Anreicherung und Reinigung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Nachweis von Zelloberflächenantigenen unter Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 und GCTM-2

Zusammenfassung

Wir beschreiben die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 zum kombinierten Nachweis von Zelloberflächenantigenen mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zur Identifizierung und Anreicherung lebender menschlicher embryonaler Stammzellen (hESC) mit positiver Selektion und auch zur Verwendung negativer Selektion zur Reinigung von hESCs aus einer gemischten Zellpopulation.

Zusammenfassung

Menschliche embryonale Stammzellen (hESC) können sich in vitrounbegrenzt selbst erneuern und mit den entsprechenden Hinweisen induziert werden, um sich in potenziell alle somatischen Zelllinien zu differenzieren. Differenzierte hESC-Derivate können möglicherweise in Transplantationstherapien zur Behandlung einer Vielzahl von zelldegenerativen Erkrankungen eingesetzt werden. HESC-Differenzierungsprotokolle ergeben jedoch in der Regel eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie verbleibenden undifferenzierten Zellen. Für die Übersetzung differenzierter hESC-Derivate aus dem Labor in die Klinik ist es wichtig, zwischen undifferenzierten (pluripotenten) und differenzierten Zellen unterscheiden zu können und Methoden zur Trennung dieser Populationen zu generieren. Die sichere Anwendung von hESC-abgeleiteten somatischen Zelltypen kann nur mit pluripotenten Stammzellfreien Populationen erreicht werden, da Rest-HESCs nach der Transplantation Tumoren induzieren könnten, die als Teratome bekannt sind. Zu diesem Zweck beschreiben wir hier eine Methodik zum Nachweis von pluripotenten TG30 Hi-GCTM-2 Hi hESCs mit positiver Selektion mit pluripotenten TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs. Mit Hilfe der negativen Selektion mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik konnten wir undifferenzierte hESCs in Populationen erkennen und säubern, die sehr früh gedifferenzierung erfahren (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). In einer weiteren Studie bildeten pluripotente StammzellfreieProben von differenzierten TG30 Neg-GCTM-2^Neg-Zellen, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll ausgewählt wurden, keine Teratome, sobald sie in immungeschwächte Mäuse transplantiert wurden, was die Robustheit unseres Protokolls unterstützt. Auf der anderen Seite, TG30/ GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Konsekutive TG30^Hi-GCTM-2^Hi hESCs beeinträchtigte nicht ihre Fähigkeit, sich in vitro selbst zu erneuern oder ihre intrinsische Pluripotenz. Daher bieten die Eigenschaften unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik einen empfindlichen Test, um hoch angereicherte HPSC-Populationen als Inputs für Differenzierungstests zu erhalten und potenziell tumorigenic (oder Rest-) hESC von abgeleiteten Zellpopulationen zu befreien.

Einleitung

HPSC (hPSC) umfassen menschliche embryonale Stammzellen (hESC) und humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC). HPSC kann sich unter geeigneten Kulturbedingungen auf unbestimmte Zeit erneuern, ohne seine Fähigkeit zu verlieren, die als "Pluripotenz" bekannt ist. Pluripotenz ist definiert als das Potenzial für eine Zelle, sich in im Wesentlichen jede somatische Zelllinie zu unterscheiden, einschließlich Zellen, die für jede der drei embryonalen Keimzellschichten repräsentativ sind. Das bemerkenswerte Potenzial von hPSC bietet ein Mittel für eine Vielzahl von zellbasierten Anwendungen, einschließlich therapeutischer Optionen. Zum Beispiel gibt es Erkrankungen mit Zelltod und Degeneration, bei denen die normale Funktionsfähigkeit von Zellen im menschlichen Körper beeinträchtigt ist, wie bei Herzinsuffizienz, Wirbelsäulenverletzungen, Diabetes, Parkinson-Krankheit, einigen Krebsarten und anderen klinischen Pathologien. Patienten, die unter diesen Erkrankungen leiden, könnten möglicherweise durch Transplantation gesunder und funktioneller somatischer Zellen behandelt werden, die aus hPSC im Labor abgeleitet wurden. Die aktuellen hPSC-Differenzierungsprotokolle sind jedoch nicht 100% effizient und ergeben eine Mischung aus differenzierten Ziel- und Off-Target-Zelltypen sowie Rest-hPSCs, die keiner Differenzierung unterzogen wurden, sondern erneuern sich weiter^{selbst 1-3}. Das Vorhandensein einer kleinen Anzahl von hPSC in einer Probe von hPSC-abgeleiteten somatischen Zellen, die für die Transplantation in Patienten bestimmt sind, stellt ein ernstes klinisches Risiko dar, da diese Zellen aufgrund ihrer inhärenten Natur Gewebe aller drei embryonalen Keimschichten bilden könnten, potenziell in vivo eine Art von Tumor bilden könnten, der als Teratom bekannt ist. Daher können nur Zielzellpopulationen, die als frei von pluripotenten Stammzellen bestimmt sind, als sicher für die Transplantation bei Patienten angesehen werden. Es gibt mehrere Ansätze, um möglicherweise die Reinigung von Rest-HPSCs nach Differenzierung zu erreichen (zur Überprüfung siehe Polanco und Laslett⁴). Wir haben bereits über die Verwendung der monoklonalen Antikörper TG30 (CD9) und GCTM-2 gekoppelt an fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) berichtet, um pluripotente Stammzellen zu identifizieren und sie von Zellen zu unterscheiden, die sich einem frühen Stadium der Differenzierung in Kulturen der^{hESC-Linien 5-7}unterziehen.

