Die Trennung der Spermatogenese Zelltypen Mit STA-PUT Velocity Sedimentation

Summary

Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung der verschiedenen Populationen von Zellen spermatogenic basierend auf Größe und Dichte.

Abstract

Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden in mehreren Stufen erfolgt. Derzeit gibt es keine zuverlässigen Zellkultursystem, das für die Spermatogenese in vitro Differenzierung, und die meisten biologischen Untersuchungen der Spermatogenese Zellen benötigen Ernte Gewebe aus Tiermodellen, wie Maus und Ratte. Da die Hoden enthält zahlreiche Zelltypen - sowohl nicht-Spermatogenese (Leydig, Sertoli, myeloische und Epithelzellen) und Spermatogenese (Spermatogonien, Spermatozyten, runde Spermatiden, Brenn Spermatiden und Spermatozoen) - Studien über die biologischen Mechanismen der Spermatogenese beteiligt erfordern die Isolation und Anreicherung dieser verschiedenen Zelltypen. Die STA-PUT Verfahren ermöglicht die Trennung einer heterogenen Population von Zellen - in diesem Fall aus den Hoden - durch einen linearen Gradienten BSA. Einzelne Zelltypen mit unterschiedlichen sedimentieren Sedimentationsgeschwindigkeit nach cell Größe und Fraktionen für verschiedene Zelltypen angereichert können gesammelt und in weitere Analysen genutzt werden. Während der STA-PUT Verfahren nicht in hochreiner Fraktionen von Zelltypen, wie z. B. mit bestimmten Zellsortierverfahren erreicht werden ergeben, liefert es eine wesentlich höhere Ausbeute an Gesamtzellen in jeder Fraktion
(~ 1 × 10 ⁸ Zellen / Spermatogenese Zelltyp aus einer Anfangspopulation von 7-8 x 10 ⁸ Zellen). Diese hohe Ausbeute Methode erfordert nur Glaswaren spezialisiert und kann in jeder kalten Raum oder großer Kühlschrank durchgeführt werden, so dass es eine ideale Methode für Labors, die nur begrenzten Zugang zu spezialisierten Geräten wie einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer (FACS) oder Elutriator haben.

Introduction

Säugetier Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, der Differenzierung in den Samenkanälchen der Hoden ^ein in mehreren Stufen erfolgt. Kurz gesagt, wie Stammzellen-Spermatogonien, die in der Nähe des Epithels der Samenkanälchen Kluft wohnen und differenzieren sich in Spermatozyten, die dann meiotischen Teilungen zu unterziehen. Nach Abschluss der Meiose ist die resultierenden haploiden Zellen oder runden Spermatiden, Spermiogenese unterziehen, eine Differenzierung, die den Abbau von Zytoplasma und Verdichtung der Kern beinhaltet. Spermatiden schrittweise ein Flagellum und Dehnung und Kondensation des Kerns unterzogen, wodurch verlängert und dann Kondensie....

Protocol

Die STA-PUT-Protokoll in drei Stufen: 1) aus dem Gerät und Reagenzien Set, 2) Herstellung der Zellsuspension aus ganzen Hoden, und 3) für Zellen, Sedimentation und Fraktionssammlung. Wenn von einem Team von zwei Forschern durchgeführt wird, nimmt das Protokoll 8 Stunden im Durchschnitt.

1. Einrichten der STA-PUT-Apparat (Abbildung 1)

*** STA-PUT-Geräte sollten im 4 ° C großen Kühlschrank oder einem kühlen Raum, der auch einen Fraktionssammler aufnehmen kann gestellt werden, wenn das Verfahren der Sammlung wird bevorzugt.

1. In der Nacht vor (oder zumindest ein paar Stunden vor) Sie das Verfahren durchz....

Results

Die ideale Ergebnis der STA-PUT Verfahren ist ein recht bemerkbar Trennung von Zellen aus den Hoden, basierend auf Zellgröße und Dichte. Während Zellen aus dem Hoden isoliert werden durch die BSA-Gradienten sedimentieren, können mehrere verschiedene Bands von Zellen beobachtet werden. Irgendwelche Klumpen von Zellen dazu neigen, auf den Boden des Gradienten sinken und wird nicht verunreinigen die anderen Fraktionen. Ein wenig weiter oben in der Steigung wird die große somatischen und meiotischen Zellen sein. Weiter oben.......

Discussion

Diejenigen, die Spermatogenese studieren verlassen sich auf Tiermodelle für die Spermatogenese Zellproben, wie eine zuverlässige Zellkultursystem noch nicht zur Erzeugung spermatogenen alle Zelltypen ³ existieren. Obwohl spermatogenen Zellen leicht aus ganzen Hoden gesammelt, führt nur eine gemischte Bevölkerung. Dies stellt ein Problem für diejenigen, die auf bestimmte Subtypen dieser Zellen, wie meiotischen Zellen, runden Spermatiden, und Kondensations Spermatiden studieren möchten. Drei verschiedene Method.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BSA	Affymetrix/USB	10857 100MG	Alternate kann verwendet werden.
0,5 %, 2 % und 4 % BSA-Lösungen	Lösen Sie 0,25 g, 11 g bzw. 22 g in einem Gesamtvolumen von 50 ml, 550 ml bzw. 550 ml 1x KREBS.	Wird noch zum Tag des STA-PUT-Verfahrens gemacht. Filter sterilisieren.
KREBS (10x)	3,26 g KH2PO4 + 139,5 g NaCl +5,89 g MgSO4/7H20 + 40 g Dextrose + 3,78 g CaCl2/2H20 + 7,12 g KCl, mit ddH20	Autoklav/Filter auf 2 L bringen und bei 4 lagern; C für mehrere Monate zu halten.
KREBS (1x)	4,24 g NaHCO3 in 100 ml ddH20 auflösen. 200 ml 10x KREBS zugeben. Mit ddH20 auf 2 L bringen.	Wird noch zum Tag des STA-PUT-Verfahrens gemacht. Filter sterilisieren.
Kollagenase	Sigma	C9891-1G
DNAse	Sigma	DNEP-5MG
Trypsin	Sigma	T9201-1G
DAPI	Präferenz des Forschers
Triton-X100	Präferenz des Forschers
Formaldehyd (~37%)	Präferenz des Forschers
TABELLE 2: AUSRÜSTUNG
Ausrüstung	Firmenkatalog	#	Kommentare
Komplettes STA-PUT Gerät	ProScience Glass Shop	STA-PUT (bei diesem Verfahren wird die Standard-Sedimentationskammer verwendet: Kat. Nr. 56700-500)	Enthält alle Glaswaren und Geräte für das Gerät. Alternative Glaswaren sind für die Durchführung von STA-PUT mit kleineren Zellzahlen erhältlich.
10 μ m Maschenfilter	Fisherbrand	22363549
Maus-Sezierwerkzeuge	Präferenz des Forschers
14 ml Sammelröhrchen mit rundem Boden und Kappen	Präferenz des Forschers
Benötigt ca. 100 Röhrchen
Fraktionssammler	GE Healthcare Life Sciences	Modell: Frac-920, Produktcode: 18-1177-40	Alternative kann verwendet werden.
Objektträger, Deckglas	Präferenz des Forschers
Licht-/Fluoreszenzmikroskop	Präferenz des Forschers