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Fern Magnetische Betätigung des Mikrometrische Sonden für

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DOI:

10.3791/50857

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2. Mai 2014

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1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Papier zeigt eine einzigartige Methodik auf der Fernbetätigung in einem bakteriellen Biofilm und die Entwicklung von speziellen magnetischen Pinzette, um in-situ-Messung der lokalen mechanischen Eigenschaften des Komplexes lebendiges Material durch Mikroorganismen an Grenzflächen gebaut ausgesät magnetischen Partikeln.

Zusammenfassung

Bakterielle Adhäsion und das Wachstum von Schnittstellen führen zur Bildung von dreidimensionalen heterogenen Strukturen sogenannten Biofilmen. Die Zellen Wohnung in diesen Strukturen werden durch physikalische Wechselwirkungen von einem Netzwerk von extrazellulären polymeren Substanzen vermittelte zusammengehalten. Bakterielle Biofilme Einflüsse auf viele Aktivitäten des Menschen und das Verständnis ihrer Eigenschaften ist entscheidend für eine bessere Kontrolle über ihre Entwicklung - Wartung oder Tilgung - in Abhängigkeit von ihrer negativen oder wirtschaftlichen Ergebnis. Dieses Dokument beschreibt ein neues Verfahren mit dem Ziel, in situ Messung der lokalen physikalischen Eigenschaften des Biofilms war, bis jetzt untersuchten nur aus einem homogenen Material und makroskopischen Perspektive. Das hier beschriebene Experiment beinhaltet die Einführung magnetischen Teilchen in einen wachsenden Biofilm zu lokalen Sonden, die aus der Ferne, ohne die strukturellen Eigenschaften des Biofilms zu stören betätigbaren Samen. Dedicated magnetischen Pinzette waren Entwickelt, um eine definierte Kraft auf jedes Teilchen im Biofilm eingebettet auszuüben. Das Setup ist auf der Bühne eines Mikroskops montiert, um die Aufnahme von Zeitraffer-Aufnahmen der Partikel-Ziehen Zeitraum zu ermöglichen. Die Trajektorien werden dann von der Ziehsequenz extrahiert und die lokalen viskoelastischen Parameter von jedem Teilchen-Kurve abgeleitet, wodurch die 3D-räumliche Verteilung der Parameter. Einblicke in den Biofilm mechanischen Profil ist wichtig, aus der Sicht eines Ingenieurs für Biofilm-Kontrolle, sondern auch aus fundamentaler Sicht, um die Beziehung zwischen den architektonischen Eigenschaften und der spezifischen Biologie dieser Strukturen zu klären.

Einleitung

Bakterielle Biofilme sind Gemeinschaften von Bakterien, die mit biologischen oder künstlichen Oberflächen 1-3 verbunden. Sie sind durch eine Haftwachstumsmechanismus gekoppelt mit der Herstellung von Polysaccharid-reichen extrazellulären Matrix, schützt und stabilisiert das Gebäude 4,5. Diese Biofilme sind nicht nur passive Assemblagen von Zellen an Oberflächen stecken, aber organisiert und dynamische, komplexe biologische Systeme. Wenn Bakterien wechseln von planktonischen, um die Biofilm Lebensstil, sind Veränderungen in der Genexpression und Zellphysiologie und beobachtet, wie erhöhte Resistenz gegen antimikrobielle Mittel und Gastgeber Immunabwehr als der Ursprung von vielen persistenten und chronischen Infektionen 6. Allerdings ist die kontrollierte Entwicklung dieser lebenden Strukturen bieten auch Chancen für Industrie-und Umweltanwendungen, wie Sanierung von Altlasten, Bio-Filtration von Brauchwasser oder die Bildung von Bio-Barrieren für Boden und Grundwasser aus Contamin schützenation.