Ein Vorteil der Verwendung von Antikörpern zum Nachweis von Zelloberflächenantigenen besteht darin, dass die Zielzellen nach der Antikörperbindung und/oder Etikettierung in der Regel lebensfähig sind. Daher können Zielzellen nach der Antikörperkennzeichnung gesammelt und für Erweiterungen und weitere Anwendungen vor der Transplantation rekultiviert werden. Eine Einschränkung für Zelloberflächenantigene, die auf hPSC exprimiert werden, ist, dass sie nicht ausschließlich für das pluripotente Stadium gelten und in vielen Fällen während der Entwicklung zeitlich neu ausgedrückt werden und daher in einigen differenzierten Zelltypen nachgewiesen werden. Wenn es daher darum geht, Antikörper zu verwenden, um menschliche pluripotente Zellen zu erkennen und sie aus einer Probe von hPSC-abgeleiteten Zellen zu säubern, sollten ausgewählte Antikörper nicht auch mit Antigenen auf die spezifischen differenzierten Zelltypen reagieren, die für die Transplantation bestimmt sind. Leider gibt es eine begrenzte Anzahl von Antikörpern, die Zelloberflächenmarker auf Live-hPSCs ⁴erkennen, wodurch die Auswahlmöglichkeiten eingeschränkt sind. Darüber hinaus haben einige Studien darauf hingewiesen, dass der Nachweis eines einzelnen Zell-Oberflächen-Markers nicht ausreicht, um alle hPSC zu eliminieren, was darauf hindeutet, dass jeder Versuch, alle pluripotenten Subpopulationen von hPSC zu beseitigen, sich auf Methoden stützen sollte, die zwei oder mehr Antikörper verwenden, die verschiedene Epitope erkennen, die durch hPSCs ^9-10ausgedrückt werden. Wie bereits erwähnt, sind nur hPSC-abgeleitete Zellen, die als pluripotente Stammzellfreie Zellpopulationen bestimmt werden könnten, für eine menschliche Transplantation geeignet. Das Erreichen dieses Stringenzniveaus kann nicht mit einem einzigen Durchgang durch eine antikörpervermittelte Zellsortiertechnologie erreicht werden. Eine Rekulturierung der angereicherten Population differenzierter Zielzellen und nachfolgende Zellsortierungsrunden können erforderlich sein, um endgültig pluripotente stammzellfreie Proben zu erhalten.

In unserem Labor haben wir zwei hES-Zell-Oberflächen-Antikörper, TG30 (CD9) und GCTM-2, für den Nachweis lebender pluripotenter Zellen extensiv charakterisiert. Unsere Studien haben gezeigt, dass der kombinierte Nachweis von TG30 und GCTM-2 stark mit der Expression kanonischer Pluripotenzassoziierter Gene in den ^{hESC-Linien 5-7}korreliert. TG30/GCTM-2 FACS Immunprofiling hat immer wieder gezeigt, dass hESC-Kulturen einen quantitativen kontinuierlichen Gradienten des TG30/GCTM-2-Expressions ^5-7darstellen. Wir haben willkürlich vier Populationen (P) von Zellen innerhalb dieses TG30/GCTM-2 Gradienten etabliert: P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low), P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) und P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ^5-7. Unsere Charakterisierung dieser P4-, P5-, P6- und P7-Zellpopulationen hat gezeigt, dass die P6- und P7-Unterfraktionen eine große Anzahl von pluripotenzassoziierten Genen ausdrücken und effizient stammähnliche Kolonien bilden, wenn sie nach FACS ^2-3rekultiviert werden. Andererseits exprimieren P4-Zellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) eine große Anzahl von Differenzierungsmarkern und bilden die spontan differenzierten Zelltypen, die typischerweise in expandierenden Kulturen der hESC-Linien ^5-6vorkommen. Wir haben beschlossen, die Potenzialität unserer TG30/GCTM-2 FACS für die selektive Eliminierung von ResthPSC nach früherdischer Differenzierung und auch für die Anreicherung pluripotenter Stammzellpopulationen zu testen. Das unten beschriebene Protokoll zeigt, wie man differenzierte P4 -Zellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) nach FACS sammelt und rekultiviert, um die Reinigung von pluripotentem P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) zu erreichen. Darüber hinaus erklären wir auch die Sammlung und Rekultur von pluripotenten P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi), um eine angereicherte Kultur pluripotenter Zellen zu erhalten, die anschließend als definierte Inputpopulation verwendet werden könnten, um die Effizienz und Konsistenz von Differenzierungstests potenziell zu erhöhen.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde mit hESC-MEL1¹¹ Standard-Massenkulturen durchgeführt, die von der StemCore-Anlage an der Monash University (Melbourne) bereitgestellt wurden. Diese Zelllinie wird routinemäßig auf einer Schicht von mitotisch inaktivierten Maus-Embryonal-Fibroblasten (MEFs) in bFGF-ergänztem hESC/KOSR-Medium⁷ kultiviert und mit enzymatischer Dissoziation (Collagenase) alle 5-7 Tage⁸aufrechterhalten. hESC-Kulturen, die in 75 cm² (T75) Kolben auf 80 % Konfluenz angebaut werden, werden als Eingangspopulationen für dieses Protokoll verwendet. Alle unten beschriebenen Zellmanipulationsverfahren sollten unter aseptischen Bedingungen in einem HEPA-gefilterten Biosicherheitsschrank der Klasse II durchgeführt werden.

