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Ein In-vitro-Modell zur Untersuchung der Immunantworten von mononukleären Zellen des humanen peripheren Blutes auf eine Infektion mit humanen respiratorischen Synzytialviren

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DOI:

10.3791/50766

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10. Dezember 2013

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1Laboratory of Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Radboud university medical center

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das humane Respiratorische Synzytial-Virus (HRSV) kann bei jungen Säuglingen schwere Bronchiolitis verursachen. Ein Teil der Pathogenese der schweren HRSV-Erkrankung wird durch die Immunantwort des Wirts verursacht. Die Stimulation primärer humaner Immunzellen mit HRSV bietet ein schnelles und reproduzierbares Modellsystem zur Untersuchung der Aktivierung von Entzündungswegen und Infektionen.

Zusammenfassung

Infektionen mit dem humanen Respiratorischen Synzytial-Virus (HRSV) weisen ein breites Spektrum an Krankheitsschweregraden auf, das von leichten Infektionen bis hin zu lebensbedrohlicher Bronchiolitis reicht. Ein wichtiger Teil der Pathogenese schwerer Krankheitsverläufe ist eine verstärkte Immunantwort, die zur Immunpathologie führt.

Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet wird, um die Immunantwort menschlicher Immunzellen auf eine HRSV-Infektion zu untersuchen. Zunächst beschreiben wir Methoden zur Kultivierung, Reinigung und Quantifizierung von HRSV. Anschließend beschreiben wir ein humanes in vitro Modell, in dem mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) mit lebendem HRSV stimuliert werden. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um mehrere Parameter zu untersuchen, die zur Schwere der Erkrankung beitragen können, einschließlich der angeborenen und adaptiven Immunantwort. Diese Reaktionen können auf transkriptioneller und translationaler Ebene gemessen werden. Darüber hinaus kann eine Virusinfektion von Zellen leicht mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden. Zusammengenommen bietet die Stimulation von PBMC mit lebender HRSV ein schnelles und reproduzierbares Modellsystem zur Untersuchung von Mechanismen, die an der HRSV-induzierten Erkrankung beteiligt sind.

Einleitung

Das Human Respiratory Syncytial Virus (HRSV) ist die häufigste Ursache für Infektionen der unteren Atemwege bei Kindern. Jedes Jahr infizieren sich über 33 Millionen Kinder unter fünf Jahren mit HRSV, was zu über drei Millionen Krankenhausaufenthalten und fast 200.000 Todesfällen führt1. Immer mehr Hinweise deuten darauf hin, dass HRSV auch eine erhebliche Bedrohung für ältere Menschen und Erwachsene mit chronischen Grunderkrankungen darstellt2.

Die Mehrzahl der HRSV-Infektionen bei Kleinkindern zeigt leichte Symptome, vergleichbar mit einer Erkältung, und erfordert keine klinische Intervention. Ein kleiner Teil der Patienten muss jedoch aufgrund einer schweren Bronchiolitis ins Krankenhaus eingeliefert und beatmet werden.

Ein Teil der Pathogenese der HRSV-Krankheit ist die übermäßig überschwängliche und unzureichende Immunantwort des Wirts auf eine Infektion3,4. Dies wird durch mehrere Beobachtungen verdeutlicht. Der Periode der maximalen Erkrankung geht oft der Höhepunkt der Virusinfektion voraus und fällt besser mit der zellulären Infiltration infizierter Gewebe und der Freisetzung von entzündlichen Zytokinen zusammen3. Eine weitere Beweislinie stammt aus den Formalin-inaktivierten HRSV (FI-RSV)-Versuchen in den 1960er Jahren. Anstatt bei kleinen Säuglingen einen Schutz zu induzieren, führte der Impfstoff zu einer übertriebenen Immunantwort, die zu einer verstärkten Atemwegserkrankung und einer höheren Morbidität und Mortalität führte.

Mehrere Modelle wurden entwickelt, um die Pathogenese von HRSV-Infektionen zu untersuchen. Kontinuierliche Zelllinien wie HEp-2 und A549 wurden ausgiebig zur Untersuchung von HRSV-Infektionen in vitro eingesetzt. Epithelzellen sind die primären Ziele der HRSV-Infektion5, daher wurde viel Wert auf diese Zelltypen gelegt. Die in vivo-Situation ist jedoch viel komplexer und nicht auf einen Zelltyp beschränkt. Um diese komplexen Wechselwirkungen zu untersuchen, wurden mehrere tierische Infektionsmodelle entwickelt, um die HRSV-Pathogenese zu untersuchen. Bisher wurden zwei verschiedene Strategien verfolgt, die sich entweder auf heterologe (nichtmenschliche) Modelle sowie auf verwandte Wirt-Pneumovirus-Modelle konzentrierten. Beispiele für heterologe Modelle für HRSV sind Schimpansen, Schafe, Baumwollratten und Mäuse. Die RSV-Infektion in seinem natürlichen Wirt wurde bei Rindern und Mäusen mit Rinder-RSV bzw. Pneumoviren untersucht.

Obwohl jedes dieser Modelle wichtige Einblicke in die Krankheitspathogenese geliefert hat, ist HRSV stark an den Menschen angepasst. Daher schlagen wir vor, zusätzlich zu den derzeit verwendeten Zelllinien und Tiermodellen humane primäre PBMCs als Modell für die Stimulation mit HRSV zu verwenden. Humane PBMCs können von einer Reihe von Personen bezogen werden, um spezifische Forschungsfragen zu beantworten, darunter Kleinkinder6, immungeschwächte Personen sowie gesunde Erwachsene7 oder ältere Personen8. PBMCs können verwendet werden, um angeborene Aspekte der Infektion sowie die adaptive Reaktion auf das Virus zu untersuchen. Aktivierte Entzündungswege, die für die Pathogenese der HRSV-Erkrankung wichtig sind, können auf mRNA- und Proteinebene untersucht werden. Darüber hinaus kann die Virusinfektion von (Untergruppen von) Immunzellen mittels Durchflusszytometrie bestimmt werden. Wir haben dieses Modell bereits verwendet, um die synergistischen Effekte einer HRSV-Infektion zusammen mit dem bakteriellen Liganden Muramyldipeptid (MDP) auf die Induktion von proinflammatorischen Zytokinenzu identifizieren 7. Wir schlagen vor, die HRSV-Stimulation von humanen primären PBMCs als robustes, einfaches und schnelles in vitro-Modell zu verwenden, um Entzündungswege zu untersuchen, die an der Pathogenese der HRSV-Erkrankung beteiligt sind.

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Protokoll

Hinweis:

Experimente mit HRSV müssen in einem Sicherheitswerkbank im Biosicherheitslabor der Stufe 2 durchgeführt werden. Sammeln Sie alle virusbelasteten Abfälle und Materialien, die mit dem Virus in Kontakt gekommen sind, zur ordnungsgemäßen Entsorgung aufgrund der biologischen Gefährdung.

Besondere Vorsichtsmaßnahmen müssen bei der Verwendung von potenziell infiziertem menschlichem Blut beachtet werden.

Es ist entscheidend, endotoxinfreie Reagenzien in allen Protokollen zu verwenden.

1. Kultivierung von HRSV A2

  1. Kultivieren Sie HeLa- oder HEp-2-Zellen in DMEM-Medium + 10 % fetalem Kälberserum (FCS) + 1 % Penicillin/Streptomycin (P/S) in einer 175 cm²-Flasche bei 37 °C und 5 % CO₂.2 Kulturflasche, bis sie etwa 50 % konfluent sind.
  2. Die Zellen dreimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung bei Raumtemperatur waschen (PBS).
  3. Tauen Sie eine Ampulle mit HRSV-Inokulationsstammvirus bei 37 °C in einem Wasserbad. Verdünnen Sie den Virusstamm so, dass die MOI bei 0,1 oder darunter liegt. Dies verhindert die Bildung defekter interferierender Partikel (DIPs). Verdünnen Sie den Virusstamm in 4 ml/Flasche Infektionsmedium (DMEM + 1 % P/S) und geben Sie es zu den HeLa- oder HEp-2-Zellen. Halten Sie dieses Volumen so gering wie möglich, ohne dass die Zellen austrocknen. Je geringer das Volumen, desto höher ist die Infektionsrate.
  4. Inkubieren Sie 2–4 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂2. Schwenken Sie den Kolben alle 15 Minuten, um das Medium gleichmäßig umzuverteilen.
  5. Entfernen Sie das Inokulum und waschen Sie einmal mit PBS.
  6. Geben Sie 15 ml Kulturmedium (DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S) hinzu und inkubieren Sie für 3–5 Tage bei 37 °C, 5 % CO₂2. Beobachten Sie die Zellen mit normaler Hellfeldmikroskopie auf virusinduzierte zytopathologische Veränderungen. z. B. Bildung von Syncytien und Zelltod sowie schwebende Zellen.
  7. Wenn eine zytopathische Wirkung auftritt, gewinnen Sie HRSV durch Abkratzen der Zellen und sammeln die Virus-Suspension in einem sterilen 50-ml-Röhrchen. Vortexen Sie die Zellsuspension. Das Abkratzen und Vortexen der Zellen setzt mehr virale Partikel frei.
  8. Zentrifugieren Sie die Virus-Suspension 10 min bei Raumtemperatur mit 1.800 x g, um das Zelltrümmern zu pelletieren. HRSV bleibt in diesem Schritt im Überstand, da es bei dieser Zentrifugalkraft nicht pelletiert, und der Überstand kann direkt zur Infektion mehrerer 175 cm²-Flaschen verwendet werden.2 Flaschen oder kann bei -80 °C als Ansaatbestand in 1-ml-Aliquoten für die spätere Verwendung. HRSV stets im flüssigen Stickstoff schockgefrieren, um einen Verlust infektiöser Viruspartikel zu verhindern.
  9. Wie oben angegeben, wird der mit dem obigen Protokoll hergestellte Ansatz verwendet, um mehrere 175 cm²-Flaschen zu infizieren.2 Kulturflaschen. Wiederholen Sie das exakte Protokoll, um mehr Virus für die Reinigung zu produzieren. Reinigen Sie bis zu 180 ml Virus-Suspension in einem Ultrazentrifugationszyklus.
  10. Wenn eine zytopathische Wirkung auftritt, HRSV durch Abkratzen der Zellen ernten und das Überstandmedium sammeln. Die Virus-Suspension vortexen. 10 min bei Raumtemperatur mit 1.800 × g zentrifugieren, um zelluläre Trümmer zu pelletieren. HRSV bleibt bei dieser Zentrifugationsgeschwindigkeit im Überstand und wird in Portionen zu je 15 ml pro 50-ml-Röhrchen abgefüllt. Sofort einfrieren und bei −80 °C bis zur Reinigung.

2. Reinigung von HRSV

Hinweis: Bevor Sie eine Ultrazentrifuge verwenden, beachten Sie, dass es sich um ein potenziell gefährliches Gerät handelt. Lesen Sie die Bedienungsanleitungen und führen Sie die erste Ultrazentrifugation unter Aufsicht einer erfahrenen Person durch.

  1. Reinigen Sie die Ultrazentrifugen-Eimer mit 70 %igem Ethanol und lassen Sie sie in einem Sicherheitswerkbank trocknen.
  2. Stellen Sie ein steriles Zentrifugenröhrchen in jeden Eimer.
  3. Bereiten Sie eine 30 %ige (w/v) Saccharose-Lösung in PBS zu, filtrieren und sterilisieren Sie diese (0,2-µm-Filter) und geben Sie 5 ml auf den Boden jedes Zentrifugenröhrchens. Für eine schnellere Protokollführung können die Röhrchen mit der Saccharose-Lösung eingefroren werden. Achten Sie darauf, dass sie steril bleiben.
  4. Falls die Saccharose-Lösung nicht eingefroren wurde, geben Sie vorsichtig 30 ml HRSV-Lösung auf die Saccharose-Lösung. Pipettieren Sie langsam, um die Saccharose-Lösung nicht zu stören. Halten Sie eine klare Trennlinie. Falls die Röhrchen eingefroren waren, gießen Sie die virale Suspension auf die gefrorene Saccharose-Lösung und lassen Sie diese anschließend auftauen.
  5. Wägen Sie die sechs Ultrazentrifugen-Eimer sorgfältig mit steriler PBS aus. Stellen Sie die Waage in eine Flusswerkbank, um alles steril zu halten. Füllen Sie die Röhrchen bis 3–5 mm unter den Rand, da sonst die Zentrifugenröhrchen einbrechen können. Wägen Sie die Eimer bis auf 0,1 g genau aus und berücksichtigen Sie dabei die Schraubkappen, falls diese nicht perfekt identisch sind.
  6. Zentrifugieren Sie im Ultrazentrifugator 1,5 Stunden bei 4 °C und 20.000 rcf.
  7. Entfernen Sie das Zentrifugenröhrchen vorsichtig mit sterilen Pinzetten aus dem Eimer. Die Viruspartikel sind durch die Saccharoseschicht hindurchgegangen und haben ein Pellet gebildet. Dagegen verbleiben von Zellen sezernierte lösliche Faktoren (z. B. Zytokine) in der Lösung. Kippen Sie das Zentrifugenröhrchen, um die gesamte Flüssigkeit ablaufen zu lassen. Lassen Sie es kopfüber auf einer sterilen Oberfläche, z. B. einer Kulturschale, trocknen, aber achten Sie darauf, dass das Pellet nicht vollständig austrocknet.
  8. Geben Sie vorsichtig 1 ml Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) zum Pellet und kippen Sie das Zentrifugenröhrchen, um die HBSS ablaufen zu lassen. Lassen Sie das Röhrchen erneut kopfüber auf einer sterilen Oberfläche trocknen. Lassen Sie das Pellet nicht vollständig austrocknen.
  9. Lösen Sie das Pellet durch 40-maliges Auf- und Abpipettieren in 1 ml HBSS wieder auf. Versuchen Sie, die Bildung von Luftblasen zu vermeiden, da diese das Virus zerstören können.
  10. Portionieren Sie das Virus, schockgefrieren Sie es in flüssigem Stickstoff und lagern Sie es bei -80 °C bis zur weiteren Verwendung. Verwenden Sie für jedes Experiment eine neue Portion des Virus, da wiederholtes Einfrieren und Auftauen die infektiöse Titer reduziert. Zum Auftauen erwärmen Sie das Virus stets auf 37 °C, da HRSV zwischen -20 und 15 °C weniger stabil ist.

3. Quantifizierung von HRSV

Hinweis: Wiederholen Sie die Quantifizierung zur Sicherstellung reproduzierbarer Daten mindestens dreimal im Duplikat.

3.1. Infektion von A549-Zellen

  1. Kultivieren Sie A549-Zellen in einer 24-Loch-Platte, bis sie konfluent sind.
  2. Waschen Sie die A549-Zellen zwei Mal mit jeweils 1 ml PBS bei Raumtemperatur.
  3. Bereiten Sie 5-fache serielle Verdünnungen von HRSV in Medium mit reduziertem Serum vor. Geben Sie 100 μl der verdünnten Virenprobe in beide Vertiefungen. Erstellen Sie mindestens 4 Verdünnungen (z. B. 4-, 20-, 100- und 500-fach). Fügen Sie zwei zusätzliche Vertiefungen hinzu, die mit der höchsten Virusdosis infiziert werden (diese dienen als Isotyp-Kontrolle), sowie zwei nicht infizierte Kontrollvertiefungen (Mock-infiziert).
  4. Inkubieren Sie die Zellen 2 Stunden lang bei 5 % CO2 und 37 °C. Schwenken Sie die 24-Loch-Platte alle 15 Minuten, um Austrocknung zu verhindern.
  5. Entfernen Sie die Viruslösung und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur.
  6. Bereiten Sie 4 % (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in Medium mit reduziertem Serum vor. Sterilfiltern Sie die Lösung (0,2-μm-Filter) und geben Sie 500 μl in jede Vertiefung.
  7. Inkubieren Sie die Proben bei 5 % CO2 und 37 °C für 22 Stunden.

3.2. Vorbereitung für die FACS

  1. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen einmal mit 1 ml PBS bei Raumtemperatur.
  2. Geben Sie 200 μl vorgewärmtes Trypsin (37 °C) in jede Vertiefung und inkubieren Sie 10 min bei 37 °C, 5 % CO2.
  3. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sich die Zellen abgelöst haben. Wenn die Zellen abgelöst sind, geben Sie 800 μl DMEM + 10 % FCS + 1 % P/S hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Suspendieren Sie die Zellen erneut.
  4. Überführen Sie die Zellen in eine kegelförmige, nicht gewebekulturbehandelte 96-Well-Platte. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei Raumtemperatur. Resuspendieren Sie die Pellets in 200 μl kaltem PBS.
  5. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS.
  6. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 150 μl eiskaltem 80 % Aceton.
  7. Fixieren Sie die Zellen 15 min bei Raumtemperatur.
  8. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA.
  9. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 50 μl anti-NP-RSV-FITC (1:50 in PBS + 1 % BSA verdünnt) oder 50 μl IgG2 anti-Maus-FITC (dient als Isotyp-Kontrolle; daher dieselbe Antikörperkonzentration verwenden).
  10. Behandeln Sie die Röhrchen im weiteren Verlauf des Protokolls lichtgeschützt. Inkubieren Sie mindestens 1 Stunde bei 4 °C, jedoch kann die Inkubation bis über Nacht verlängert werden.
  11. Geben Sie 150 μl kaltes PBS + 0,1 % BSA hinzu.
  12. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA.
  13. Zentrifugieren Sie 5 min bei 400 x g bei 4 °C. Gießen Sie das Überstand ab und resuspendieren Sie in 200 μl kaltem PBS + 0,1 % BSA. Halten Sie die Platte auf Eis und lichtgeschützt bis zur FACS-Messung.
  14. Messen Sie die infizierten Zellen an einem Durchflusszytometer.

3.3. Berechnung von FITC-50

  1. Verwenden Sie ein Durchflusszytometrie-Analyseprogramm, um die Grenze anhand der negativen Kontrolle (Isotypkontrolle) festzulegen. Verwenden Sie den Pseudofarben-Diagrammtyp. Zeichnen Sie ein Quadrantengatter, bei dem die positiven Zellen im Feld Q3 liegen. Der Prozentsatz an falsch-positiven Ergebnissen sollte in beiden Isotypkontrollen unter 0,2 % liegen.
  2. Exportieren Sie die Daten in ein Tabellenkalkulationsprogramm und erstellen Sie eine Tabelle mit dem Prozentsatz an FITC+ Zellen für jede Verdünnung. Subtrahieren Sie für jeden Wert den Mittelwert der falsch-positiven Ergebnisse (wie durch die Isotypkontrolle bestimmt) je Experiment.
  3. Öffnen Sie eine neue Datei (XY-Streudiagramm, einzelner X- und mehrere Y-Spalten) in einem Statistikprogramm. Übertragen Sie die Daten in dieses Programm: X = Verdünnung, Y = % infizierter Zellen, n = 3, verwenden Sie den Mittelwert aus zwei Messungen für jede Verdünnung. Führen Sie eine nichtlineare Regression durch, statistische Analyse mit einphasigem exponentiellem Zerfall. Prüfen Sie, ob die Kurve zu den Datenpunkten passt; falls nicht, wählen Sie eine andere statistische Analyse.
  4. Kopieren Sie die Gleichung der Kurve und die Werte für die Gleichung in ein Tabellenkalkulationsprogramm. Berechnen Sie den X-Wert für Y = 50 %. Bestimmen Sie entsprechend den FITC-50-Wert, indem Sie die mittels FITC nachgewiesenen infektiösen Partikel/ml (FIP/ml) bei der Verdünnung berechnen, bei der eine 50 %ige Infektion vorliegt, unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    Formel zur Berechnung von FITC50; Diagramm zur Veranschaulichung der Gleichung zur Messung der Fluoreszenzintensität.
    A = durchschnittliche Anzahl an A549-Zellen pro Mulde
    B = μl Virus pro Mulde, verwendet für die Infektion
    C = Verdünnung, bei der eine 50 %ige Infektion vorliegt

4. Isolierung peripherer mononuklearer Blutzellen (PBMC) aus Blut gesunder Probanden

  1. Entnehmen Sie venöses Blut in 10-ml-EDTA-Röhrchen von gesunden Probanden nach schriftlicher Einwilligung. Aus einem Volumen von 10 ml Blut lassen sich etwa 107 PBMCs gewinnen.
  2. Ab diesem Schritt arbeiten Sie sterilerweise im Flusswerkbank.
  3. Verdünnen Sie das Blut 1:1 mit PBS bei Raumtemperatur in einem 50-ml-Röhrchen. Pro 50-ml-Röhrchen kann ein maximales Gesamtvolumen von 35 ml verdünntem Blut verwendet werden.
  4. Nehmen Sie eine 50-ml-sterile Spritze und setzen Sie eine sterilisierte Luer-Lock-Nadel auf. Füllen Sie das Spritzengewicht mit Dichtegradientenmedium. Setzen Sie die Nadel auf den Boden eines Röhrchens mit verdünntem Blut und pipettieren Sie vorsichtig 15 ml Dichtegradientenmedium unter das verdünnte Blut. Achten Sie darauf, dass eine klare Trennlinie zwischen Dichtegradientenmedium und Blut erhalten bleibt.
  5. Zentrifugieren Sie 20 min bei 800 x g bei Raumtemperatur mit einer Beschleunigung von 9 (maximal) und ohne Bremse. Stellen Sie nach der Zentrifugation die Temperatur des Zentrifugen auf 4 °C.
  6. Die Dichtegradientenzentrifugation führt zur Bildung mehrerer Schichten. Auf dem Boden befindet sich ein Pellet aus Erythrozyten, darüber eine silbrige Schicht, die die Neutrophilen enthält. Die klare Schicht über diesem Pellet enthält das Dichtegradientenmedium. Zwischen dem Dichtegradientenmedium und der oberen plasmatischen Schicht liegt eine dünne Schicht, die die PBMCs enthält.
  7. Sammeln Sie die PBMCs vorsichtig mit einer Pasteurpipette und überführen Sie die Zellen in ein neues 50-ml-Röhrchen. Bewahren Sie die PBMCs ab sofort auf Eis auf und verwenden Sie eiskaltes PBS. Füllen Sie eiskaltes PBS auf ein Endvolumen von 50 ml auf und zentrifugieren Sie 10 min bei 400 x g und 4 °C (mit der Bremse auf Stufe 9).
  8. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen, resuspendieren Sie das Pellet in 50 ml eiskaltem PBS und zentrifugieren Sie erneut 10 min bei 400 x g und 4 °C. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
  9. Nach dem Absaugen des Überstandes geben Sie 1 ml eiskaltes Medium (RPMI + 1 % P/S) hinzu und zählen die Zellen mit einer Zählkammer.
  10. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 106 PBMCs/ml ein.

5. Stimulation von PBMCs mit lebendem HRSV

  1. Bereiten Sie einen Versuchsaufbau vor; schließen Sie für jede Bedingung experimentelle Duplikate ein.
  2. Verdünnen Sie alle notwendigen Stimuli in Medium (RPMI + 1 % P/S). Berücksichtigen Sie, dass das Endvolumen pro Vertiefung 200 μl beträgt. Es werden 50 μl Stimulus zugegeben, bereiten Sie daher 4fach konzentrierte Stimulationsansätze vor.
  3. Geben Sie 100 μl der oben genannten Zellsuspension in jede Vertiefung einer runden 96-Loch-Platte (5 x 105 PBMC/Vertiefung).
  4. Fügen Sie 50 μl der verdünnten Stimuli zu jeder Vertiefung hinzu. Es ist möglich, zwei verschiedene Stimuli hinzuzufügen, was ein Gesamtvolumen von 200 μl ergibt. Falls nur ein Stimulus benötigt wird, stellen Sie das Volumen mit Medium auf 200 μl ein.
  5. Inkubieren Sie die 96-Loch-Platte für den erforderlichen Zeitraum bei 37 °C in einem 5 % CO2-Inkubator. Für die meisten Zytokine ist eine Inkubation von 24 Stunden ausreichend.

6. Auswertung der Stimulation

  1. Nach der Inkubationszeit die 96-Well-Platte 5 min bei Raumtemperatur mit 450 x g zentrifugieren, um die Zellen am Boden zu sammeln.
  2. Den Überstand (maximal 180 μl) abnehmen und für nachfolgende Zytokinanalyse bei -20 °C oder für die Virusproduktion bei -80 °C lagern.
  3. Die im Pellet enthaltenen stimulierten PBMCs können entweder durch Zugabe von Lysepuffer für eine qPCR/Western Blot-Analyse aufgearbeitet oder alternativ für die Durchflusszytometrie angefärbt werden.

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Ergebnisse

Die hier beschriebene Kultivierungs- und Reinigungsmethode für HRSV A2 liefert eine Ausbeute zwischen 2 x 107 und 2 x 108 FITC-50-quantifizierten infektiösen Viruspartikeln/ml. Die Ergebnisse der mikroskopischen Analyse, bei der FITC-gefärbte infizierte Zellen gezählt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt), wurden mit den Ergebnissen der Quantifizierung durch FACS verglichen (Abbildung 1). Beide Methoden führten zu ähnlichen Titerwerten, wobei die FACS-Methode eine de...

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Diskussion

In dieser Studie zeigen wir, dass die Infektion von PBMC mit HRSV ein schnelles und zuverlässiges Modellsystem ist, in dem Entzündungswege untersucht werden können. Um PBMC zu stimulieren, muss ein HRSV-Bestand erstellt und quantifiziert werden.

Mehrere Zelllinien sind anfällig für eine HRSV-Infektion. Zelllinien, die am häufigsten für die HRSV-Kultivierung verwendet werden, sind HEp-2-, HeLa- und Vero-Zellen. Wir würden jedoch die Verwendung von Vero-Zellen für die Kultivierung von HRSV nicht...

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Offenlegungen

Wir haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

RSV A2 wurde freundlicherweise von Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Niederlande) zur Verfügung gestellt. MV und GF werden vom Virgo-Konsortium unterstützt, das von der niederländischen Regierung mit der Projektnummer FES0908 und von der niederländischen Genomik-Initiative (NGI) mit der Projektnummer 050-060-452 finanziert wird. Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datenerhebung und -analyse, der Entscheidung über die Veröffentlichung oder der Vorbereitung des Manuskripts.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Reagenz
PBSLonzaBE17-516FPBS ohne Ca2+ Mg2+ oder Phenolrot
HBSSInvitrogen14025-100HBSS, Calcium, Magnesium, kein Phenolrot
DMEMInvitrogen31966-047DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX, Pyruvat
RPMIInvitrogen72400054RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES
Reduced Serum Medium (Opti-MEM)Invitrogen51985-026Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX
FCS GreinerBio-oneFBS (Fötales Rinderserum)
BSASigma AldrichA7030Albumin aus Rinderserum
P/SInvitrogen15140-122Penicillin-Streptomycin, flüssiges
TrypsinInvitrogen25300-0540,05% Trypsin-EDTA (1x), Phenolrot
HeLa-ZellenATCCCCL-2
A549 ZellenATCCCCL-185
SaccharoseSigma AldrichS7903Saccharose BioXtra, ≥ 99,5%
IgG2 Anti-Maus-FITCBD Pharmingen555057Ms IgG2b K FITC Isotypkontrolle
Anti-NP-RSV-FITCAbcamab25849Anti-Respiratory Syncytial Virus Antikörper [671] (FITC)
Density gradient medium (Lymphoprep)Axis-Shield1114545
EDTA RöhrchenBD Biosciences367525
AcetonMerck Millipore1000141000Aceton für die Analyse
Material
ZentrifugenröhrchenBeckman Coulter326823Thinwall, Polyallomer, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm
SureSpin 630 Rotor mit 36 mlBechern Sorvall79368Ausschwingschaufel Titanrotor
Sorvall WX80 UltrazentrifugeSorvall46900
CB 150l CO2 InkubatorBinden

Referenzen

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