Die kovalente Bindung von BMP-2 auf Oberflächen mit einem selbstorganisierten Monoschicht-Ansatz

Summary

Wir beschreiben ein Verfahren zum Erreichen effizienten Immobilisierung von BMP-2 auf die Oberflächen. Unser Ansatz beruht auf der Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht, um die kovalente Bindung des BMP-2 mit seinem freien Aminresten zu erreichen basiert. Dieses Verfahren ist ein nützliches Werkzeug, um Signalisierung auf der Zellmembran zu studieren.

Abstract

Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Wachstumsfaktor in der extrazellulären Matrix von Knochengewebe eingebettet ist. BMP-2 fungiert als Auslöser von mesenchymalen Zelldifferenzierung zu Osteoblasten und stimulieren damit Heilung und de novo Knochenbildung. Der klinische Einsatz von rekombinanten humanen BMP-2 (rhBMP-2) in Verbindung mit den letzten Gerüsten hat Kontroversen angehoben, bezogen auf die Darstellungsweise und die Menge geliefert werden. Die hier vorgestellten Protokoll bietet eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2 in vitro-Untersuchungen an Zellen zu liefern. Wir beschreiben, wie eine selbstorganisierte Monoschicht, die aus einem heterobifunktionellen Linkers zu bilden, und zeigen die nachfolgende Bindungsschritt, um eine kovalente Immobilisierung von rhBMP-2 zu erhalten. Mit diesem Ansatz ist es möglich, eine anhaltende Präsentation von BMP-2 bei gleichzeitiger Beibehaltung der biologischen Aktivität des Proteins. In der Tat wird die Oberfläche Immobilisierung von BMP-2 können gezielte Untersuchungen durch Verhinderung unspezifischer AnzeigenDesorption, während die Verringerung der Menge an Wachstumsfaktor und, vor allem, behindern unkontrollierten Freisetzung von der Oberfläche. Beide kurz-und langfristigen Signalereignisse von BMP-2 ausgelöst stattfinden, wenn die Zellen auf Oberflächen präsentiert kovalent immobilisierten rhBMP-2 ausgesetzt, so dass dieser Ansatz geeignet für in-vitro-Studien an Zell-Antworten auf BMP-2 Stimulation.

Introduction

Morphogenetisches Knochenprotein 2 (BMP-2) ist ein Mitglied der transformierenden Wachstumsfaktor (TGF-β)-Familie und als Induktor der de novo Knochenbildung sowie Regulator mehreren Geweben während der embryonalen Entwicklung und Homöostase Erwachsenen ^1-3. Jedes Monomer des biologisch aktiven homodimeren BMP-2-Protein enthält eine "Cystein-Knoten"-Motiv, das in allen hoch BMPs ⁴ konserviert ist. Sechs der sieben Cysteinreste eine intramolekulare Disulfidbindungen bilden, die jedes Monomer zu stabilisieren, während der siebte Cystein an der Dimerisierung beteiligt sind, die einen intermolekularen Bindung zwischen den beiden Monomeren ^5,6. Diese hochkonservierten Cystein-Knoten definiert, die die dreidimensionale Struktur des BMP-2-Protein bestimmt und seine einzigartigen Eigenschaften, wie Beständigkeit gegen Hitze, Denaturierungsmittel und sauren pH ^7-9. BMP-2-Bindung an Serin / Threonin-Kinase-Transmembran-Rezeptoren, wodurch die Signaltransduktion zu induzieren ^{12.10. Abhängig von der Art der Rezeptoroligomerisation werden unterschiedliche Signalwege aktiviert: ein Smad-unabhängige Signalkaskade führt zu der alkalischen Phosphatase-Induktions über p38-Signalisierung, während ein Smad-abhängigen Weg durch Rezeptor-Phosphorylierung führt Smad-Komplex nukleäre Translokation und Aktivierung der Transkription von Aktiv spezifischer Zielgene, wie z. B. der Inhibitor der Differenzierung (Id) 12-14.}