Bereiten Sie zwei Tage vor der Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays die T75-Kulturplatten (beschrieben in Abschnitt 1) vor, die für die Rekultur von Nach FACS zurückgewonnenen Zellen verwendet werden sollen (siehe Abschnitt 4).

1. Aussaat von MEFs und Vorbereitung von MEF-konditioniertem Medium

1.1 TAG -2: Beschichtung von MEFs in T75-Flaschen

1. Pipette 10 ml 0,1% w/v Gelatine in jeden T75 Kolben und neigung zur gleichmäßigen Beschichtung oberfläche.
2. 30 min bei Raumtemperatur in einem Biosicherheitsschrank inkubieren.
3. Aspirieren Gelatinelösung.
4. 20 ml MEF-Medium in den Kolben geben und in einem Zellkultur-Inkubator 30 min auf 37 °C/5%_CO2 voraussetzen.
5. Platte mitotisch inaktivierte MEFs auf vorbereiteten Kolben in den folgenden Dichten. Für 1/3 MEF Dichtesamen 1,4 x 10⁴ Zellen/cm² (T75= 1 x 10⁶ MEFs). Für MEF-Saatgut mit voller Dichte 5,3 x 10⁴ Zellen/cm² (T75 = 4 x 10⁶ MEFs).

Hinweis: Wir verwenden routinemäßig MEFs, die durch γ-Bestrahlung mitotisch inaktiviert wurden. Ein Protokoll zur Herstellung γ bestrahlter MEFs finden Sie in Michalska¹².

6. Inkubationsbestrahlte MEF-Kulturen bei 37 °C/5%_CO2 über Nacht. Die 1/3-Flaschen können 1-4 Tage ohne MEF-Medium-Wechsel inkubiert werden. Diese Kolben werden zum Replatieren von Post-FACS-Zellen verwendet (wie in Protokoll 4). Volle MEF-Flaschen werden über Nacht inkubiert, um CM gemäß unten in Schritt 1.2 zu erzeugen.

1.2 TAG -1: Vorbereitung des MEF-bedingten Mediums (CM)

1. Aspirieren MEF-medium aus VollmeF T75-Flaschen.
2. Vorverwertte 25 ml hESC/KOSR-Medium mit 5 ng/ml HumanfGF-2 pro T75-Kolben ergänzen. Bei 37 °C/5% CO₂ für 24 Stunden inkubieren.
3. MEF-konditioniertes Medium (CM) in ein steriles Gewebekulturrohr zu sammeln, CM mit 10 ng/ml Human FGF-2 frisch zu ergänzen und mit einem 0,22 m Polyethersulfonfilter zu filtern.
4. Um zusätzliche CM zu produzieren, wiederholen Sie die Schritte 1.2.2 und 1.2.3 täglich auf derselben MEF-Kultur für eine Woche.

Ersetzen Sie am Tag der Durchführung eines TG30/GCTM-2-Assays MEF-medium in 1/3 MEF T75-Flaschen durch CM und vordem Ausgleich für mindestens 30 min, bevor Sie hESCs oder hESC-derivat-Derivatezellen aus dem verfahren wie unten beschrieben ensaatieren. CM wird entweder frisch verwendet oder bei 4 °C für bis zu 2 Wochen gelagert. CM wird in diesem Protokoll verwendet, da es in unseren Händen die Lebensfähigkeit der Zellen nach FACS im Vergleich zu nicht konditionierten Medien erhöht (Ergebnisse nicht gezeigt).

2. Durchführung eines TG30/GCTM-2 FACS-Assays: Dissoziation von hESC-Massenkulturen in Einzelzellen

Hinweis: Prechill 20% FBS/DMEM-F12 medium bei 4 °C.

1. Aspirieren Sie die hESC/KOSR-Medien aus zwei T75-Flaschen mit einer kultivierten hESC-Linie.
2. Spülen Sie die Zellen in jedem T75 mit 10 ml DPBS und aspirieren zu entfernen.
3. Fügen Sie 3 ml TrypLE Express Dissoziationslösung in jeden T75-Kolben ein. Bei 37 °C/5%_CO2 für 5 min inkubieren.
4. Bump die Seite der Kolben, um eine vollständige Auflösung der Zellen zu erhalten. Unter dem Mikroskop überprüfen. Wenn sich die Zellen nicht leicht lösen, brüten Sie weitere 2-3 min bei 37 °C/5%_CO2.
5. 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C gehalten) zu jedem T75-Kolben geben. Mit einer sterilen 10 ml Pipette trituieren die dissoziierten Zellen mehrmals gegen die Kolbenwand, um eine überwiegend einzellige Suspension zu erreichen.
6. Legen Sie ein 70-m-Zellsieb auf ein 50 ml steriles Polypropylen-Rohr. Verwenden Sie eine sterile 10 ml Pipette, um die hESC Einzelzellensuspensionen zu erzwingen, die aus den beiden T75-Flaschen durch das Sieb gepoolt werden.
7. Zellesieb entsorgen, den Rohrdeckel ersetzen und die gepoolte hESC-Aufhängung bei 1.000 x g für 2 min zentrieren.
8. Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) sanft aufhängen.
9. Führen Sie eine zweite Zentrifugation bei 1.000 x g für 2 min durch.
10. Überstand entsorgen, 10 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) hinzufügen und sanft trituieren, um Zellen wieder aufzusetzen. Die 50 ml Tube auf Eis legen. Dieses Rohr wird für das unten beschriebene Sortierproben-Immunostaining-Verfahren verwendet.
11. Nehmen Sie 20 l der hESC Einzelzellsuspension (Schritt 2.10) für die Zellzahlzählung mit einem Hemotozytometer. Sie sollten eine Ausbeute von 10-15 Millionen Zellen pro T75-Kolben erwarten.

Hinweis: FBS wird in diesem Teil des Protokolls verwendet, um die Zelllebensfähigkeit nach FACS zu erhöhen.

3. ImmunfluoreszenzFärbung der Zelloberflächenantigene TG30 und GCTM-2

1. Aliquot 150 l (ca. 100.000 Zellen) einer hESC Einzelzellsuspension (ab Schritt 2.11) in jeweils sechs Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml. Diese sechs Aliquots werden für die Färbekontrollen verwendet, die erforderlich sind, um den Test auf der FACS-Maschine zu kalibrieren. Die verbleibende Zellsuspension mit 9 ml wird Ihre Sortierprobe sein, in der die dissoziierte Kultur für den Nachweis von TG30 und GCTM-2 gemäß den Tabellen 1 und 2gecostainiert wird.
2. Führen Sie Bindungsreaktionen von primärantikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten für die Sortierprobe 9 ml und für die Kontrollen 200 ml betragen. Isotypsteuerelemente als primäre Antikörper einschließen. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.
3. Zentrifugen-Primärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.
4. Überstand entsorgen und die Zellen waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.
5. Führen Sie eine zweite Drehung bei 1.000 x g für 2 min.
6. Führen Sie Bindungsreaktionen von sekundären Antikörpern in 20% FBS/DMEM-F12 durch. Die Endreaktionsvolumina sollten 2,5 ml für die Sortierprobe und 200 ml für die Kontrollen betragen. Bereiten Sie die PE-Anti-Maus CD90.2 Reaktionsröhre in diesem Stadium vor. Rohre horizontal auf Eis legen und 30 min auf einer Schaukelplattform sanft mischen.

Hinweis: Während dieser Inkubationszeit ist es praktisch, CM zu sammeln und 1/3 MEF T75-Flaschen mit CM wie in Abschnitt 1.2 vorzubereiten.

7. Zentrifugen-Sekundärantikörperreaktionen bei 1.000 x g für 2 min.
8. Überstand entsorgen und die Zellen TWICE waschen, indem Sie das Pellet in 20 ml 20% FBS/DMEM-F12 (bei 4 °C vorgechillt) für die Sortierprobe und 200 l für die Kontrollen wieder aufhängen.
9. Führen Sie eine Drehung bei 1.000 x g für 2 min nach jedem Waschen und legen Sie Rohre auf Eis.
10. Überstand entsorgen und Zellpellets in 20% FBS/DMEM-F12, ergänzt mit Propidiumjodid (PI) bei 0,3 g/ml, wieder aufsetzen. Verwenden Sie 2-3 ml für die Sortierprobe und 300 l für die Kontrollen.

Hinweis: Fügen Sie dem Steuerrohr MIT unbefleckten Zellen NICHT PI hinzu.

11. Verwenden Sie eine P1000-Mikropipette, um jede einzelne Zellsuspension durch ein 35-m-Deckelzellsieb zu erzwingen, das an 5 ml Tube Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläser gekoppelt ist.
12. Zentrifuge bei 50 g/min, um durch die Restzellsuspension auf den Siebdeckeln zu erzwingen.
13. Setzen Sie jede einzelne Zellsuspension durch Antippen der Seiten der Rohre aus und legen Sie sie auf Eis. Ihre Zellen sind jetzt bereit für FACS. Bitte fahren Sie sofort fort.

4. Post-FACS-Kultur von TG30/GCTM-2 Unterbrechungszellen in 75 cm² (T75) Flaschen

1. Wir haben bereits berichtet, wie man eine FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 Immunprofiling⁷einrichtet. Das Verfahren ermöglicht die Wiederherstellung lebensfähiger einzeler HESCs, frei von MEFs, und innerhalb der Tore von P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low), P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) und P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) - siehe Abbildung 1E. Richten Sie die FACS-Maschine für TG30/GCTM-2 FACS ein, wie in unserem vorherigen Bericht, um die als nächstes zu verwendenden Zellunterfraktionen wiederherzustellen.
2. 1 ml CM, wie in Schritt 1.2 zubereitet, zu je zwei 5 ml Polystyrol-Rundboden-Reagenzgläsern geben, bevor Zellen von der FACS-Maschine gesammelt werden. Auf Eis legen.
3. Stellen Sie jeweils 400.000 Zellen aus differenzierten P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) und pluripotenten P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellsubfraktionen mit TG30/GCTM-2 FACS wieder her.
4. Zentrifugieren Sie die Sammelrohre bei 1.000 x g für 5 min.
5. Aspirieren Sie die Überstand. Fügen Sie 1 ml vorgläsige 37 °C/5% CO₂ CM hinzu, um jedes Zellpellet mit einem P1000-Mikropipettor wieder aufzuhängen. Säen Sie die Zellen für jede Fraktion auf einen vorausgeglichenen 1/3 MEF T75 Kolben mit CM (vorbereitet nach Schritt 1.2)
6. Kultur bei 37 °C/5%_CO2 für 24 Stunden in einem Zellkultur-Inkubator.
7. ASpirieren Sie CM täglich und ersetzen Sie durch frisch zubereitete CM (wie in Schritt 1.2) für etwa zwei Wochen. Kulturen pluripotenter P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) zeigen nach einer Woche menschliche stammähnliche Kolonien und erreichen nach 9-11 Tagen eine Konfluenz von 80 %. Kulturen von P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) Zellen wachsen meist als Rasen von fibroblastenähnlichen Zellen, die nach 11-13 Tagen die Konfluenz erreicht. In diesem Stadium können bei Bedarf P4- und P7-Zellkulturen für TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutive Rekulturalon von P4- oder P7-Unterfraktionen verwendet werden (siehe Abbildungen 2 und 3).

