Stressinduzierte Antibiotika-Anfälligkeitstests auf einem Chip

Zusammenfassung

Wir haben eine mikrofluidische Plattform für schnelle Antibiotika-Empfindlichkeitstests entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien können diese belastenden Bedingungen jedoch überleben.

Zusammenfassung

Wir haben eine schnelle mikrofluidische Methode für Antibiotika-Empfindlichkeitstests in einer stressbasierten Umgebung entwickelt. Flüssigkeit wird mit hohen Geschwindigkeiten über Bakterien geleitet, die auf dem Boden eines mikrofluidischen Kanals immobilisiert werden. In Gegenwart von Stress und Antibiotika sterben anfällige Bakterienstämme schnell ab. Resistente Bakterien überleben diese belastenden Bedingungen jedoch. Die Hypothese hinter dieser Methode ist neu: Die Stressaktivierung biochemischer Wege, die Ziele von Antibiotika sind, kann Antibiotika-Empfindlichkeitstests beschleunigen. Im Vergleich zu Standard-Antibiotika-Empfindlichkeitstestmethoden wird der ratenbegrenzende Schritt - das Bakterienwachstum - bei der Anwendung von Antibiotika weggelassen. Die technische Umsetzung der Methode erfolgt in einer Kombination aus Standardtechniken und innovativen Ansätzen. Zu den Standardbestandteilen der Methode gehören bakterielle Kulturprotokolle, die Definition mikrofluidischer Kanäle in Polydimethylsiloxan (PDMS), die Überwachung der Zelllebensfähigkeit mit Fluoreszenz und die Batch-Bildverarbeitung für die Bakterienzählung. Innovative Teile der Methode sind in der Verwendung von Kulturmedienfluss für die mechanische Belastung Anwendung, Verwendung von Enzymen zu beschädigen, aber nicht töten die Bakterien, und die Verwendung von Mikroarray Substrate für die bakterielle Befestigung. Die entwickelte Plattform kann in der Entwicklung und Erprobung von antibiotika- und nichtantibiotikant verwandten Arzneimitteln eingesetzt werden. Im Vergleich zu den Standard-Bakteriensuspensionsexperimenten kann die Wirkung des Medikaments über kontrollierte Zeiträume wiederholt ein- und ausgeschaltet werden. Eine wiederholte Beobachtung der gleichen Bakterienpopulation ist im Laufe desselben Experiments möglich.

Einleitung

Der Anstieg der bakteriellen Resistenz verstärkt die Notwendigkeit für schnelle Phänotyp-basierte Antibiotika-Anfälligkeitstests, um unsere Medikamente der letzten Instanz zu schützen. Standard-Empfindlichkeitstests basieren auf bakteriellen Wachstumshemmungen in Gegenwart von Antibiotika, die mehrere (8-24) Stunden dauern. Wir haben einen neuartigen Antibiotika-Anfälligkeitstest auf einer mikrofluidischen Plattform entwickelt, der auf der Stressaktivierung biosynthetischer Wege beruht, um die Wirkung von Antibiotika zu beschleunigen.

Antibiotika-Empfindlichkeitstests im mikrofluidischen Maßstab tragen den Vorteil einer effektiven Probenver....

Protokoll

1. Erstellen der PDMS-Schicht (Abbildung 1)

1. PDMS und Härtungsmittel im Verhältnis 10:1 kräftig mischen. Um Blasen zu entfernen, entgasen Sie das viskose Gemisch in einer Vakuumkammer für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
2. Auf einer Skala, gießen Sie das PDMS langsam über die Aluminiumform. Gießen Sie aus der Mitte und halten Sie die Form nivelliert. Achten Sie darauf, die Stifte unbedeckt zu lassen. Hören Sie auf zu gießen, sobald das Zielgewicht erreicht ist.
   Unsere Form benötigt 4 g PDMS und 0,4 g Aushärtungsreagenz.
3. Die Form in einem Ofen nivellieren und bei 37 °C über Nacht aushärten.
   Alternative Aushärtungszeiten sind 2....

Ergebnisse

Die in Abbildung 4 dargestellten Daten zeigen die Reaktion eines anfälligen Staphylococcus aureus-Stamms im Laufe der Zeit in einem antibiotikahaltigen mikrofluidischen Kanal. Phasenkontrastbilder, die in 1 min und am Ende des 1-Stunden-Experiments aufgenommen wurden, sind in den Abbildungen 4A und Bdargestellt. Die analysierten 1-Stunden-Daten sind in Abbildung 4C mit den rot hervorgehobenen Bakterien (5.828 insgesamt) dargestellt. En.......

Diskussion

Das vorgestellte Protokoll wurde in einer Reihe von Experimenten mit methicillin-sensitiven und methicillin-resistenten Staphylococcus aureus Stämmen¹⁰validiert und optimiert. Daher sollte dieses Protokoll ohne Änderung direkt auf andere Stämme von S. aureus und anderen Antibiotika mit Wirkmechanismen anwendbar sein, die die bakterielle Zellwandbiosynthese beeinflussen. Andere Bakterientypen als S. aureus können eine Variation der Spannungsparameter erfordern: lösliche (enzymatische).......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
SYTOX Green	Invitrogen Corporation	S7020	Fluoreszenzfärbung toter Zellen
Rinderserumalbumin (BSA)	Sigma Aldrich, Inc	A9418-5G	Wird für die Lagerung von Lysostaphin
Natriumacetat	Sigma Aldrich, Inc	S8750-500G	Wird für die Lagerung von Lysostaphin
verwendet Lysostaphin	Cell Sciences	CRL309A	Kommt als 1 mg Feststoff. Zur Lagerung: In 20 mM Natriumacetat auflösen. Mischen Sie mit BSA-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 1 % BSA und 100 &; Mikro; g/ml   Lysostaphin zur Lagerung
Oxacillinsalz	Sigma Aldrich, Inc	28221-1G	Antibiotikum
Mueller Hinton Bouillon	Fisher Scientific	DF0757-17-6
Natriumchlorid	Sigma Aldrixh	S3014-500G	2% der Mueller-Hilton-Brühe vor dem Autoklavieren zugesetzt
1 ml, Luer-Lock-Spritze	BD (Beckton, Dickinson und Comp.)	14-823-2F
2 oz, Luer-Lock-Spritze	BD (Beckton, Dickinson und Comp.)	309653 - 60 mL	Überfüllung auf ~65 ml
Mikroskop
Inverses Fluoreszenzmikroskop Olympus IX-70	Cambridge Scientific	9349
60X, Fluoreszenz-/Phasenkontrastobjektiv	Olympus Corp.	LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12-Bit Monochrom CCD-Kamera	QImaging	RET-4000R-F-M-12-C
Mikroskopautomatisierung
Verschlüsse Phasenkontrast/Fluoreszenz	PRIOR Scientific	H204/H202
X/Y Tisch	PRIOR Scientific	H107AENN
Fokusmotor	PRIOR Scientific	H122
Joystick für XYZ-Steuerung	PRIOR Scientific	CS152EF
Proscan Controller	PRIOR Scientific	H3-XY2
Bilderfassungssoftware	Fraunhofer CMI
Durchflusszellenmontage und PDMS
Flow Cell	BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI	3333-1044	Technische Zeichnungen wurden von Fraunhofer CMI
erstellt Glasfenster	Fraunhofer CMI	3333-1054	Glasfenster wurde am Fraunhofer CMI auf die richtige Größe zugeschnitten
BOROFLOAT Fenster 50 mm x 50 mm	Edmund Optics Inc.	NT48-543
Dichtungsplatte	BU Scientific Instruments Facility	3333-1045
Objektträger aus Epoxidglas	Arrayit Corporation	SuperEpoxy 2
PDMS-Master	Fraunhofer CMI	3333-1053	Master bearbeitet in Aluminium oder Messing mit UPM-0005 (Ultrapräzisions-Fly-Schneidemaschine)
PDMS-Objektträger-Design	Fraunhofer CMI	3333-1053
Rohrmutter
, Super flanschlos Tinytight, kopflos, 1/16 Zoll, PEEK, grün	IDEX Health Science	M-644-03	Ein-/Ausgänge der Durchflusszelle sind für diese Aderendhülse abgegriffen
, Tinytight, 1/16 Zoll, 6-40, .030 Zoll TH, PEEK mit SS-Sicherungsring, schwarz	IDEX Health Science	M-657
Mutter, Super flanschlos Tinytight, kopflos, 1/16-1/32 Zoll, 1/4-28, PEEK, natürlich	IDEX Health Science	P-255
Ferrule, Super Falngeless, 1/16 Zoll, Tefzel (ETFE), gelb	IDEX Health Science	P-259	Passend für Luer-Lock-Adapterschläuche
, Teflon FEP, .030 Zoll x 1/16 Zoll x 20 ft, grün	IDEX Health Science	1520G
Adapter, Schnellkupplung Luer-Buchse auf Buchse 1/4-28, PEEK, rot	IDEX Gesundheitswissenschaft	P-658

verwendet