In Knochen, BMP-2 induziert die Differenzierung von mesenchymalen Stammzellen zu Osteoblasten, wodurch die Stimulierung der Heilung und de novo-Knochenbildung. Derzeit rekombinant exprimierten BMP-2 ist klinisch angewendet, um die Heilung von gebrochenen Seiten zu verbessern. Eine übliche Strategie im Knochengewebe ist der Einsatz von injizierbaren Wachstumsfaktoren, die zum lokalen Abgabesystemen weniger invasiv ist. In vivo-Studien und klinische Anwendungen haben gezeigt, dass die kurze biologische Halbwertszeit, unspezifische locsierung und schnelle lokale Clearance von BMP-2 kann sich auf mehrere lokale und systemische Probleme Eileiter ¹⁵ führen. Daher ist notwendig für die örtliche verzögerte Abgabe an der Zielstelle, um eine effektive Präsentation, das Einschließen oder Immobilisierung von BMP-2 in oder an Materialien zu erhalten. Anhaltende Abgabe kann mit nicht-kovalente Retentions Ansätze wie physikalischen Einschluß, Adsorption oder Ionenkomplex ¹⁶ erreicht werden. Es ist jedoch bekannt, dass unspezifische Adsorption von Proteinen an Oberflächen können die Ergebnisse in eine Denaturierung der Moleküle ^17. Für die kovalente Bindung von Wachstumsfaktoren, wurden verschiedene Typen von Trägern in den letzten zehn Jahren entwickelt worden. Die Verwendung von bifunktionellen Verknüpfungsmoleküle, die Amino-oder Carboxylgruppen des Proteins beispiels Ziel ist eine Art von Ansatz, der nicht unbedingt erforderlich ist Proteinmodifikation seiner Immobilisierung zu erreichen. In der Tat bietet, während die Proteinmodifikation Vorteil der Steuerung Proteinorientierung,die Einführung der künstlichen Domänen-, Peptid-Tags und ortsspezifische Ketten verändern die biologische Aktivität von Wachstumsfaktoren ^17. Somit, um die Denaturierung aufgrund der Wechselwirkung mit dem Trägermaterial zu umgehen, Oberflächen vorher funktionalisiert werden, beispielsweise mit einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) eines Verbindungsmoleküls, gefolgt von der Kopplung des gewünschten Faktor ^18. Wir haben eine SAM-Ansatz, indem sie auf seiner freien Aminreste verwendet werden, um kovalent immobilisieren BMP-2 auf eine Oberfläche und haben gezeigt, dass das Protein immobilisiert sowohl die kurz-und langfristigen biologischen Aktivität ¹⁹ behält. Dieses Protokoll stellt eine einfache und effiziente Möglichkeit, BMP-2-Zellen für in vitro-Untersuchungen über die Mechanismen, die an der Zellmembran auf und regulieren intrazellulären Signalisierung für osteogene Signalisierung verantwortlich zu liefern.

Protocol

1. Synthese von 11-Mercaptoundecanoyl-N-hydroxysuccinimidester (MU-NHS)

1. (Dimethylamino) pyridin in 10 ml Aceton (pa) und 1 g 11-Mercaptoundecansäure in 40 ml Dichlormethan (Pa) bei Raumtemperatur (RT) - eine Lösung von 500 mg N-Hydroxysuccinimid und 30 mg 4 hinzuzufügen.
2. Die Reaktion wird auf 0 ° C gekühlt und tropfenweise mit 1,1 g N, N '-Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dichlormethan (unter Stickstoffatmosphäre). Halten Sie die Reaktion bei niedriger Temperatur für 1 h und dann über Nacht bei RT rühren.
3. Der Niederschlag abfiltriert und trocknet es im Vakuum. Reinige das Produkt durch Flash-Chromatographie mit Petrolether Benzol und Ethylacetat (PA) in einem Verhältnis von 1:1.