Ergebnisse

hESC-Derivate, die pluripotente Stammzellfrei sind, können durch konsekutives Passieren von Zellen aus der P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) Subfraktion erhalten werden.

Frühere Berichte haben festgestellt, dass in hESC-Standardkulturen eine Mischung von Subpopulationen koexistiert, die einen Expressionsgradienten von Genen aufweisen, die mit Pluripotenz assoziiert sind^5,6,13. Der kombinierte Nachweis von Zelloberflächenantigenen wie TG30 (CD9) und GCTM-2 ermöglicht die Diskriminierung einer Reihe von Teilmengen von Zellen im pluripotenten Stadium und in verschiedenen Stadien der frühen Differenzierung, wie ihre Expression von Stammzellmarkern und linienspezifischen Transkriptionsfaktoren^5,6,13anzeigt. In Übereinstimmung mit früheren Berichten konnten wir P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low), P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) und P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellen in der hESC-MEL1-Linie für diese Studie(Abbildung 1) unterscheiden. Mit diesem Ergebnis sammelten wir differenzierte P4-Zellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) und pluripotente P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) für weitere Kultur in den unten beschriebenen Studien.

Wir untersuchten, ob wir mit einem negativen Selektionsansatz undifferenzierte hESCs von Zellpopulationen säubern könnten, die sehr früh in der Differenzierung unterzogen werden (TG30^Neg-GCTM-2^Neg). Wir verwendeten eine definierte Anzahl von P4-Zellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), die nacheinander nach FACS (Abbildung 2A) für etwa zwei Wochen kultiviert wurden, und analysierten mit TG30/GCTM-2 FACS, bevor sie an jeder Passage replatiert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass die p4-Subfraktion, angereichert für TG30^Neg-GCTM-2^Neg differenzierte Zelltypen nach aufeinanderfolgenden Passaging, und eine geringfügige Anwesenheit von P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellen in der Ersten Passage (Abbildung 2A, Passage 1) verschwand schließlich nach weiteren Passaging und wurde zu pluripotenten Stammzellen-freien Proben (Abbildung 2A, Passage 3).

Die Anreicherung pluripotenter hESC-Zellen kann durch die Entnahme von Zellen TG30^Hi-GCTM-2^Hi-Zellen erreicht werden.

Basierend auf früheren Beobachtungen, die diesen Test verwenden, würden wir eine Anreicherung von pluripotenten hESCs erwarten, indem wir P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellen sammeln, die hESC-Kolonien bilden sollten. Daher haben wir auch TG30/GCTM-2 FACS-vermittelte konsekutige Durchblutung von pluripotenten P7 -Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) untersucht. In diesen P7-Kulturen wurde die TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) rekultiviert. Auf diese Weise beobachteten wir, dass die Mehrheit der Zellen in den Subfraktionen im Zusammenhang mit Pluripotenz (P6 und P7) lagen, was auf eine Anreicherung von pluripotenten Zellen hindeutet, die auch die Fähigkeit zur Differenzierung und Generierung eines kleinen Prozentsatzes von P4 -TG30 Neg-GCTM-2^Neg)Zellen aufrechterhielten (Abbildung 3A). Darüber hinaus zeigten Kulturen von P7-Zellen eine große Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien während der Passierung (Abbildung 3B), was auch auf die Aufrechterhaltung des Pluripotenzzustands hindeutet.