Während spezifische Biofilm Lebens molekularen Eigenschaften werden zunehmend beschrieben, sind die Mechanismen, die die Entwicklung der Gemeinschaft und Ausdauer unklar. Mit den jüngsten Fortschritten auf mikro-elektrochemischen Messungen unter Verwendung von Scanning-oder Fluoreszenzmikroskopie sind diese lebenden Organisationen wurde gezeigt, weisen erhebliche strukturelle, chemische und biologische Heterogenität 7. Doch bis jetzt Biofilmmechanik wurden hauptsächlich makroskopisch untersucht. Zum Beispiel Beobachtung von Biofilm Schlangen Verformung aufgrund von Variationen in Fluidströmungsraten 8,9, uniaxiale Kompression der Biofilm Stücke heben von Agar-Medium gezüchtet oder auf der Hülle gleitet, 10,11, Scherung von Biofilm aus der Umgebung aufgefangen und dann in einen parallel übertragen Platte-Rheometer 12,13, Atomkraftspektroskopie mit einer Glasperle und beschichtet mit einer bakteriellen Biofilm zu einer AFM-Cantilever 14 oder einem dedizierten MICR befestigtocantilever Verfahren zur Messung der Zugfestigkeit von Biofilm abgelöst 15,16 Fragmente wurden in den letzten zehn Jahren umgesetzt worden, die nützliche Informationen über die viskoelastischen Eigenschaften des Materials 17. Jedoch ist es wahrscheinlich, dass die Informationen über in situ Biofilm mechanischen Eigenschaften gehen verloren, wenn das Material aus seiner nativen Umgebung, die häufig in diesen Ansätzen der Fall war entfernt. Darüber hinaus ist die Behandlung des Biofilms als homogenes Material fehlt die Information über die mögliche Heterogenität der physikalischen Eigenschaften innerhalb der Gemeinschaft. Daher können die genauen Auswirkungen der Strukturmechanik in der Biofilmbildung und biologische Eigenschaften wie Genexpression Strukturierung oder chemischen Gradienten kaum erkannt werden. Um zu einer Mikro Beschreibung der physikalischen Eigenschaften Biofilm fortschreiten, werden neue dedizierte Werkzeuge erforderlich.

Dieses Papier Details einen originellen Ansatz entwickelt, um zu erreichenMessung der lokalen mechanischen Parameter in situ, ohne den Biofilm zu stören und damit Zeichnung der räumlichen Verteilung der Mikromaterialeigenschaften und dann die mechanische Heterogenität. Das Prinzip des Experiments beruht auf der Dotierung des wachsenden Biofilm mit magnetischen Mikropartikeln, gefolgt von deren Fernladen mit magnetischen Pinzette in der reifen Biofilm. Partikelverschiebung unter kontrollierten Magnetkraft-Anwendung unter dem Mikroskop abgebildet ermöglicht lokalen viskoelastischen Parameter Ableitung, jedes Teilchen seine eigene lokale Berichterstattung Umwelt. Aus diesen Daten kann die mechanische 3D-Profil des Biofilms gezogen werden, offenbart räumlichen und ökologischen Zustand Abhängigkeiten. Das ganze Experiment wird hier auf einem E. gezeigt werden, coli Biofilm von einer gentechnisch veränderten Stamm, der eine dereprimierten F-Plasmid wie gemacht. Die Ergebnisse in einer aktuellen Papier 18 beschrieben eine einzigartige Sicht des Inneren des intakten Biofilm Mechanik.

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Protokoll

1. Bakterien, Kultur und Hänge Vorbereitung

  1. Wählen Sie einen frisch gewachsenen Kolonie von einer Lysogenität Broth (LB)-Agar-Platte, impfen sie in 5 ml flüssigem LB-Medium mit 100 μ g / ml Ampicillin und 7,5 μ g / ml Tetracyclin und Inkubation es für 5 bis 6 Stunden bei 37 ° C auf eine schwankende Plattform.
  2. Dann wird mit 100 μ l der Bakterienkultur in 5 ml Minimalmedium (M63B1) mit 0,4% Glucose und die gleichen Konzentrationen an Antibiotikum ergänzt. Inkubation dieses frisch verdünnten Kultur über Nacht bei 37 ° C auf einem Schüttler.
  3. Nach 16 h Inkubation mit 100 ul der Übernachtkultur zu 5 ml M63B1, 0,4% Glucose. Halten der Röhre bei 37 ° C zu der Schüttlerplattform, bis eine OD von 0,5 erreicht ist. Anschließend wird die Suspension zur Injektion in die Kanalexperiment für die Biofilmbildung bereit.

