Мы опишем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоров, которые основаны на GFP, следить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей.
Митохондрии играют роль во многих клеточных процессах, с метаболизмом энергии и гомеостаз кальция для контроля клеточной продолжительность жизни и запрограммированной клеточной смерти. Эти процессы влияют и зависят от окислительно-восстановительного статуса и АТФ в митохондриях. Здесь мы описываем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоры, которые могут обнаружить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние измеряется с использованием окислительно-восстановительных чувствительной зеленый флуоресцентный белок (roGFP), который направлен на митохондриях. Mito-roGFP содержит цистеина в положениях 147 и 204 GFP, которые подвергаются обратимым и экологически зависимой окисления и восстановления, которые в свою очередь изменяют спектр возбуждения белка. MitGO-Ateam является энергией резонанса Ферстера переводом (лад) датчик, в котором ε субъединицы F O F 1-АТФ-синтазы зажат между FRET донором и акцептором флуоресцентныхrescent белков. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит к изменениям в конформации белка, которые приносят лад донора и акцептора в непосредственной близости и позволяют резонансный перенос энергии флуоресценции с донора на акцептор.
Митохондрии являются существенными для органелл производства АТФ, биосинтеза аминокислот, жирных кислот, гем, железо серные кластеры и пиримидинов. Митохондрии также играют ключевую роль в гомеостазе кальция, а в регуляции апоптоза. 1 больше доказательств ссылки митохондрии старения и возрастных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона. 2 В то время как люди живут всю свою жизнь с мутации в митохондриальных белков, которые связаны с нейродегенеративные заболевания, симптомы болезни возникают только в будущем. Это означает, что изменения происходят в митохондриях с возрастом, которые позволяют патологии болезни появляться. Действительно, митохондриальная фитнес коррелирует с общего состояния здоровья и продолжительности жизни клетки дрожжей и в клетках млекопитающих. 3,4 Здесь мы опишем, как использовать генетически кодируемых, логометрических флуоресцентные биосенсоры для оценки двух важных особенностях Митокhondria в живых дрожжевых клеток: окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ.
Функции митохондрий в аэробных мобилизации энергии хорошо известна. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние является продуктом сокращения и окислителей в органеллы, в том числе NAD + / NADH, FAD / ГВС 2, NADP + / NADPH, глутатион / глутатион дисульфида (GSH / GSSG) и активные формы кислорода (ROS). Разобщение митохондрии или гипоксия влияет на митохондриальную дыхательную активность и изменяет отношение NAD + до NADH в органеллы. АФК, которые получают из неэффективного переноса электронов между комплексами цепи переноса электронов во внутренней митохондриальной мембраны, а также от дезаминирование аминов через моноаминоксидазы в наружной мембраны митохондрий 5, повреждения липиды, белки и нуклеиновые кислоты и имеют были связаны со старением и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний 6,7,8. ROS также играют важную роль в передаче сигнала в мitochondria, через окисление GSH. Например, NADH дегидрогеназы не только способствует продукции АФК, но и регулируется за счет взаимодействия с бассейном глутатиона 9,10. α-кетоглутаратдегидрогеназы и аконитазу, компоненты ЦТК, проявляют пониженную активность в окислительных средах 11,12.
Действительно, окислительно-восстановительный потенциал-зависимого регулирования аконитазу активность сохраняется от бактерий до млекопитающих 13,14. Таким образом, наблюдая окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ митохондрий крайне важно для понимания их функции и роль в патологии болезни.
Биохимические методы были использованы для оценки окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ целых клеток или изолированными митохондриями. Широко используются методы оценки окислительно-восстановительное состояние целых клеток или изолированных митохондрий, основанные на измерении уровней окислительно-восстановительной пары GSH / GSSG 15. Люциферин-люциферазы системы обычно используют для измерения митохондриальнойУровней АТФ в любом проницаемыми целых клеток или изолированных митохондрий. 16,17,18,19,20 В этом анализе люциферазы связывается с АТФ и катализирует окисление и хемилюминесценции с люциферин. 21 интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству АТФ в реакционной смеси. 22
Эти методы показали основную информацию о функции митохондрий, включая обнаружение того, что пациенты с нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, имеют аномально низких уровней АТФ. 23 Тем не менее, они не могут быть использованы для изображения жизни, интактных клеток. Кроме того, методы, основанные на цельноклеточной анализа обеспечивают в среднем окислительно-восстановительное состояние или уровень АТФ во всех отсеках ячейки. Измерения в изолированных органелл являются потенциально проблематично из-за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ может изменяться в процессе внутриклеточного фракционирования. Наконец, недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие показывают, чтомитохондрий в отдельные клетки являются гетерогенными в функции, которые в свою очередь влияет на продолжительность жизни матери и дочерним клеткам. 3 Таким образом, существует необходимость измерения митохондриальной АТФ и окислительно-восстановительное состояние в живых клетках с субклеточных разрешение.