Abbildung 1. Repräsentative Sortierstrategie, um TG30/GCTM-2 FACS-Subfraktionen zu erhalten. (A): Dissoziierte hES-Zellsuspensionen werden als Einzelzellen sortiert und potenzielle Klumpen oder Doublets mit der Vorwärtsstreuung für Höhe und Fläche (FSC-H und FSC-A) abgegrenzt. (B): Potenzielle Trümmer werden mit FSC-A und SSC-A entfernt, und nur intakte Zellen werden weiter sortiert. (C): Nicht lebensfähige Zellen sind aufgrund von Propidiumjodid (PI) Fluoreszenz (FSC-A und FL3-A) ausgeschlossen. (D): MEF-Feederzellen wurden durch negative Selektion basierend auf der Expression von Maus-CD90.2-PE (FL2-A und SSC-A) abgegrenzt. (E): Die isolierte lebensfähige hESC-Fraktion, frei von MEF-Feedern, wird schließlich in P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg), P5 (TG30^Low-GCTM-2^Low), P6 (TG30^Mid-GCTM-2^Mid) und P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Subpopulationen zerlegt. Das negative Gate (TG30^Neg-GCTM-2^Neg, genannt P4) wurde entsprechend der Hintergrund-Autofluoreszenz für die ungefärbten Zellen und auch für Isotyp-Kontrollen eingestellt. (F): Prozentsätze der verschiedenen Gated-Subpopulationen, die typisch für eine TG30/GCTM-2-Flow-Zytometrie-Analyse sind. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2. Repräsentative aufeinanderfolgende Kulturen spontan differenzierter P4-Zellen (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) aus der hESC-MEL1-Linie. (A): Repräsentative TG30/GCTM-2 FACS-Plots, die gated subsets von Zellen (P4, P5, P6 und P7) zeigen, die durch den Grad der nachgewiesenen Expression von TG30- und GCTM-2-Zelloberflächenmarkern diskriminiert werden. Eine anfängliche Population von 400.000 hESC-Derivaten mit P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) Immunoprofiling wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie gesammelt. Diese P4 -(TG30^Neg-GCTM-2^Neg) Zellen werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis zum Erreichen der Konfluenz (11-13 Tage) durchgesieflimmert. Vor jeder Passage wird TG30/GCTM-2 FACS durchgeführt, um nur die p4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg) differenzierten Zelltypen zu sammeln und zu rekulturieren. (B): Typische Morphologie des Rasens von differenzierten P4 -TG30^Neg-GCTM-2^Neg) Zellen nach 14 Tagen. (C): Sporadische hESC-ähnliche Kolonien, die nach 14 Tagen gesehen werden, vermischt mit dem Rasen von P4 -TG30^Neg-GCTM-2^Neg)Zellen nur in Durchgang 1, werden höchstwahrscheinlich durch kontaminierende P7 -Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) erzeugt. Skalenbalken = 200 m. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3. P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellen, die aus hESC-Linien abgeleitet sind, können nacheinander nach FACS durchgehend durchgehend werden, ohne ihre intrinsischen pluripotenten Eigenschaften zu verlieren. Vertreter TG30/GCTM-2 FACS-Immunoprofilierung der verschiedenen aufeinanderfolgenden Passagen, die die diskriminierten Teilmengen von Zellen (P4, P5, P6 und P7) nach dem Expressionsgrad von TG30 und GCTM-2 zeigen. (A): Eine Startpopulation von 400.000 Zellen mit P7-Eigenschaften (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) wird aus Massenkulturen der hESC-MEL1-Linie abgerufen. Pluripotente P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) werden nacheinander nach FACS unter Bedingungen durchgesieht, die für die hESC-Erneuerung in T75-Flaschen unterstützen, bis sie eine Konfluenz von 80 % erreichen (9-11 Tage). TG30/GCTM-2 FACS Immunprofilierung wird vor der Replatierung von Zellen an jedem Durchgang durchgeführt und nur die P7 (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Zellen werden rekultiviert. Die Ergebnisse zeigen, dass P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) ihre pluripotenten Eigenschaften mit anschließender Passaging erhalten, einschließlich der Konservierung des (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) Ausdrucks, die hESC-ähnliche Kolonien bilden (siehe B) und die Fähigkeit zur Differenzierung beibehalten, wie aus der Rekapitulation eines kleinen Bruchteils des differenzierten P4 (TG30^Neg-GCTM-2^Neg)in jedem der FACS abgeleitet werden kann. Skalenbalken = 200 m. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.

Probe (Reaktionsvolumen)	Primärer Antikörper	Sekundärer Antikörper	PE Ratte Anti-Maus CD90.2 b	Propidium Iodid c
Sortierprobe (ca. 9 ml für primäre ABs, 2,5 ml für sekundäre ABs)	(TG30 + GCTM-2) a	AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM	+	+
Steuerung-1: TG30 (200 l)	TG30	AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a	-	+
Steuerung-2: GCTM-2 (200 l)	GCTM-2	AF 647 Ziege Anti-Maus IgM	-	+
Steuerung-3: Anti-Maus-CD90.2 (200 l)	-	-	+	+
Steuerung-4: Phycoerythrin (PE) (200 l)	Maus IgG2a Isotyp	R-Phycoerythrin Ziege Anti-Maus IgG2a	-	+
Steuerung-5: Maus-Immunglobulin-Isotyp (200 l)	Maus IgG2a Isotyp + IgM-Isotyp	AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a + AF 647 Ziege Anti-Maus IgM	-	+
Steuerung-6: Ungefärbte Zellen (200 l)	-	-	-	-

Tabelle 1. Sortieren Sie Beispiel und Steuerelemente für die FACS-Sortierung. ^a Die Sortierprobe wird gleichzeitig mit TG30- und GCTM-2-Antikörpern immunstainiert. ^b PE-anti-mouse CD90.2 wird verwendet, um Mauszellen zu erkennen und MEFs von hESCs während FACS¹⁴zu entfernen. ^c Nicht lebensfähige Zellen sind mit Propidiumjodid in einer Endkonzentration von 0,3 g/ml ausgeschlossen. Reagenz hinzugefügt (+), nicht (-) zu Reaktionsrohr hinzugefügt.

Antikörper	Host	Isotyp	Arbeitsverdünnung
TG30 (1,4 mg/ml)	Maus	IgG2a	1:1,000
GCTM-2 (Hybridonotant)	Maus	Igm	1:5 bis 1:10 a
AF 488 Ziege Anti-Maus IgG2a	Ziege	Polyclonal	1:500
AF 647 Ziege Anti-Maus IgM	Ziege	Polyclonal	1:500
R-Phycoerythrin (PE) Ziege Anti-Maus IgG2a	Ziege	Polyclonal	1:1,000
Anti-Maus-CD90.2	Ratte	IgG2b	1:100
Gereinigte Maus IgG2a, Isotype-Steuerung	Maus	IgG2a	1:200
Gereinigte Maus IgM, Isotype Control	Maus	Igm	1:200

Tabelle 2. Antikörperdetails und Verdünnungen für die FACS-Sortierung. ^a Aufgrund der extrem hohen Expression von GCTM-2 auf der Zelloberfläche von hESCs ist es nicht möglich, mit diesem Antikörper eine Sättigung zu erreichen. Jede Charge des GCTM-2-Hybridom-Überstandes muss mit einer Standardkontrolle oder einer früheren Charge titriert werden, um ähnliche Ergebnisse mit hESCs in der Skala zu erzielen und eine Überfärbung zu vermeiden.

Name des Mediums	Zusammensetzung
hESC/KOSR mittel	Dulbecco es Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) ergänzt durch 20% Knockout Serum Replacement (KOSR), 2 mM GlutaMAX, 1% MEM Nonessential Amino Acids, 0.1 mM 2-Mercaptoethanol, 10 ng/ml humaner Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) und Pen/Strep bei 1x.
MEF mittel	Dulbecco es Modified Eagle Medium, High Glucose (DMEM) ergänzt durch 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 2 mM GlutaMAX und Pen/Strep bei 1x.

Tabelle 3. Zusammensetzung der Kulturmedien.

Diskussion

Im klinischen Kontext sind differenzierte somatische Zelltypen das endgewünschte Produkt für Transplantations- und Therapieanwendungen, und hPSC ist eine sich selbst erneuernde und skalierbare Quelle, um diese somatischen Zellen oder ihre Vorfahren im Labor zu erzeugen. Das Vorhandensein von verbleibenden undifferenzierten hESCs mit einem inhärenten Potenzial für die Teratombildung stellt ein Sicherheitsrisiko dar, wenn man hESC-abgeleitete somatische Zellen für die Transplantation bei Patienten in Betracht zieht. Eine Überprüfung dieser und anderer Risiken im Zusammenhang mit der Zelltherapie finden Sie unter Sharpe et al. ¹⁶ Um solche Anwendungen zu realisieren, ist es daher unerlässlich, dass die Forscher Zielzellpopulationen erzeugen wollen, die auch pluripotente Stammzellfrei sind. Zu diesem Zweck zeigen wir hier, dass es mit unserer TG30/GCTM-2 FACS-Methodik möglich ist, das Vorhandensein von pluripotenten Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) in einer differenzierenden Zellpopulation zu überwachen und tragfähige hESC-differenzierte Derivate zu erhalten, die nach FACS angereichert und rekultiviert werden können. Obwohl es nicht möglich ist, 100% pluripotente Stammzellfreie Proben mit einem einzigen Durchlauf unseres Protokolls zu erhalten, können angereicherte hESC-Derivate rekultiviert werden und nach aufeinanderfolgender Passierung wird 100% somatische Zellreinheit erreicht. Die nachgewiesene Lebensfähigkeit somatischer Zellen für die Expansion nach FACS ermöglicht möglicherweise auch die Produktion einer ausreichenden Anzahl von Zellen, die für potenzielle Transplantationstherapien geeignet sind.

Die ermutigenden Ergebnisse dieser Pilotstudie veranlassten uns, eine umfassendere Untersuchung mit unserem TG30/GCTM-2-Protokoll in einer vergleichenden Studie mit mehreren humaninduzierten pluripotenten Stammzelllinien (hiPSC)¹⁵durchzuführen. In dieser Studie fanden wir heraus, dass pluripotente Stammzellfreie Proben, die mit unserem TG30/GCTM-2 FACS-Protokoll gewonnen wurden, bei der Transplantation in immunbenachteiligte Mäuse keine Teratome erzeugten. Daher können wir getrost feststellen, dass mit der Verwendung dieses In-vitro-Protokolls, Frühstadium Differenzierung Zellkulturen bestimmt frei von pluripotenten TG30^Hi-GCTM-2^Hi-Zellen entwickeln teratomas in vivo. Dies unterstützt nachdrücklich die Robustheit unseres Assays und bietet einen potenziellen Ansatz, um das Risiko einer Teratombildung vor der Verwendung von hPSC-abgeleiteten Zellen in klinischen Anwendungen zu eliminieren.