2. Herstellung von homogenen Gold-Schichten

1. Saubere Deckgläser mit Präzision Tücher und beschallen sie für 5 Minuten in einer Lösung, die eine 1:1-Mischung von Ethylacetat (pa) und Methanol (pa). RinsE Substrate mit Methanol und Trocknen unter Stickstoffstrom.
2. Legen Sie die sauberen Substrate in der Sputter-Beschichtungsvorrichtung. Kammer evakuieren. Entfernen der obersten Schicht aus Chromoxid Chromtargets durch Sputtern für 60 sek. Die Proben werden unter der Metallstrahl und überziehen sie mit einer 10 nm Chromschicht, gefolgt von der Beschichtung mit einer 40 nm dicken Goldschicht.

3. Oberflächen Immobilisierung von BMP-2

1. Auflösen MU-NHS in N, N-dimethlyformamide (DMF) zu einer Endkonzentration von etwa 1 mM und Inkubation Goldsubstrate in der MU-NHS-Lösung bei RT für 4 h unter Stickstoffatmosphäre.
2. Ultraschallbad Flächen in DMF für 2 Minuten gründlich mit DMF und MeOH und trocknen unter Stickstoffstrom.
3. Bereiten Sie eine Stammlösung von rhBMP-2 in sterile 4 mM HCl mit einer Konzentration von 100 ug / ml (store-Aliquots bei -80 ° C). Für die Arbeit Verdünnungen (3,5 ug / ml), verdünnt das Stammlösung in PBS / NaCl (PBS mit 1 M NaCl) und eineP assen auf pH 8,5 unmittelbar vor der Verwendung.
4. Inkubieren funktionalisierten Oberflächen MU-NHS in der rhBMP-2 Arbeitslösung bei 4 ° C über Nacht. Überstand entfernen Inkubation. Ultraschallbad Flächen in PBS / NaCl für 2 Minuten und waschen 3x mit sterilem PBS / NaCl.

4. Oberflächencharakterisierung

1. Unspezifische Adsorption von Antikörpern zu blockieren, Inkubation Oberflächen mit einer 5% BSA (w / v) in PBS-Lösung für 1 h bei RT, gefolgt von einer Inkubation mit einem Anti-BMP-2-Antikörper (1:100 in 1% (w / v ) BSA / PBS-Lösung) für 1 h bei RT. Zweimal waschen mit PBS Flächen beschallen und für 30 Sekunden.
2. Substrate inkubieren mit HRP-konjugierten sekundären Antikörper (1:1000 in 1% (w / v) BSA / PBS-Lösung) für 30 min bei RT, dann zweimal mit PBS waschen.
3. Verwenden Ampliflu Red Assay HRP enzymatische Aktivität messen bei 570 nm mit einem Plattenlesegerät.

5. Analyse der biologischen Aktivität

1. Seed 1 x 10 ⁵ Maus C2C12 Myoblasten pro Well in 6-Well-plAtes in Wachstumsmedium, bestehend aus DMEM high glucose Pyruvat mit 10% FBS, 1% Penicillin / Streptomycin und inkubieren für 24 h bei 37 ° C / 5% CO ₂ enthält, _ergänzt.
2. Hungern Zellen in Serum-freien DMEM für 3-5 Stunden vor auf die mit immobilisiertem BMP-2 verziert Oberflächen Aussaat.
3. Für die Untersuchung der kurzfristigen Signal Induktion, ersetzen Sie das Medium durch 200 ul frisches Serum-freien DMEM und legen Sie die immobilisierten BMP-2-Flächen über den Zellen. Die Oberfläche sollte mit feiner Spitze Pinzette gehandhabt werden, um Kratzer zu vermeiden.
4. Oberflächen sanft entfernen und saugen das Medium mit einer Pipette, waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS. Gehen Sie zur Analyse von Zell-Antworten.
5. Für die Analyse der Langzeit biologische Aktivität, Platte Zellen auf Oberflächen-und Kultur sie bei 37 ° C / 5% CO ₂ in niedrigen Serumbedingungen (2% FBS) für sechs Tage.