2. Magnetic Particle Vorbereitung

  1. Nehmen Sie sich 10 ul magnetischen Partikeln -2,8 μ m Durchmesser - aus dem Bestand und waschen Sie sie 3x in 190 ul Minimalmedium mit Hilfe eines magnetischen Probe-Rack.
  2. Einstellen der Partikelkonzentration auf 5 × 10 6 Perlen / ml. Typischerweise 50 ul der gewaschenen Perle Lösung wird mit einer weiteren 950 μ l M63B1 mit 0,4% Glucose gemischt.

3. Kanal Vorbereitung und Biofilmwachstum

  1. Kanal-Montage
    1. Schneiden Sie zwei Quadratmeter (800 μ m Seitenlänge) Borosilikatglas Kapillaren 10 cm lang, zwei 8 cm lange Stücke zu erhalten.
    2. Kleben Sie die beiden Kapillare Stücke auf zwei Glasplättchen - mit 1 cm Überhang an beiden Enden, wie in Abbildung 1 2 cm Abstand mit einem schnell wirkenden Sekundenkleber (so genannte Super-Kleber) - halbiert zuerst.
    3. Autoklavieren die gesamte Einrichtung und die notwendigen Rohre für weitere Kanalverbindung erforderlich.
    4. Sammeln Sie alle sterilen Materialien untereine laminare Strömung Haube: i) die montiert Kanal und Falle 1, ii) die Schläuche und Anschlüsse, iii) die beiden Blasenfallen - die Blase Filter häufig verwendet, um Kindertropf Fütterung (Trap 1) und die hausgemachten Blasenfalle sichern ein 4 cm langes Rohr mit einem größeren Durchmesser (Falle 2), iv) Klemmen, v) 30 ml Spritzen mit M63B1, 0,4% Glucose, und vi) der Abfallflasche gefüllt.
    5. Schließen Sie das ganze Setup mit Luer-Lock-connecters oder Verbindungen in der folgenden Reihenfolge: 50 ml Spritze M63B1 von der Spritzenpumpe, Pädiatrie, Filterblase, hausgemachte Blasenfalle, Kapillar (Abbildung 1, Feld B), und das Rohr auf die Abfallflasche gesteuert. Dann füllen die Einrichtung mit sterilem M63B1, 0,4% Glucose, wodurch der Spritzenpumpe mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 ml / h höher als die Versuchsraten. Sorgfältig zu verfolgen und zu beseitigen alle Luftblasen in der Schaltung.
    6. Durchfluss des Mediums durch das System für 10-15 min; gleichzeitig mischen Sie 1 ml der Bakteriensuspension bei OD 0,5 aus Abschnitt1.3 mit 1 ml der in Abschnitt 2.2 vorbereitet Bead-Lösung gewaschen.
    7. Befestigen (aber nicht schließen) Schellen auf den Schlauch an zwei Stellen: vor und nach den Kapillaren. Schalten Sie den Strom ab.
    8. Führen Sie die Bakterien-Bead-Mischung in die Kapillare nach dem hausgemachten Blasenfalle mit einer 1-ml-Spritze, die Pflege zu halten, bis die Rohrenden, um Lufteintritt zu verhindern. Befestigen Sie die Schläuche und schließen Sie die Klemmen.
    9. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Kapillare und lassen Sie sich die Rohre für Blasen.
    10. Übertragen Sie das Gerät an das Mikroskop und lassen Sie es für 15-20 Minuten stehen, um die Bakterien zu ermöglichen, sich niederzulassen und heften sich an die Oberfläche der Kapillare. Installieren Sie die Kapillare auf den Mikroskoptisch mit dem Abfallbehälter auf einem etwas höheren Niveau. Legen Sie die Spritzenpumpe auf der Theke neben dem Mikroskop. Elevate die Blasenfalle vor der Kapillare etwas höher als der Kapillar-Ebene, um Luftblasen zu erfassen.
  2. Biofilm Growth
    1. Die Durchflussmenge an der Spritzenpumpe und starten Sie den Fluss, wird der Biofilm jetzt auf der Kapillare Oberfläche entwickeln während der vorgeschriebenen Frist - in der Regel 24 oder 48 Stunden in diesen Experimenten.
    2. Konzentrieren Sie sich auf die Kapillare unteren Ebene und starten Sie die Zeitraffer-Aufnahme der Musterbilder - in der Regel eine Aufnahmefrequenz von 2 Bildern / min angemessen berichten über die Biofilmwachstum. Dieses Video Monitore Biofilmwachstum post-Kontrolle (siehe Auszüge in Videos 1, 2 und 3).

