Methodenartikel

In-vivo-19 F-MRT für die Zellverfolgung

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DOI:

10.3791/50802

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25. November 2013

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1Department of Tumor Immunology, Nijmegen Center for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center, 2In-Vivo-NMR Laboratory, Max Planck Institute for Neurological Research, 3German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir beschreiben eine allgemeine Protokoll für die in-vivo-Zellortung mittels MRT in einem Mausmodell mit Ex-vivo-markierten Zellen. Ein typisches Protokoll für die Zellmarkierung, Bildaufnahme und Verarbeitung Quantifizierung ist inbegriffen.

Zusammenfassung

In-vivo-19 F-MRT ermöglicht quantitative Zell Tracking ohne Verwendung ionisierender Strahlung. Es ist eine nicht-invasive Technik, die auf den Menschen angewendet werden können. Hier beschreiben wir ein allgemeines Protokoll zur Zellmarkierung, Imaging und Bildbearbeitung. Die Technik ist anwendbar auf verschiedene Zelltypen und Tiermodellen, obwohl hier konzentrieren wir uns auf eine typische Mausmodell für die Verfolgung murine Immunzellen. Die wichtigsten Themen für die Markierung von Zellen beschrieben werden, da diese die für alle Modelle. Ähnlich sind Schlüsselabbildungsparameter aufgeführt, obwohl die Details werden in Abhängigkeit von dem MRI-System und den einzelnen Setup variieren. Schließlich sind wir ein Bildverarbeitungsprotokoll für die Quantifizierung. Variationen für diese und andere Teile des Protokolls sind in der Diskussion Abschnitt bewertet. Bezogen auf die hier beschriebenen Einzelheiten des Verfahrens, muss der Benutzer das Protokoll für jeden spezifischen Zelltyp, Zell Etikett Tiermodell und Bilddarstellungsaufbau anpassen. Beachten Sie, dass die protocol können auch für den menschlichen Gebrauch geeignet sein, solange die klinische Beschränkungen erfüllt sind.

Einleitung

In-vivo-Zellverfolgung ist wesentlich für die Optimierung und Überwachung von Zelltherapeutika 1. Aufgrund der nicht-invasiven Natur, bietet hervorragende Möglichkeiten, um Bild Zellen in vivo zu überwachen. Magnetic Resonance Imaging (MRI) ist unabhängig von ionisierender Strahlung und ermöglicht eine überlegene Bildauflösung und der intrinsischen Weichteilkontrast. MRT-basierte Tracking-Zelle bereits klinisch verwendet worden, um dendritischen Zellen bei Melanompatienten 2 folgen. Herkömmlichen klinischen MRI auf dem 1 H-Kern, in der Mobil Wasser, die in Geweben durchgeführt. Es ist auch möglich, auf andere aktive Kerne, wie 13 C, 19 F und 23 Na zuführen MRI. Doch nur 19 F-MRT wurde erfolgreich in vivo Zell Tracking, wie es bietet die höchste Empfindlichkeit nach dem 1. H. angewendet Das Fehlen von MRT nachweisbare endogene 19 F im Gewebe ermöglicht eine hohe Selektivität für die SignalNachweis von exogenem 19 F-Kontrastmittel und ermöglicht die Quantifizierung der Fluorkonzentration direkt aus den Bilddaten. Für eine ausführliche Diskussion über die 19 F-MRT, siehe 5.3. Eine Schlüsselfrage mit 19 F-MRT ist die Notwendigkeit der Entwicklung und Optimierung geeigneter 19 F-Zellen Etiketten, obwohl mehrere Etiketten entwickelt, mit einem Trend zur multimodalen Mittel 6.

Das Protokoll beschreiben wir hier auf unsere Studien von Gruppen 7-9, die die ersten waren, die in vivo quantitativ 19 F MRI-basierte Zellverfolgungs 10,11 beschrieben ist. Das allgemeine Verfahren von Zellortung mittels 19 F-MRI, ist in Fig. 1 zusammengefaßt. Wir beschreiben einen allgemeinen Protokoll zur Markierung und Bildgebung von dendritischen Zellen (DCs) mit einem maßgeschneiderten Perfluorkohlenstoffs Kontrastmittel 8. Das Abbildungsprotokoll ist allgemein anwendbar auf verschiedene Zelltypen, Etiketten und Tiermodellen. Diehier beschriebenen Zelltyp und Tiermodell sind nur als ein Beispiel genommen werden, und somit bieten wir keine Angaben zum Zellisolierung, Kennzeichnung, sondern konzentrieren sich auf die Bildgebungsprotokoll. Änderungen werden für jedes Label, Zelltyp, Tiermodell, und Imaging-Setup notwendig sein, und diese können in der Literatur gefunden werden kann oder muss, die die Forscher optimiert werden. Einige häufige Änderungen werden in die Diskussion einbezogen.

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Protokoll

Hinweis: Alle Experimente und Verfahren, die Tiere müssen in Übereinstimmung mit relevanten ethischen Richtlinien durchgeführt werden und mit den üblichen Tierpflege und humanen Anforderungen entsprechen.

1. Zellmarkierung (Standard-Protokoll mit Coinkubation)

  1. In 19 F-Label 8 bis unreifen DCs in einer Konzentration von 4 mg/10 6 Zellen (in 2 ml Medium). Vorsichtig schwenken zu mischen.
  2. Inkubieren Sie die Zellen mit dem Label für 3 Tage vor Reifung und Ernte der DCs.
  3. Sammeln Sie die DCs und entfernen Sie überschüssiges Etikett durch Waschen bei mindestens 3x in PBS. Zählen Sie die Zellen.
  4. Resuspendieren in einem kleinen Volumen von PBS für die Injektion oder eine weitere Prüfung.

Hinweis: Dieses Protokoll ist für diese speziellen DCs und Label-relevant. Das Verfahren wurde in einer anderen Publikation 8 optimiert und die hier enthalten sind nur die Schritte, um eine Probe zu Bild vorbereiten, da der Schwerpunkt dieses Protokoll ist auf der Abbildung. HReferenz das Protokoll für die Isolierung und Kultur und Kennzeichnung eines bestimmten Zelltyps müssen entweder in der Literatur oder durch den Forscher optimiert werden. Eine Zusammenfassung aller anderen 19 F-Etiketten, die in der Literatur verwendet wurden anderswo 6 dargestellt.

2. Bestimmung von 19 F / Zell Mit 19 F-NMR-

  1. Platzieren einer bekannten Anzahl markierter Zellen (typischerweise mehr als 0,5 x 10 6, oder eine Zahl, die in ausreichender Signal ergibt) in einem NMR-Röhrchen.
  2. Werden 10 &mgr; l 5%-iger Trifluoressigsäure (TFA). Wenn die Resonanzfrequenz des TFA ungeeignet wegen mit dem Label überlappen ist, verwenden Sie eine alternative lösliche Verbindung, vorzugsweise mit einem einzigen 19 F Resonanz.
  3. Legen Sie die Probe in einem NMR-Spektrometer und erhalten die 19 F-Spektrum. Sicherzustellen, dass die Bandbreite ausreichend für beide TFA (Referenz) und dem Agent.

Hinweis: Die TR sollte lang genug sein für fVoll Entspannung der Referenz und der Probe dreht (um 5 T 1-Relaxationszeit T 1 der längsten Komponente in dem Rohr, typischerweise TR ~ 5-8 sec). Einige erfordern Spektrometer D 2 O für eine Frequenz-Lock-Signal. Ein Standard-19 F-Spektrum ist ausreichend. Umfangreiche Mittelwertbildung oder höhere Zellzahlen wird erforderlich, wenn die Zellaufnahme des Etiketts schlecht ist oder wenn Zellzahlen sind niedrig. Das Spektrum sollte zwischen Referenz-und das entsprechende Etikett Peaks zentriert werden, es sei denn Korrekturen sind gemacht, um für Teilerregung Konto.

  1. Berechnung der relativen Flächen unter den Peaks der Referenz und der Probe (oder der Hauptpeak der Probe), und dann die Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von 19 der F / Zelle in der Probe.

Hinweis: Der gesamte Prozess muss wiederholt werden und gemittelt ausgiebig genug, um statistische Signifikanz zu erreichen. Dies kann auch mit Spektroskopie direkt an der MRT durchgeführt werden. However beachten, dass dieses Verfahren zeigt nur die durchschnittliche Belastung F 19 für eine große Anzahl von Zellen, nicht die Variabilität zwischen den Zellen. Überprüfen der Gleichförmigkeit Zellaufnahme erfordert die Anwesenheit einer fluoreszierenden Komponente mit der 19 F-Agent, so dass die Zellaufnahme kann mit Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert werden.

3. Überlegungen für Experimentelles Design - Handy-Injection

Durch die relativ geringe Empfindlichkeit der 19 F-MRI für Zellverfolgung, einem Tiermodell, bei dem die Zellen in großer Zahl zu lokalisieren ist in vivo-Bildgebung für erfolgreiche erforderlich. Typische Empfindlichkeitswerte reichen von 1.000-100.000 cells/voxel/1 Stunden Scanzeit 6, mit einer Zellbelastung im Bereich von 10 11 -10 13 Fluoratome.

Die Anzahl und die Häufigkeit der Bilderzeugungseinheiten müssen sorgfältig geplant werden, wie dies beeinflusst die Wahl des Anästhetikums. Beachten Sie, dass Isofluran nicht suitabl seine für 19 F-MRT, wenn die 19 F-Resonanzfrequenz von Isofluran ist nah an der des Label-Verbindung verwendet. Isofluran kann noch geeignet sein, wenn die Abbildungs ​​Sitzungen sind kurz genug, um signifikante Stau zu vermeiden. Mehrere alternative Anästhetika sind in der Literatur 10,11 verwendet, ein Beispiel ist in der Bildgebungsprotokoll enthalten. Anästhetika eventuell auf verschiedenen Mausstämmen und Krankheitsmodelle optimiert werden.

4. Entwurf eines externen Referenz 19 F

  1. Verwenden Sie eine externe Referenz die eine bekannte Menge von 19 F-Signal für die Quantifizierung 12. Wählen Sie die Signalintensität des Referenz etwa vergleichbar mit vom Gegenstand erwartet.

Hinweis: Im allgemeinen ist es am einfachsten, wenn die Referenz-Verbindung die gleiche wie die Zelle Etikett, um die Entspannung Parametern entsprechen ist. Wenn spektroskopische Sequenzen oder Sequenzen ohne räumliche Lokalisierung verwendet werden, dann acompound mit einer unterschiedlichen chemischen Verschiebung erforderlich sein.

  1. Ändern der Anordnung, Größe und Form des Referenz wie nötig, abhängig von der Region von Interesse (ROI). Anmerkung: Es ist im allgemeinen am einfachsten, Rohre mit einem gleichförmigen Querschnitt für die Referenz.

5. Imaging-und Maus-Vorbereitung

  1. Verdünnen kommerziell verfügbaren Ketamin und Xylazin 1.10 v / v mit physiologischer Kochsalzlösung auf Stammlösungen von 10 mg / ml Ketamin und 2 mg / ml Xylazin ergeben.
  2. Schalten Sie die Heizung im Scanner (typischerweise warme Luft), um sicherzustellen, die Bohrung wird warm sein, bevor die Maus abgebildet.
  3. Inject 100 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin intraperitoneale Anästhesie zu initiieren. Hinweis: Diese Dosen sind für CD1 (ICR) und NU-Foxn1 nu 8 Wochen alten männlichen Mäusen getestet. Andere Stämme können leicht verschiedene Dosen benötigen, die in einem separaten Experiment optimiert werden sollten. Diese Dosis wird die Maus zu halten für eine narkotisiertKampf 45 min. Hinweis: Die Tiefe der Anästhesie ist normalerweise ausreichend, wenn das Tier zeigt keine Reaktion an einem Fuß Klemme.
  4. Sobald betäubt, platzieren Sie das Tier in einem Tierschale und immobilisieren Bewegung während MRI verhindern. Wenn erforderlich, stellen Sie den externen Referenz neben dem Tier. Sowohl die Referenz-und die ROI (erwarteten Position der injizierten Zellen) ist in der Mitte der Spule sein. Das Tier sollte auf die Temperatur-und Atemkontrolle für physiologische Überwachung während der Abtastung angeschlossen werden.
  5. Decken Sie die Augen der Maus mit sterilen Augensalbe Austrocknen während der langen Imaging-Sitzungen zu verhindern.
  6. Wenn die Aufnahmezeit 40 Minuten übersteigt, bereiten zusätzliche Katheter zur Injektion von zusätzlichen Ketamin / Xylazin, bevor das Tier wecken. Position zwei getrennte subkutane Katheter mit den Arbeitslösungen von Ketamin und Xylazin. Verwenden Sie diese Katheter an die Maus geben einen zusätzlichen 2,5 mg Ketamin alle 20 Minuten nach der ersten 40 min. Falls erforderlich, weiter zu verlängern Anästhesie durch Injektion von weiteren 0,5 mg Xylazin durch den Katheter 100 Minuten nach der ersten Injektion. In allen Fällen sollten die Versuchszeit von 3 Stunden, außer vielleicht unter Terminal Narkose nicht überschreiten.
  7. Sicherzustellen, dass die Maus direkt nach der ersten Injektion und erwärmt auf 37 ° C Körpertemperatur gehalten. Mit diesem Protokoll <80% Blutoxygenierung wurde unter Atemluft Atmosphäre nachgewiesen. Um Nebenwirkungen von der abgesenkten Blutsauerstoffzufuhr zu verhindern, verwenden Sie 100% Sauerstoff (0,3 l / min). Körpertemperatur und Atmung sollte während des gesamten Experiments und bis zur vollständigen Genesung des Tieres gesteuert werden. Beachten Sie, dass die spontane Atemfrequenz unter Ketamin / Xylazin ist sehr hoch (200-250/min). Unregelmäßigkeiten in der Atmung, anstatt die Atemfrequenz, können anzeigen, dass eine höhere Dosis notwendig, einen geeigneten Zustand der Anästhesie aufrechtzuerhalten. Die Maus wird spontan innerhalb von 20-30 min afte weckenr die letzte Dosis des Narkosemittels.

Anmerkung: Für Zellverfolgung, ist es notwendig, das Bild desselben Tieres mehr als einmal. In diesem Fall sollten die Imaging-Sitzungen unter Berücksichtigung der für die Freigabe der Narkose von den System-und Tier Richtlinien des Instituts Nutzung erforderliche Zeit eingeplant werden.

6. Imaging

1 H-und Imaging-Anpassungen

  1. Positionieren Sie das Tier im Inneren des Scanners, so dass der ROI ist im Isozentrum mit einer niedrigen Auflösung, anatomische Scan mit unterschiedlichen Schichtorientierungen (a Localizer).
  2. Benutzen Sie die normalen Shim-Protokoll auf ein H, zB einer globalen Shim auf das gesamte Volumen im Inneren der Spule.
  3. Stellen Sie die Referenzimpulsverstärkung (RG), dh die Sendeleistung gemessen in dB für eine 1 ms Hermite 90 °-HF-Puls, mit der Einstellung Scan vom Anbieter zur Verfügung gestellt.

Hinweis: Diese Einstellung wirdvariieren mit der Art der RF-Spule und ist für 19 F-MRI, da das Signal auf der Frequenz F 19 ist in der Regel zu gering für eine direkte Anpassung. Als Folge muss eine Schätzung der RG von Messungen an der 1 H-Signal erfolgen. Für HF-Übertragung mit einer Oberflächenspule sollte die 1 H RG zu einer Ebene parallel zu der Spule durch das Teil von Interesse angepasst werden, eine Volumenspule mit homogenen B 1 Profil sind die genauen Einstellungen des Stell weniger wichtig.

  1. Das folgende Protokoll 19F Referenzimpulsverstärkungseinstellung funktioniert nur, wenn sowohl 1 H-und 19 F-HF-Übertragung ist mit der gleichen (einzeln oder doppelt abgestimmten) HF-Spule ausgeführt. Für eine solche bildgebenden Einrichtung sollten die Spule Profil (B 1 Sendefeld) auf 1 H proportional zu der Spule 19 F-Profil, wenn eine feste RG angewendet wird, dh B 1,1 H = C * B 1,19 F mit Stützeortionality Konstante C.
    1. Um zu bestätigen, dass die Spule proportional Profile sind für einen bestimmten Aufbau, erwerben ein 1 H-und 19 F-Flip-Winkel Karte (siehe folgenden Abschnitt auf der B 1-Korrektur) auf ein Rohr mit hochkonzentrierten 19 F, zB TFA in Wasser (1:1 v / v) unter Verwendung identischer Felder des Sicht (FOVs), vorher (Fig. 3).
    2. Mit der gleichen RG, überprüfen Sie, dass beide Karten sind identisch, außer für den globalen Faktor C
    3. Sobald der 1 H-RG bestimmt ist, beachten Sie diese Nummer.
  2. Führen Sie eine herkömmliche 1 H-MRT-Untersuchung als anatomische Referenz für die 19 F-Bildgebung. Tune des Systems auf die 19 F-Frequenz des Zellmarker und führen ein 19 F MR scannen. Idealerweise ist die 19 F-MRT-Scan wird das gleiche Feld-of-view und Scheibe Auswahl als 1 H-MRI, obwohl in der Regel mit geringerer Auflösung. Das Tier kann, sobald die Phantasie belebt werdenng ist abgeschlossen. Bildverarbeitung kann dann offline durchgeführt werden.
  3. Bestimmen Sie die 19 F RG über die Beziehung 19F dB = -20 dB 1H * log 10 (C). Schätzen Sie die 19 F-Agent in einer separaten Frequenz in-vitro-Experiment.

Hinweis: In vivo kann die genaue Frequenz leicht von Experiment zu variieren, um zu experimentieren aufgrund unterschiedlicher Bedingungen Shim. Die chemische Verschiebung der Artefakte exakte Frequenz ist daher in jedem Experiment durch 19 F MRS bestimmt werden, wenn möglich zu verhindern. Eine typische Scan für sehr niedrige 19 F-Signal würden die globalen (Puls-acquire)-Spektroskopie (TR = 200 ms, NEX = 3000, TA = 10 min, BW = 50 kHz) sein. NEX, so TA, kann dramatisch hohen und 19 F-Signal reduziert werden. Das 19 F Mittel Frequenz aus dem Spektrum nach der Fourier-Transformation und Phasenkorrektur bestimmt. NEX bezieht sich auf die Zahl der Anregungen, ist die Akquisitionszeit TA und BW dieBandbreite.

Hinweis: Typische Abbildungsparameter 9 auf einer 11.7T/16 cm engagierten Tierscanner sind: Eine anatomische 1 H-Bildgebung Scan mit einem Turbo-Spin-Echo (TSE)-Sequenz mit TR / effektive Echozeit (TE eff) = 2.200 msec/42.8 ms 8 Echos pro Anregung, NEX = 2, 10 aufeinanderfolgende, 1 mm dicke Scheiben schneiden, FOV = 1,92 x 1,92 cm 2, 128 x 128-Matrix, also eine Auflösung von 150 x 150 x 1000 um 3, TA = 1 min, BW = 50 kHz und eine lineare Phasenkodierungsschema. F 19 Bilder wurden mit der gleichen Reihenfolge und passenden Geometrie erworben, aber bei niedrigeren Auflösung in der Ebene und unteren BW (NEX = 256, 48 x 48-Matrix, also eine Auflösung von 400 x 400 x 1000 um 3, TA = 57 min, BW = 10 kHz).

  1. B 1 Korrektur
    Mit einer HF-Spule mit inhomogenen B 1 Profil, zB eine Oberflächenspule kann Quantifizierung von 19 F-Daten behindern, da das Signal hängtnicht nur auf 19 F-Konzentration, sondern auch von dem Abstand von der Spule. Erwerben Sie eine B 1 Karte auf den 1 H-Kanal, um rückwirkend korrigieren 19 F-Daten. Dies erfordert, dass 1 H-und 19 F-Spule Profile sind identisch, mit Ausnahme der Proportionalitätsfaktor C sowie eine ausreichende 1H Hintergrundsignal in Regionen 19 vorgesehen F. Ein Beispiel Protokoll zur Korrektur eines 19 F-Spin-Echo-Sequenz präsentiert wird, mit einem einfach abgestimmten Tx / Rx-Oberflächenspule abstimmbaren sowohl 1 H und 19 F und B 1 proportional Profile 13.
    1. Erwerben Sie eine 1 H-Flip-Winkel Karte mit den beiden Flip-Winkel 14 Verfahren. Erwerben Sie eine Gradienten-Echo-Scan mit sehr langen TR (> 3 mal 1 HT 1) mit einem geschätzten Flip-Winkel von knapp 90 °. Schließen Sie an die Spule. Erwerben Sie eine zweite Gradienten-Echo-Scan mit einem RG = -6 dB 1H, dh zweimal die KehrWinkel der ersten Abtastung.
    2. Das 1 H-Flip-Winkel zu berechnen, α, bei Voxel (x, y, z) über die Signalintensität (SI) der ersten und zweiten Gradientenecho Scans: α (x, y, z) = arcos (SI GE, 1 ( x, y, z) / 2SI GE, 2 (x, y, z)) 14. Das 19 F Flipwinkel identisch (mit Ausnahme des Faktors 1 / C) durch proportionale B 1 Profile. Nach dem Faradayschen Prinzip der Gegenseitigkeit 15, die Dämpfung von 19 F-Signalintensität von einer Spin-Echo-Sequenz (Anregungsflipwinkel α, Refokussierungsflipwinkel 2α) während der Signalempfang att Rx (x, y, z) ~ α (x, y , z). Die Dämpfung aufgrund der unvollständigen Anregung att Tx (x, y, z) ~ 3 sin (α (x, y, z)) 16. Die Gesamtdämpfung als att = attRx attTx * = α * sin 3 (α) / 90 ° geschrieben. Beachten Sie, dass es auf 1 normiert ist bei perfekte 90 ° / 180 °-Anregung / Refokussierungsflipwinkel. Die B-1 behoben19 F Bildsignalintensitäten SI 19F, korr über SI 19F, corr (x, y, z) = SI 19F (x, y, z) / att (x, y, z) berechnet wird.
    3. Um die Signalintensitäten von verschiedenen Experimenten vergleichen, legen Sie einen Verweis Rohr mit definierten 19 F-Konzentration im Blickfeld, und normalisieren die SI-19F, korr zur mittleren Signal in der Referenz.

Hinweis: Andere HB 1 1 / Flip-Winkel Mapping-Methoden verwendet werden können und verschiedene F 19 Pulssequenzen erfordern Änderungen att Tx, 19F. Jede Art von B1 Korrekturverfahren werden zusätzliche Fehler in der Zelle Quantifizierung Verfahren einzuführen. Wenn genaue Quantifizierung Zelle ist der Haupt Prämisse, kann eine HF-Spule mit homogenem B1-Profil verwendet, um diesen Teil des Protokolls zu umgehen.

7. Bildverarbeitung

  1. Erstellen Sie ein H-und 19 F Overlay-Bilder
    1. Exportieren Sie die Bilddatenfür die letzte 1 H-und 19 F-Grße Bilder vom Scanner.
    2. Öffnen Sie die Dateien in einem Bildbearbeitungsprogramm wie ImageJ (Freeware, NIH).
    3. Führen Sie die Bildeinstellungen wie nötig (Beschneiden, Helligkeit, Kontrast) Halten Sie die Einstellungen für alle Bilder. Die 19 F-Bilder werden in der Regel brauchen, um auf eine höhere Auflösung, um die entsprechenden 1 H-Bilder entsprechen hochskaliert werden.
    4. Render die F 19 Bilder in Falschfarben (wählen Sie einen anderen Look-up-Tabelle, unter dem Menü "Bild" im Bild J) und dann überlagern, auf die entsprechenden Bilder in 1 H, um das Signal zu lokalisieren.
  2. 19 F Quantifizierung
    1. Wählen Sie ein 19 F-Bild (Bild Größe) mit den relevanten Zellen und dem Referenz sichtbar.
    2. In einem Programm wie Bild J, ziehen ROIs über die relevanten Zellen, Referenz-und einem Bereich außerhalb des Subjekts (Lärm).
    3. Verwenden Sie den Befehl Analysierenund dann messen (oder einfach Strg + M), die mittlere Pixelintensität in diesen Regionen zu berechnen und ihre Umgebung. Sei S (Zellen) beziehen sich auf die Durchschnittspixelintensität des ROI über die Zellen. Multiplizieren Sie das mit dem Volumen (= Fläche x Schichtdicke), um die Gesamtsignal berechnen.
    4. Berechnung des SNR, beispielsweise mit Hilfe der Formel SNR = 0.65 x S (Zellen) / σ, σ ist, wo die Standardabweichung der Pixelintensität in einem ROI außerhalb der Probe, die frei von chemischen Verschiebungsartefakt (typischerweise im Hintergrund Luft) 17. Wenn das SNR unter 5, kann eine Korrektur für das Signal aufgrund des Rauschens erforderlich sein und kann, wie an anderer Stelle 11 10 beschrieben durchgeführt werden.
    5. Ansonsten Berechnung der Gesamtmenge von 19 F durch Multiplizieren der Fläche der Referenz in der schichtDicke (um das Volumen zu berechnen) durch die Konzentration der 19 F in der Referenz für das Signal in der ROI über die Referenz verantwortlichdie bekannt ist und homogen angenommen.
    6. Multiplizieren diesen Wert durch die Gesamtsignal in der ROI über die Zellen, auf die Bezug auf die Menge an 19 F in den Zellen zu berechnen, dividiert durch das Gesamtsignal.
    7. Berechnen Sie die Anzahl der Zellen durch Teilung diese Zahl mit dem Wert für 19 F / Zelle, die in Abschnitt 2 berechnet.

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Ergebnisse

Hier zeigen wir die Ergebnisse für ein typisches Protokoll die die Übertragung des 19 F-markierten Zellen zu einer Homing-Lymphknoten. Fig. 2 zeigt ein 19 F-NMR-Spektrum von 10 6 Zellen markiert mit einem TFA Referenz. Der Bilddarstellungsaufbau wurde wie in dem Protokoll (Fig. 3) beschrieben durchgeführt. Für die in vivo-Bildgebung verwendeten wir einen Referenz bestehend aus einem abgedichteten Zylinder des gleichen Etiketts für die Zellen zwi...

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Diskussion

Die hier vorgestellte Protokoll beschreibt die allgemeine Vorgehensweise für die in-vivo-19 F-MRT Zellverfolgung. Trotz der beschriebenen Co-Inkubation Verfahren gibt es mehrere verschiedene Protokolle für die Markierung von Zellen mit einem 19 F enthält. Jedoch ist die Co-Inkubation häufig verwendet und kann durch Zugabe von Transfektionsmittel 6 optimiert werden zB. Die tatsächliche Zellmarkierungsprotokoll wird vom Zelltyp abhängig. Nur Tastenbeschriftung Schritte we...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Danksagungen

Wir möchten Nadine Henn und Arend Heerschap für ihre wertvolle Unterstützung bestätigen. Diese Arbeit wurde von der niederländischen Institut für Regenerative Medizin (NIRM, FES0908), der EU-FP7-Programm ENCITE (HEALTH-F5-2008-201842) und TargetBraIn (HEALTH-F2-2012 bis 279017), einen Zuschuss von der Volkswagen-Stiftung (unterstützt I/83 443), der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (VENI 700.10.409 und 917.76.363 Vidi), ERC (Advanced Grant 269019) und der Radboud Universität Nijmegen Medical Centre (AGIKO 2008-2-4).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
REAGENTS
PBSSigma-AldrichMFCD00131855
TFASigma-Aldrich76-05-1
Ketamin (Ketavet)Pfizer778-551
Xylazin (Rompun)BayerQN05 cm92
Ophtosan Produlab Pharma2702Augensalbe
Materialname
MRT-ScannerBruker Biospec
NMR-SpektrometerBruker Biospec

Referenzen

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Schlagwörter

19F MRTFluor MarkierungNMR SpektroskopieBildverarbeitungProtonen MRTB1 MappingFlip Winkel KorrekturZellquantifizierungdendritische Zellen

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