppendorf0030 120,086 
50 ml konische RöhrchenBD Biosciences352070 
EiskübelNeolab1508454 
Sterile Pasteur-PipettenMarke747715 
Motorisierter Pipettenfüller (Pipette boy acu)Integra155017 
Gekühlte ZentrifugeEppendorf5810R 
Laminare StrömungKendroHera safe-KS9 
Aspirator (chirurgische Absaugpumpe mit geringem Durchfluss)AtmosC361 
Gasbrenner für LaborsIntegraFire Boy eco 
Einweg-LaborkittelPaperlynen GmbHMD0202414 
Chirurgische Maske mit VisierKimberly-Clark48247 
Chirurgische HaubeBarriere42072 
LatexhandschuheSemper CareCE0321 
Kollagenase (Chargennummer NB 4G)Serva17465 
Calciumchlorid-DihydratMerck2382 
EGTASigmaE4378 
NatriumchloridRoth9265.2 
HepesRoth9105.3 
KaliumchloridServa26868 
AlbuminBiomol01400-2 
GlukoseServa22700 
NatriumhydrogencarbonatServa30180 
0,4 % Trypanblau-LösungLonza17-942E 
KühlhauslösungHepacult GmbH 

Referenzen

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  1. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
  2. Schneider, W. C., Potter, V. R. The assay of animal tissues for respiratory enzymes II. Succinic dehydrogenase and cytochrome oxidase. J. Biol. Chem.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure
Posted by JoVE Editors on 7/01/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The changes listed below have been made to Table 1.

1). In the recipe for Solution 2, the Final Concentration of EGTA has been changed from:

EGTA 0.1mM

to:

EGTA 1mM

2). In the recipes for Solution 3 and 4, the Final Concentration of Calcium chloride dihydrate has been changed from:

Calcium chloride dihydrate 0.5µM

to:

Calcium chloride dihydrate 5mM

Schlagwörter

LeberisolationZellviabilit tPhasenkontrastmikroskopieAlbuminf rbungTrypanblau AssayZentrifugation bei niedriger GeschwindigkeitEntfernung der Glisson KapselFiltration durch Nylonnetz

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