Results

In unserem Aufbau wurde Gold als Hilfsstoff gewählt, da es eine biologisch unspezifische aber chemisch abstimmbaren System. Darüber hinaus ist die Anwendung von selbstorganisierenden Monoschichten bringt viele Vorteile: SAMs adsorbieren spontan über ihre "head-Gruppen" auf Metalle und Form Monoschichten mit wenigen Fehlern, während ihre funktionellen Endgruppen kann weiter modifiziert werden. Somit stellen sie eine Plattform, um die Eigenschaften der Oberfläche in einer kontrollierten Art und Weise aber sehr anpassungs ...

Discussion

In diesem Protokoll beschreiben wir die Herstellung von Oberflächen mit bioaktiven rhBMP-2 funktionalisiert ist. Dieser Ansatz weist zwei Schritte auf: 1) die anfängliche Bildung einer selbstorganisierenden Monoschicht (SAM) eines bifunktionellen Linkers an der Goldoberfläche, 2) kovalente Immobilisierung von rhBMP-2-Proteins. In früheren Arbeiten, validiert man die effektive Bindung des bifunktionellen Linker und dem Wachstumsfaktor, und zeigten, dass auf der Oberfläche immobilisierten rhBMP-2 behält seine biologische ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
N-Hydroxysuccinimid	Sigma-Aldrich	130672
4-(Dimethylamino)pyridin	Sigma-Aldrich	522805
Aceton	AppliChem	A2282
11-Mercaptoundecansäure	Sigma-Aldrich	674427
Dichlormethan	Merck	106050
N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid	Sigma-Aldrich	D80002
Erdöl Benzol	Merck
Glasdeckgläser	Carl Roth	M 875
Ethylacetat	AppliChem	A3550
Methanol	Carl Roth	4627
N,N-dimethylformamid	Carl Roth	T921
rhBMP-2	R& D Systems	355-BM	trägerfrei; ausgedrückt in E.coli
PBS	PAA	H15-002
NaCl	Carl Roth	HN00.2
Poly(dimethylsiloxan) (PDMS)	Dow Corning
Sylgard 184 Silikonelastomer Bausatz	Dow Corning
Anti-rhBMP-2	Sigma	B9553
Anti-Maus-IgG-HRP	Santa Cruz	sc-2005	Sekundärantikörper
Ampliflu Red Assay	Sigma	90101
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1x), flüssig	Gibco	41966	Glucose
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F7524	Steril filtriert, zellkulturgetestet
Pen/Strep	Gibco	15140
Trypsin 0,05% (1x) mit EDTA 4Na	Gibco	25300
Glycin (0,1 M)	Riedel-de Haë n	33226
IGEPAL CA-630 (1%)	Sigma	I8896	Lysepuffer (ALP-Assay)19
Magnesiumchlorid (MgCl2)(1 mM)	Carl Roth	HNO3.2
Zinkchlorid (ZnCl2) (1 mM)	Carl Roth	3533.1
p-Nitrophenylphosphat (pNPP)	Sigma	S0942	Phosphatase-Substrat
Anti-Mysin-Schwerkette (MHC)	Entwicklungsstudien Hybridoma Bank, University of Iowa	MF20	Monoklonaler Antikörper
Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus-IgG	Invitrogen	A11001
DAPI	Sigma	D9542
Equipment
Ultrsonic bath (Sonorex Super RK 102H), Frequenz 35 kHz	BANDELIN electronic GmbH Co. KG
MED 020 Sputterbeschichtungsanlage	BAL-TEC AG		Beschichtungsbedingungen Cr: 120 mA, 1.3 x 10-2 mbar, 30 sec Au: 60 mA, 5.0 x 10-2 mbar, 45 sec
Tecan Infinite M200 Plate Reader	Tecan