4. Magnetische Pinzette Installations

  1. Schrauben Sie die magnetischen Pinzette auf manuell gesteuerten XYZ Mikromanipulatoren und schrauben Sie die Mikromanipulatoren auf dem Mikroskoptisch, um die Position der Pinzette relativ zur Kapillare anzupassen. Platzieren der Pinzette wie in Fig. 2 zu gewährleisten, die entsprechende magnetische Feldgradient in der Beobachtungszone erzeugt.
  2. Verbinden Sie die Pinzette to der Funktionsgenerator über den Leistungsverstärker, um eine 40 Sek. Zeitdauer von 24 sec Nullsignal und 16 Sekunden von 4 A Gleichstrom mit einer Trigger auf der Hellfeldlichtverschluss nach 20 sec für die Signalsynchronisation geschickt, um eine Folge aus erzeugen Ereignisse wie in 3.
    Anmerkung: Diese beiden Vorgänge können zu jeder Zeit zwischen Kapillare Installation und Messbeginn erreicht werden. Siehe experimentieren Überblick Skizze in Abbildung 4.

5. Creep Curve Acquisition

  1. Verwenden der XY Bewegungssteuerung des Mikroskoptisches, um den Rand der linken magnetischen Pol und dem linken Rand der Kapillare in der gleichen Beobachtungsfeld zu bringen. Dem Ursprung des Bezugs Analyse am Schnittpunkt der x-und y-Achsen, die durch den Rand der Kapillare definiert ist und der Rand des Polschuhs bzw. (siehe Fig. 2).
  2. Stellen Sie die vertikale Position der Kapillare mit Feinfokus control Knopf des Mikroskops Position. Typischerweise wird die erste untersuchte Ebene zwischen 4 bis 7 μ m über dem Boden der Kapillare befindet. Video 1 entspricht dem XY-Feld, dessen obere linke Ecke an dem Ursprung des räumlichen Bezugs hat.
  3. Auslöser der Sequenz von 40 sec in Abschnitt 4.2 und Figur 3 durch Einschalten der Stromgenerator und zugleich beschriebenen Ereignisse manuell die Bildaufnahmesequenz von Video 1 auszulösen.
  4. Bewegen Sie die Kapillare an den Nachbarn rechten Feld von einem 250 μ m Übersetzung des Mikroskoptisches nach links und arbeiten wie in Abschnitt 5.3 auf Video 2 von 2 Slice erzeugen und so weiter, um die erforderlichen Videos zu erhalten. Typischerweise 3 bis 4 Felder von 250 x 250 μ m 2 sind entlang der x-Achse vor dem Wechsel der Ebene und Wiederholen der gleichen Vorgänge für die neue Ebene gesammelt.

6. Kraftkalibrierung

  1. Bereiten Sie eine Glycerin-Lösung durch Mischen von 39,8 g Glycerin mit 190 μ l bi-destilliertem Wasser und 10 ul von magnetischen Teilchen in einem 2 x 10 9 Partikel / ml und füllen ein Versuchskanal mit dieser Mischung und legen Sie es auf den Mikroskoptisch wie für die Biofilmprobe beschrieben.
  2. Nach der Installation der magnetischen Pinzette, wie in Abschnitt 4 angegeben, gelten die Magnetkraft, wie in Abschnitt 5.4 angegeben, und machen Zeitraffer-Aufnahmen, jede einzelne Partikelgeschwindigkeit (v) und seine Position in der Kapillare zu extrahieren, um die Kalibrierungsdatei abzuleiten. Diese Datei sollte die aufgebrachte Kraft als Funktion der seine Position in der Zone der Analyse der Kapillare nach Stokes-Gesetz enthalten, F = 6πRηv (R: Radius der Teilchen).

7. Analyse

  1. