Dezellularisierung und Rezellularisierung der Lunge nichtmenschlicher Primaten mit einem spezialisierten Großorgan-Bioreaktor

Summary

Die Dezellularisierung ganzer Organe erzeugt natürliche biologische Gerüste, die für die regenerative Medizin verwendet werden können. Die Beschreibung eines nichtmenschlichen Primatenmodells der Lungenregeneration wird vorgestellt, in dem ganze Lungen dezellularisiert und dann mit adulten Stammzellen und Endothelzellen in einem Bioreaktor besiedelt werden, der die Gefäßzirkulation und die Beatmung von Flüssigmedien erleichtert.

Abstract

Es steht eine unzureichende Anzahl von Lungen zur Verfügung, um den aktuellen und zukünftigen Bedarf an Organtransplantationen zu decken. Die bioartifizielle Geweberegeneration ist eine attraktive Alternative zur klassischen Organtransplantation. Bei dieser Technologie wird die natürliche biologische extrazelluläre Matrix (ECM) eines Organs als Gerüst genutzt, auf das autologe Zellen oder Stamm-/Vorläuferzellen ausgesät und kultiviert werden können, so dass die Regeneration des ursprünglichen Gewebes erleichtert wird. Die natürliche EZM wird durch einen Prozess namens Dezellularisierung isoliert. Die Dezellularisierung wird durch die Behandlung von Geweben mit einer Reihe von Detergenzien, Salzen und Enzymen erreicht, um eine effektive Entfernung von Zellmaterial zu erreichen, während die EZM intakt bleibt. Studien, die unter Verwendung der Dezellularisierung und anschließenden Rezellularisierung von Nagetierlungen durchgeführt wurden, zeigten einen marginalen Erfolg bei der Erzeugung von lungenähnlichem Gewebe, das in vivo zum Gasaustausch fähig ist. Nagetiermodelle bieten zwar einen wesentlichen Proof-of-Concept, sind aber nicht direkt auf den menschlichen Gebrauch übertragbar. Nichtmenschliche Primaten (NHP) bieten ein geeigneteres Modell, um den Einsatz biokünstlicher Organproduktion für einen späteren klinischen Einsatz zu untersuchen.

Die Protokolle zur vollständigen Dezellularisierung der Lunge, die vom NHP-Rhesusaffen gewonnen wurde, werden vorgestellt. Die resultierende azelluläre Lunge kann mit einer Vielzahl von Zellen besiedelt werden, darunter mesenchymale Stammzellen und Endothelzellen. Das Manuskript beschreibt auch die Entwicklung eines Bioreaktorsystems, in dem zellgesäte Makakenlungen unter Bedingungen mechanischer Dehnung und Belastung durch Unterdruckbeatmung sowie pulsierende Perfusion durch das Gefäßsystem kultiviert werden können; Es ist bekannt, dass diese Kräfte die Differenzierung entlang der Lungen- bzw. Endothellinien steuern. Repräsentative Ergebnisse der Dezellularisierung und des Cell Seeding werden zur Verfügung gestellt.

Introduction

Bioengineering von Geweben und Organen ist eine attraktive Ergänzung zum Bereich der regenerativen Medizin. Die Schaffung von "im Labor gezüchteten" Organen, die für die Transplantation in Patienten geeignet sind, um die Funktionalität erkrankter Organe zu ersetzen, ist sehr wünschenswert, um den aktuellen und zukünftigen Bedarf an Transplantationen zu decken. Die Prinzipien des Tissue Engineering konzentrieren sich auf die Aussaat gewünschter Zelltypen oder Vorläufer davon in ein Gerüst, das die Form des manipulierten Gewebes unterstützt und gleichzeitig die geeigneten Wachstumsfaktoren und Kulturbedingungen liefert, die zur Nachahmung von Entwicklungs- oder Regenera....

Protocol

1. Dezellularisierung der Lunge von Ganzorganmakaken

1. Vorbereitung von Lösungen
   1. Autoklavieren Sie 10-15 L deionisiertes Wasser (dH₂O) in 1-2 L Flaschen.
   2. "Triton-Lösung" (0,1 % Triton X-100 in dH₂O) wird durch Mischen von 1 ml Triton X-100 in 999 ml dH₂O unter Rühren unter Magnetrührer hergestellt. Die Lösung wird durch eine 0,22 μm Filtervorrichtung filtriert. Bei Raumtemperatur lagern.
   3. Bereiten Sie die "SDC-Lösung" (2% SDC in dH₂O) vor, indem Sie langsam 20 g Natriumdesoxycholat (SDC) zu ~900 ml dH₂O unter Rühren hinzufügen. Sobald SDC aufgelöst ist, überführe....

Results

Die unten gezeigten Ergebnisse stellen separate Experimente dar, in denen entweder Atemwegs- oder Gefäßkompartimente mit mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark von Rhesusaffen bzw. von mikrovaskulären Endothelzellen aus der Rhesuslunge besiedelt wurden, die isoliert und charakterisiert wurden, wie zuvor beschrieben^16-18.

Während des gesamten Dezellularisierungsprozesses zeigten Makakenlungen eine fortschreitende Aufhellung, die am Ende des Prozesses in einem durchscheinenden .......

Discussion

Gewebe können effizient und effektiv durch eine Reihe von Verfahren dezellularisiert werden, bei denen physikalische, chemische und enzymatische Wirkstoffe zum Einsatz kommen^12,20. Zu den Herausforderungen bei der Herstellung biologischer 3D-Matrizen aus großen Organen gehören der Bedarf an großen Mengen an Dezellularisierungslösungen, teure kommerzielle Geräte (z. B. Bioreaktoren) und eine schwindelerregende Menge an methodischen Störungen, die erforderlich sind, um das aus dem Gewebe gewonnene Endpr.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Natriumnitroprussid	Sigma-Aldrich	71778-25G
Heparin-Natriumsalz	Fisher	BP2425
Triton X-100	Fisher	BP151-100
Natriumdesoxycholat	Fisher	BP349-100
Natriumchlorid	Fisher	7647-14-5
Pankreas-DNase	Sigma-Aldrich	DN25	Brühe vorbereiten, aliquotieren und einfrieren
Magnesiumsulfat	Fisher	10034-99-8
Calciumchlorid	Fisher	C614-500
PBS (kein Ca/Mg)	Gibco, Life Technologies	10010-031
Antibiotisch-Antimykotisch	Gibco Life Technologies	15240062
Zellkulturmedien
Alpha MEM	Gibco Life Technologies	12561-072
Medium 199	Gibco Life Technologies	11150067
Premium Fötales Rinderserum	Atlanta Biologicals	S11150
L-Glutamin 100x	Gibco Life Technologies	25030-081
Nahrungsergänzungsmittel für das Wachstum von Endothelzellen (EKGS)	ScienCell	1052
Antibiotikum-Antimykotikum	Gibco Life Technologies	15240062
Zellaussaat und Bioreaktorkultur
Rückschlagventile	Cole-Parmer	EW-98553-20
Y-Anschlüsse	Cole-Parmer	ED-30614-08
3-Wege-Absperrhähne	Harvard Apparate	721664
MasterFlex L/S 14 Schlauch	Cole-Parmer	96420-14
MasterFlex L/S 16 Schlauch	Cole-Parmer	96420-16
Luer 1/8 Zoll	Cole-Parmer	EW-45505-04
Luer-Buchse 1/8 Zoll	Cole-Parmer	SI-45502-04
Luer-Stecker	Cole-Parmer	EW-45505-56
Injektionsanschlüsse	Medi-Dose EPS	IV2004
Latexschlauch	St. Louis Medical Suppy	HN10910
Schlauchschelle	Cole-Parmer	EW-06832-02
2 L Weithalsglas	Fisher	05-719-276
60 ml	Spritzen Fisher	NC9035364