Multiplex-Fluoreszenz-Mikroarray für Menschenspeichelproteinanalytik Verwendung von Polymer-Mikrosphären und LWL-Bundles

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zum Profilieren von Speichelproteinen mit gemultiplexten Basis von Mikroarrays Antikörper. Monoklonale Antikörper wurden kovalent an Fluoreszenzfarbstoff-codierten 4,5 &mgr; m-Mikrokugeln unter Verwendung von Carbodiimid-Chemie gebunden. Die modifizierten Mikrosphären wurden in faseroptischen Mikrovertiefungen abgeschieden, um Protein-Spiegel im Speichel mittels Fluoreszenz-Sandwich-Immunoassays zu messen.

Abstract

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum gleichzeitigen Messen von sechs Proteine ​​im Speichel unter Verwendung einer faseroptischen Mikrokügelchen basierende Antikörperarray. Die Immuno-Array-Technologie eingesetzt verbindet die Vorteile der Mikrokugel-Suspension auf Basis der Arrayherstellung unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Wie in der Video-Protokoll beschrieben, wurden im Handel erhältliche 4,5 um Polymermikrokugeln in sieben verschiedenen Typen, durch die Konzentration der beiden Fluoreszenzfarbstoffe physikalisch innerhalb der Mikrokügelchen eingeschlossen differenziert codiert. Die codierten Mikrosphären, die Oberfläche Carboxyl-Gruppen wurden mit monoklonalen Fänger-Antikörper über EDC / NHS-Kopplungschemie modifiziert. Um das Protein-Mikroarray zusammenzubauen, wurden die unterschiedlichen Typen von kodierten und funktionalisierten Mikrokugeln gemischt und zufällig in 4,5 um Vertiefungen, die an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels chemisch geätzt wurden abgeschieden. Die Glasfaserbündel wurde sowohl als Träger und für die Abbildung der m verwendeticrospheres. Nach der Montage wurde die Microarray verwendet, um Proteine ​​im Speichel Überstand aus der Klinik gesammelt zu erfassen. Der Nachweis erfolgte auf einem Sandwich-Immunoassay unter Verwendung einer Mischung von biotinylierten Detektionsantikörper für unterschiedliche Analyten mit einer Streptavidin-konjugierten Fluoreszenzsonde, R-Phycoerythrin basiert. Der Mikroarray wurde durch Fluoreszenzmikroskopie in drei Kanäle, zwei für Mikrokügelchen Registrierung und eine für das Assay-Signal abgebildet. Die Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden dann dekodiert und mit einer hausgemachten Algorithmus in MATLAB analysiert.

Introduction

Seit der ersten Microarray von Mark Schena und Mitarbeiter in der Mitte der 1990er Jahre berichtet, hat dieses leistungsstarke Werkzeug in vielen Bereichen der biologischen Forschung ¹ verwendet worden. Antikörper-Microarrays, die gleichzeitig mehrere Erfassungs Proteine ​​in diagnostischen Flüssigkeiten, wie Blut, haben wichtige Anwendungen in der klinischen Diagnostik und Screening Biomarker ^2-10. Speichel enthält viele der gleichen Analyten wie Blut, hat als eine bevorzugte Alternative zu Blut in Betracht gezogen worden, weil Speichel Sammlung ist sicher, nicht-invasive, und kann von minimal ^{11 bis 13} ausgebildetes medizinisches Personal durchgeführt werden. Derzeit ist Multiplexproteinanalyse mit Speichelproben von mehreren wichtigen Faktoren ab, einschließlich der niedrigen Konzentration der Ziel-Analyt ¹⁴ und dem weiten Konzentrationsbereich der verschiedenen Biomarker ¹⁵ begrenzt.

.

Hier zeigen wir die Analyse von sechs Proteine: human vascular endothelial growth factor (VEGF), Interferon-gamma-induziertes Protein 10 (IP-10), Interleukin-8 (IL-8), epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Matrix Metallpeptidase 9 (MMP-9), Interleukin-1 beta (IL-1β) . Die Leistungsfähigkeit des Verfahrens wurde zunächst unter Verwendung von Standardlösungen bilden Analyten rekombinanten Proteinen und Blocking-Puffer überprüft. Echtspeichelproben von Patienten mit verschiedenen chronischen Atemwegserkrankungen sowie gesunden Kontrollen gesammelt wurden auch mit zufriedenstellenden Leistung getestet. Das Protokoll ist anwendbar auf andere Protein Analyten und anderen Mikrokügelchensystem sein. Diese Plattform bietet erhebliche Vorteile für den Bereich Analytische Chemie, wie es ermöglicht eine schnelle, genaue und reproduzierbare gleichzeitige Analyse von geringen Konzentrationen von mehreren Proteinen mit einem breiten Dynamikbereich, minimale unspezifische Wechselwirkungen, reduzierte Probenverbrauch und niedrige Kosten im Vergleich zu einer analog Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA).

Protocol

Fig. 1 ist. . Workflow zum Anlegen faseroptischen Mikrokügelchen Antikörperarray Speichel Profilierung (1) Mikrosphären werden intern mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen codiert, (2) die codierten Mikrosphären werden extern mit Protein-spezifischen monoklonalen Antikörpern modifiziert, (3) die Multiplex-Mikrosphären vermischt werden, und (4) nach dem Zufallsprinzip in Vertiefungen an dem proximalen Ende eines faseroptischen Bündels geätzt abgeschieden, (5) Speichelproteine ​​sind durch Mikrokugeln durch Sandwich-Immunoassay erfasst, und (6) quantifiziert, unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie.

1. Mikrosphären Encoding

1. Wiegen Natrium Europium (III)-Trihydrat thenoyltrifluoroacetonate (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) in einer braunen Glasflasche und bereiten eine 200 mM Stammlösung in Tetrahydrofuran (THF). Vorsichtig mischen; visuell überprüfender Farbstoff vollständig gelöst ist.
2. Wiegen Cumarin-30 (C30, MW = 347,41 g / mol) in einer braunen Glasflasche und bereiten eine 12 mM Stammlösung in THF. Vorsichtig mischen; visuell überprüfen, ob der Farbstoff vollständig gelöst ist.
3. Bereiten Sie 700 ul der Arbeitslösung für jede Art Mikrokügelchen mit den Stammlösungen und THF bis zur endgültigen Konzentration in Tabelle 1 aufgeführt zu erreichen.
4. Stellen Sie sicher, Mikrokugeln (10% w / v) sind gut durch Vortexen suspendiert und übertragen dann 60 ul Suspension bis zu einer 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
5. In 600 ul PBS auf Mikrokügelchen-Suspension und mischen durch Pipettieren von 20x. Zentrifugieren bei 10.000 rpm für 3 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand. Wiederholen Sie diesen Vorgang ein weiteres 2x um die Mikrosphären zu waschen.
6. THF mit einem ähnlichen Verfahren wie in Schritt 1.5 wäscht den Mikrosphärenpellet 3x.
7. Zentrifugieren Sie die Mikrosphären / THF-Suspension bei 10.000 rpm für 3 min, den Überstand und resuspendieren des Pellets in 600 ulArbeitslösung in Tabelle 1 aufgeführt. Das Gemisch wird in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
8. Verschließen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen mit Parafilm und legen Sie es auf einem Schüttler. Schütteln bei 3000 Upm und Inkubation für 24 Stunden, vor Licht schützen indem die Setup mit eine Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
9. Zentrifugieren der Mikrokügelchen-Suspension bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden.
10. Entfernen Sie den Überstand Farbstofflösung, waschen die Mikrokugeln 6x mit 600 ul Methanol und dann mit 600 ul PBS mit 0,01% Tween-20 ein weiteres 6x, wie in Schritt 1.5 beschrieben.
11. Bewahren Sie die codierten Mikrokügelchen in 600 ul PBS mit 0,01% Tween-20 bei 4 ° C bis zur Verwendung, vor Licht schützen.

Microsphere Typname:	1	2	3	4	5	6	7
Eu-TTA (mM)	100	100	10	100	10
C30 (mM)		1	1	6	6	1	6

Tabelle 1. Die Konzentrationen von Eu-TTA und C30 Arbeitslösungen.

2. Herstellung von Protein-Mikrokügelchen Erfassungs

1. Vorbereitung MES-Puffer [2 - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES), 0,1 M, NaCl 0,9%, 0,01% SDS, pH 5,7] und PBS / SDS-Puffer (0,01 M Natriumphosphat, 0,154 M NaCl, 0,01% SDS, pH-Wert 7,4) im voraus bei Raumtemperatur.
2. In 200 ul codierten Mikrokügelchen-Suspension (mit ~ 2 mg Mikrosphären) in eine Safe-Lock 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Es ist wichtig, diese Art von Mikrozentrifugen-Röhrchen zu verwenden, um ein Verschütten während der Inkubation in Schritt 2.6 zu vermeiden.
3. Waschen Sie die Mikrokügelchen mit 600 ul MES-Puffer 3x wie in Schritt 1.5 beschrieben. In 700 ul MES an das Mikrosphärenpellet und gut mischen durch Pipettieren.
4. Vorbereitung 0,105 g / ml 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimid-Hydrochlorid (EDC, MW = 191.7 g / mol) und 0,163 g / ml Sulfo-N-Hydroxysulfosuccinimid (Sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) Lösungen im MES-Puffer in getrennten Röhren.
5. In 150 ul frisch für Tropfen in die Mikrosphären Suspension hergestellt EDC-Lösung Tropfen. Das EDC hydrolysiert sehr schnell, so ist es wichtig, frisch zubereitete Lösung verwenden, um die Immobilisierung Effizienz zu gewährleisten. Unmittelbar nach der Zugabe des EDC, fügen Sie 150 ul Sulfo-NHS-Lösung für die Mikrosphären, gut mischen durch Pipettieren und überprüfen Sie die Suspension homogen ist.
6. Das Röhrchen, verschließen Sie diese mit Parafilm, und legen Sie es auf einem Schüttler. Schütteln bei 1500 rpm für 4 Stunden, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
7. Zentrifugieren Sie die Mikrokügelchen suspensIonen bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden, und Entfernen des Überstandes. Waschen der Mikrokügelchen mit 500 ul PBS / SDS Puffer 3x wie in Schritt 1.5 beschrieben.
8. In 200 ul PBS / SDS-Puffer zum Pellet, mischen die Mikrosphären gut und die Lösung zu 300 ul PBS / SDS-Puffer mit 60 ug Fänger-Antikörper. Es ist wichtig, die Mikrosphärenpellet ersten auszusetzen und dann das Mikrosphärensuspension in der Antikörperlösung.
9. Inkubation des Antikörper-Mikrosphären Mischung von bei 1.500 rpm für 4 Stunden auf einem Schüttler schütteln, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
10. Zentrifugieren der Mikrokügelchen-Suspension bei 10.000 rpm für 3 Minuten, um ein Pellet zu bilden, und Entfernen des Überstandes. Mit 500 ul StartingBlock (TBS) Blockierungspuffer 3x, wie in Schritt 1.5 beschrieben Waschen der Mikrokügelchen.
11. Mix-Mikrokügelchen mit 1 ml TBS Blocking-Puffer und Inkubation Mikrosphären bei 1500 UpM für 1 h auf einem Schüttler, vor Licht schützen mit einem Kasten BuchtRot mit Aluminiumfolie.
12. Zentrifugieren Sie die Mikrosphärensuspension bei 7000 rpm für 3 min, um ein Pellet zu bilden, und entfernen Sie den Überstand. Mit 500 ul TBS Blockierungspuffer, wie in Schritt 1.5 beschrieben 3x Waschen des Pellets.
13. Zentrifugieren Sie die Mikrokügelchen-Lösung bei 7000 rpm für 3 min, um ein Pellet zu bilden, und entfernen Sie den Überstand. In 500 ul TBS Blockierungspuffer und mischen durch Pipettieren.
14. Speichern Sie die geänderten Mikrosphärensuspension bei 4 ° C bis zur Verwendung, vor Licht schützen.
15. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um andere Arten von Mikrokügelchen mit entsprechenden Antikörpern zu machen.

3. LWL-Microarray-Versammlung

1. Mischungs 50 ul jeder Art von Protein-Mikrokügelchen Erfassung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen autoklaviert. Zentrifugieren Sie die Lager-Mikrokügelchen bündeln bei 7.000 rpm für 3 min, und entfernen Sie den Überstand, so dass das Restvolumen beträgt ca. 100 ul.
2. Hand geschnitten Glasfaserbündel bis ca. 5 cm in der Länge undsequentiell polieren beide Enden auf einer Poliermaschine unter Verwendung von 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 und 0,05 &mgr; m-Größe Diamant Läppfilmen. Beschallen des polierten Bündel in entionisiertem Wasser für 2 Minuten, um alle Teilchen zu entfernen.
3. Setzen Sie einen kleinen magnetischen Rührstab in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 400 ul von Protein-freien PBS-Puffer und rühren auf einer Magnetplatte Rühren für 30 min, um Luftblasen zu entfernen.
4. Ätzen eines Endes des polierten Faserbündel in einer 0,025 N HCl-Lösung für 150 sec ^10,16. Sofort tauchen und beschallen die geätzt Ende in VE-Wasser für 1 min. Trocknen Sie die Faserbündel mit Druckluft.
5. Montieren Sie die Faserbündel auf einem Faserhalter und blockieren die geätzt Ende in der blasenfreien, Protein-freien PBS-Puffer für 1 Stunde.
6. Hinterlegung 1 ul Aliquot der gespeicherten Mikrokügelchen-Suspension auf der geätzten Ende des faseroptischen Bündels. Schützen Sie das Setup von Licht mit einer Box mit Aluminiumfolie und warten Sie 15 min. Das Volumen der Suspension wirdverringern durch Verdampfung und zwingen die Mikrosphären in die geätzten Mikrovertiefungen. Wiederholen Sie diesen Ladeschritt noch einmal.
7. Verwenden Sie ein Wattestäbchen mit Probenlösung gesättigt, um Mikrosphären, die nicht in die Kavitäten eingefangen werden, zu entfernen. Die Protein-Microarray ist jetzt einsatzbereit. Gehen Sie sofort zum Speichel-Analyse Schritt 4.1.

4. Speichelprobenanalyse mit Mikrosphären, Microarray

1. In 200 ul Probenlösung (100 ul Speichelüberstand mit einem gleichen Volumen StartingBlock T20 (PBS) verdünnt Blockierungspuffer. Die Sammlung Protokoll für Speichelüberstand wurde zuvor veröffentlicht worden ^10). in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen autoklaviert. Tauchen Sie den Protein-Mikroarray auf der Faser in die Lösung eingelegt und Inkubation auf dem Schüttler bei 600 rpm für 2 Stunden, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
2. Es werden 20 ml Waschpuffer durch Zugabe von 200 &mgr; l 10% BSA-Lösung und 200 &mgr; l 10% Tween-20 in 19,6 ml PBS, mix gut durch leichtes Schütteln.
3. Tauchen Sie den Protein-Microarray in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen mit autoklaviert 200 ul Waschpuffer und schütteln bei 600 rpm für 2 min. Wiederholen Sie diesen Wasch 3x.
4. Inkubieren des Mikroarrays in 100 ul Lösung eines Detektions-Antikörper-Cocktail, enthaltend 5 ug / ml Anti-VEGF-, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β biotinylierter Detektionsantikörper in StartingBlock T20 (PBS) Blockierungspuffer für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler bei 600 rpm, vor Licht mit einer Box mit einer Aluminiumfolie abgedeckt.
5. Wie in Schritt 4.3 beschrieben Waschen Sie den Microarray-3x mit Waschpuffer.
6. Inkubieren Sie die Microarray in 200 ul 20 ug / ml Streptavidin-R-Phycoerythrin-Konjugat (SAPE)-Lösung in PBS bei 600 rpm auf dem Schüttler für 10 min, vor Licht schützen mit einer Box mit Aluminiumfolie abgedeckt.
7. Wie in Schritt 4.3 beschrieben Waschen Sie den Microarray-5x mit Waschpuffer.
8. Reinigen des distalen Endes der Faser (dh das Ende entferntvon den Mikrosphären) Bundle mit einem Tupfer mit absolutem Ethanol gesättigt.
9. Trocknen beide Enden der Faser mit Druckluft. Montieren der Faser auf einem Epifluoreszenz-Mikroskop und Bild durch das distale Ende der Faser.
10. Erwerben Mikrokügelchen-Bilder entsprechend Eu-TTA, C30, und SAPE Fluoreszenzemissionsintensitäten. Optische Filter-Setup und Belichtungszeiten für Fluoreszenz-Bildgebung des Eu-TTA, C30 und SAPE sind in Tabelle 2 dargestellt.

Kanal	Eu-TTA	C30	SAPE
Exciter	365/10x	350/50x	546/10x
Strahlteiler	525DCLP	400DCLP	560LP
Emitter	620/60m	460/50m	580/30m
Belichtungszeit	1 Sek.	0,3 s	1 Sek.

Tabelle 2. Parameter für die drei Fluoreszenzbilder des Mikroarrays.

Results

Fluoreszenzbilder von drei Kanälen, die einen kleinen Abschnitt des faseroptischen Bündels in den 2A-C gezeigt. Diese Bilder wurden unter Verwendung eines Algorithmus in Matlab analysiert (wie detaillierter in der Diskussion beschrieben). Die Analyse verwendet sowohl Daten aus der EU-TTA Bildcodierung (2A) und der C30-Codierung Bild (Fig. 2B), um die Mikrosphären zu decodieren, und die Fluoreszenzintensitäten verschiedener Mikrokugeln in dem Bildsignal (Fig. 2C)...

Discussion

Forscher sollten Sie besonders auf die folgenden Schritte beachten: für bessere Dekodierung Genauigkeit, ist es notwendig zu überprüfen, die Mikrokugeln wurden homogen in allen Inkubation suspendiert und Waschschritte während der Mikrosphären Verschlüsselungsverfahren. Darüber hinaus müssen die codierten Mikrosphären, von Licht während des gesamten Experiments zu schützen. Nach korrekter Kodierung und Lagerungsverfahren, fanden wir, dass die Gesamt Decodierung Genauigkeit von über 99% lag. Die codierten Mikrosphären bei...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Eu-TTA Farbstoff	Fisher Scientific	AC42319-0010
THF	Sigma-Aldrich	34865-100ML
Braunglasfläschchen	Fisher Scientific	03-339-23B
Cumarin 30 Farbstoff	Sigma-Aldrich	546127-100MG
Mikrosphären	Bangslabs	PC05N/6698
1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-129
PBS 10x Konzentrat	Sigma-Aldrich	P5493-1L
Wasser	Sigma-Aldrich	W4502-1L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-100ML
Tw-20	Sigma-Aldrich	P7949-100 ml
BupH MES gepufferte Kochsalzlösung	Thermo Scientific	28390
SDS	Sigma-Aldrich	05030-500ML-F
NaOH-Lösung	Fisher Scientific	SS256-500
Safe-Lock-Mikrozentrifugenröhrchen	VWR labshop	53511-997
EDC	Thermo Scientific	22980
Sulfo-NHS	Thermo Scientific	24510
Humane VEGF-Einfangantikörper	R& D Systems	MAB293
Humane IP-10-Capture-Antikörper	F& T D Systems	MAB266
Humane IL-8-Capture-Antikörper	F& T D Systems	MAB208
Humane EGF-Capture-Antikörper	F& T & D Systems	MAB636
Humaner MMP-9-Capture-Antikörper	F& T D Systems	MAB936
Humane IL-1&beta-Fängerantikörper	F& D Systems	MAB601
Maus IgG1 Isotyp-Kontrollantikörper	R& D Systems	MAB002
StartingBlock (TBS) Puffer	Thermo Scientific	37542
HCl Standardlösung 1,0 N	Sigma-Aldrich	318949-500 ml
0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Fisher Scientific	05-408-120
Proteinfreier (PBS) Puffer	Thermo Scientific	37572
Rekombinant humanes VEGF 165	Forschung & Forschung D Systems	293-VE
Rekombinante humane IP-10	R& D Systems	266-IP
Rekombinante humane IL-8	R& D Systems	208-IL
Rekombinante humane EGF	F& Fakten D Systems	236-EG
Rekombinante humane MMP-9	R& D Systems	911-MP
Rekombinantes humanes IL-1β	Forschung & Forschung D Systems	201-LB
StartingBlock T20 (PBS) Puffer	Thermo Scientific	37539
Blocker BSA in PBS	Thermo Scientific	37525
Biotinylierter VEGF-Nachweis-Antikörper	R& D Systems	BAF293
Biotinylierter IP-10-Nachweis-Antikörper	R& D Systems	BAF266
Biotinylierter IL-8-Detektionsantikörper	F& T & D Systems	BAF208
Biotinylierte EGF-Nachweisantikörper	F& T & D Systems	BAF236
Biotinylierter MMP-9-Nachweis-Antikörper	F& T & D Systems	BAF911
Biotinylierter IL-1&beta-Nachweis-Antikörper	R& D Systems	BAF201
Streptavidin, R-Phycoerythrin	Invitrogen	S-21388
Ethanol (200 proof)	Sigma-Aldrich	E7023-500ML