Umgekehrt zeigen wir auch, dass der TG30/GCTM-2 FACS-Assay verwendet werden kann, um eine pluripotente Zellpopulation mit hohem Expressioniergrad dieser beiden Oberflächenantigene (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) abzurufen. Frühere Studien haben gezeigt, dass TG30^Hi-GCTM-2^Hi-Zellen die höchste Korrelation mit OCT4^hi Expression aufweisen und die höchste Anzahl von hESC-ähnlichen Kolonien^5,6,13,15bilden. Wir gehen daher davon aus, dass das Pluripotenznetzwerk in TG30^Hi-GCTM-2 Hi-Exemittenzellen auf seinen Höchstwerten aktiviert ist. Wir sind der Ansicht, dass die Verwendung unserer TG30/GCTM-2 FACS-Protokolle und das Abrufen von P7-Zellen (TG30^Hi-GCTM-2^Hi) eine großflächige Reinigung von angereicherten lebenden hESC-Kulturen als Inputs für Differenzierungstests ermöglichen könnte.

Zusammenfassend zeigen wir hier die Potenzialität unserer FACS-Assays basierend auf der kombinierten Expression der Oberflächenantigene TG30 und GCTM-2 sowohl für die Reinigung als auch für die Anreicherung von hESCs. Zukünftige Studien mit Protokollen zur gezielten Differenzierung von hPSCs dürften auch in Bezug auf diese Potenzialität informativ sein. Wir sind uns bewusst, dass in einigen Assays, in denen differenzierte hESC-Derivate vorübergehend TG30 (CD9) oder GCTM-2 ausdrücken, diese beiden Antikörper möglicherweise nicht geeignet oder ausreichend sind, um pluripotente Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt im Test⁶aus einer differenzierten Population zu säubern. Daher besteht die ständige Notwendigkeit, neuartige Antikörper zu finden, die lebende hESCs spezifisch erkennen, um die mögliche Begrenzung der Kreuzreaktion mit einigen differenzierten Zelltypen zu überwinden.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
DMEM/F-12	Life Technologies	11320082	Langer Name: Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nährstoffmischung F-12
KOSR	Life Technologies	10828028	Langer Name: Knockout Serum Ersatz
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Langer Name: GlutaMAX Ergänzung
Nicht essentielle Aminosäuren	Life Technologies	11140050	Langer Name: MEM Nicht-essentielle Aminosäuren Lösung
Mercaptoethanol	Life Technologies	21985023	langer Name: 2-Mercaptoethanol
DPBS	Life Technologies	14190250	langer Name: Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung, kein Kalzium, kein
Magnesium TrypLE Express	Life Technologies	12604039	langer Name: TrypLE Express (1x), kein Phenolrot
AF-488	Life Technologies	A21131	Langer Name: Alexa Fluor 488 Ziege Anti-Maus IgG2a
AF-647	Life Technologies	A21238	Langer Name: Alexa Fluor 647 Ziege Anti-Maus IgM
PE-Anti IgG2a	Life Technologies	P21139	Langer Name: R-Phycoerythrin Ziege Anti-Maus IgG2a (γ 2a) Konjugat
DMEM	Life Technologies	11965-092	Langer Name: Dulbecco's Modified Eagle Mittlerer
Pen/Strep	Life Technologies	15140-122	Langer Name: Penicillin-Streptomycin,
flüssiges destilliertes Wasser	Life Technologies	15230-089.	Langer Name: Steriles destilliertes Wasser
PI	SIGMA	P4864	Langer Name: Propidiumiodid-Lösung
FBS	SIGMA	12203C	Langer Name: Fötales Rinderserum
Gelatine	SIGMA	G-1890	Langer Name: Gelatine aus Schweinehaut
Menschlicher FGF-2	Millipore	GF003AF-100UG	Langer Name: Fibroblasten-Wachstumsfaktor basisch, human rekombinant, tierversuchsfrei
Filter 0,22 μ m	Millipore	SCGPU02RE	Langer Name: Stericup-GP, 0,22 μ M, Polyethersulfon, 250 ml, radiosterilisiert
70 μ m Zellsieb	Becton Dickinson	352350	Langer Name: Zellsieb mit 70 μm; m Nylon Mesh
35 μ m Deckel Zellsieb, 5 ml Röhrchen	Becton Dickinson 352235		Langer Name: 5 ml Polystyrol-Reagenzglas mit rundem Boden, mit einer Kappe für ein Zellsieb (35 μ m)
5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden	Becton Dickinson	352054	langer Name: 5 ml Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden, steriles
IgG2a-Isotyp-Kontrollröhr	Becton Dickinson	554126	langer Name: gereinigtes Maus-IgG2a &pa; Isotyp-Kontrolle
IgM Isotyp-Kontrolle	Becton Dickinson	553472	langer Name: Purified Mouse IgM, κ Isotyp-Kontrolle
PE-CD90.2	Becton Dickinson	553014	Langer Name: PE Rat Anti-Mouse CD90.2
8-Peaks Kalibrierung	Becton Dickinson	559123	Langer Name: Rainbow Calibration Particles (8 Peaks)
50 ml steriles Polypropylen-Röhrchen	Greiner Bio-One	227261	Langer Name: 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden, Sterile
T75-Flasche	Greiner Bio-One	658175	Langer Name: CELLSTAR Filterkappe Zellkultur 75 cm2 Kolben
TG30	Merck Millipore	MAB4427	Langer Name: TG30 Antikörper, Klon TG30
GCTM-2	Merck Millipore	MAB4346	Langer Name: GCTM-2 ist nicht im Handel erhältlich, aber TG343 und äquivalenter monoklonaler Antikörper ist
Tabelle 4. Liste der Materialien und Reagenzien
FACS-Gerät	Becton Dickinson		FACSVantage SE mit FACSDiva-Option
Inverses Mikroskop	Olympus		IX71<