Биосенсоры для митохондриальной функции, описанные здесь, как на основе GFP. Редокс-чувствительный GFP (roGFP) 24,25 GFP является вариант, в котором экспонированы на поверхности цистеина добавляют в молекуле. roGFP, как дикого типа GFP, имеет два пика возбуждения (при ~ 400 нм и ~ 480 нм) и один пик излучения при ~ 510 нм. Окисление остатков цистеина в roGFP приводит к увеличению возбуждение при ~ 400 нм. Сокращение этих цистеина способствует возбуждению при ~ 480 нм. Таким образом, отношение 510 нм, излучение при возбуждении roGFP при 480 нм и 400 нм показывает относительное количество восстановленной и окисленной roGFP, которая отражает окислительно-восстановительное состояние окружающей среды флуорофор о.
Два испионами roGFP широко используются: roGFP1 и roGFP2. Оба содержат те же вставки цистеина. roGFP1 на основе дикого типа GFP и roGFP2 основана на S65T GFP, который имеет более эффективное возбуждение при 480 нм и менее эффективное возбуждение при 400 нм по сравнению с wtGFP 24. roGFP1 меньше, чем рН-чувствительные roGFP2 и его динамический диапазон простирается далее в диапазоне значений приведенного. Таким образом, roGFP1 может быть более полезным для мониторинга более восстанавливающих отсеки, такие как митохондрии или цитозоле, и отсеков с переменным рН, такие как эндосомам. roGFP2 имеет более яркое сигнала и, в некоторых исследованиях, больший динамический диапазон, чем roGFP1 24,26. Исследования, проведенные в Arabidopsis THALIANA показывают, что время, требуемое для реакции на изменения в окислительно-восстановительное состояние одинакова для обоих датчиков (т ½ для окисления, 65 и 95 сек и т ½ для уменьшения, 272 и 206 сек, для roGFP1 и roGFP2, соответственно). 26
MitGO-ATeam2 является малоинвазивным, надежныедатчик, который измеряет митохондриальной АТФ в начинающие CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces. GO-Ateam является энергии Ферстера резонансной передачи (FRET) зонд, который состоит из ε-субъединицы F о F 1-АТФ-синтазы FRET зажатой между донором и акцептором флуоресцентного белка (GFP и оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) соответственно) 27. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит конформационные изменения в белке, которые приносят лад донора в непосредственной близости от акцептора и позволяют передачу энергии от донора к акцептора. Есть два варианта GO-Ateam, GO-GO и ATeam1-ATeam2. GO-ATeam2 имеет более высокое сродство к MgATP чем GO-ATeam1, что делает ее более пригодной для измерения обычно ниже, [АТФ] в митохондриях по сравнению с цитозоль 27.
Для зондирования митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, мы построили слитого белка (Mito-roGFP1), состоящий из roGFP1 слитый с последовательностью лидера ATP9й экспрессируется из центромеры основе (низкое число копий), дрожжевой экспрессирующий плазмиду под контролем сильного глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GPD) промотор (p416GPD, Addgene). Мы использовали roGFP1 для исследования окислительно-восстановительного состояния митохондрий в контексте старения CEREVISIAE модель грибок cerevisiae. Мы считаем, что roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, которые происходят в процессе старения и в ответ на наличие питательных веществ, но не имеет никакой очевидной пагубное влияние на дрожжевые клетки. Мы также видим, изменчивость в окислительно-восстановительного состояния митохондрий в индивидуальные клетки дрожжей жизни, открытие, которое подчеркивает важность биосенсоров субклеточную с пространственным разрешением.
MitGO-ATeam2 является вариант GO-ATeam2, который имеет сигнальную последовательность митохондриальной цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA вставляется в аминоконцу GO-ATeam2. 27 Мы изменили mitGO ATeam2-зонд (любезно предоставленные лабораторией H. Noji, Институт OF научных и промышленных исследований, Университет Осака, Япония) для использования в дрожжах субклонированием к ней через Xba1 и HindIII сайтах, в вектор экспрессии дрожжей pAG415GPD-БДКК (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), которая является низкой плазмидой содержащие сильного конститутивного промотора GPD. Мы выразили mitGO-ATeam2 у почкующихся дрожжей, и найти, по контрастного с ДНК-связывающим красителем DAPI, что он локализуется исключительно в митохондрии, где он служит эффективным зондом для измерения физиологических изменений в митохондриальной уровня АТФ.
roGFP и GO-Ateam оба генетически закодированы. В результате, они могут быть введены и стабильно сохраняться в интактных клетках, и предоставлять информацию о окислительно-восстановительное состояние или уровней АТФ в отдельных, живые клетки. Более того, и биосенсоров отслеживать изменения в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ, которые происходят в физиологических условиях. +28 Оба зонда также радиометрические. В результате измерений, выполненных с этих зондов не влияет на чаНГРЭС биосенсоров в концентрации или освещения образца или толщины. Наконец, и биосенсоры обеспечить субклеточных пространственным разрешением. Действительно, roGFP была ориентирована в митохондрии, ER, эндосомы и пероксисом 24, и может обнаружить изменения в окислительно-восстановительное состояние каждого из этих органелл, в значительной степени зависит от рН.
Здесь мы описываем методы использовать Mito-roGFP1 и mitGO-ATeam2 в качестве биосенсоров для оценки митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ в живых клетках дрожжей. Мы считаем, что выражение плазмидой Mito-roGFP1 или mitGO-Ateam результатов в количественном ориентации на ?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана награды от HHMI 56006760 в JDV, Национального института здоровья (NIH) (2 TL1 RR 24158-6), чтобы DMAW, а с Эллисон Медицинский фонд (AG-SS-2465) и NIH (GM45735, GM45735S1 и GM096445) в LP. GM45735S1 была выдана из NIH в оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года. Микроскопы используются для этих исследований были частично поддержана через NIH / NCI грант (5 P30 CA13696).
Reagents | |||
Antimycin A | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 1397-94-0 | Dissolved in ethanol to a 2 mg/ml stock solution. |
SGlyc (synthetic glycerol-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glycerol 0.05% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
SC (synthetic complete, glucose-based) yeast growth medium *omit for SGlyc-Ura **omit for SGlyc-Leu |
Dissolve in H2O. Adjust pH to 5.5 with NaHCO3. Autoclave. Ingredients: 0.67% Yeast nitrogen base without amino acids 3% Glucose 2 mg/ml adenine 2 mg/ml uracil* 1 mg/ml L-arginine 1 mg/ml L-histidine 1 mg/ml L-leucine** 3 mg/ml L-lysine 2 mg/ml L-methionine 4 mg/ml L-phenylalanine 2 mg/ml L-tryptophan 3 mg/ml L-tyrosine |
||
Valap | Combine ingredients in a 1:1:1 (w:w:w) ratio. Melt by submerging in a 70 °C H2O bath. Aliquot into glass petri dishes. Store at room temperature. Ingredients: Vaseline petroleum jelly, hard paraffin, lanolin |
||
Equipment and Software | |||
Precleaned Gold Seal Rite-on Micro Slides | Thomas Scientific (Swedesboro, NJ) | 3050 | Size: 25 x 75 mm; Thickness: 0.93 to 1.05 mm |
High-performance coverslips, No. 1.5, 18×18 mm | Zeiss (Thornwood, NY) | 474030-9000-000 | These are less variable in thickness (170±5 μm) than standard coverslips, reducing spherical aberration and improving 3D imaging performance |
Fisherbrand Microscope Cover Glass, No. 1.5 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA) | 12-545E | Size: 22 x 22 mm, No. 1.5 thickness (170 μm) |
A1 laser scanning confocal microscope with spectral detector and 100x/1.49 NA Apo-TIRF objective | Nikon (Melville, NY) | ||
AxioObserver.Z1 microscope equipped with a 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar objective (Zeiss) and Orca ER cooled CCD camera (Hamamatsu) and controlled by Axiovision software | Zeiss (Thornwood, NY); Hamamatsu (Hamamatsu City, Japan) | ||
Volocity 3D Image Analysis software | Perkin Elmer (Waltham, MA) | Restoration module for deconvolution; Quantitation module for ratio calculation and measurement | |
ImageJ software | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |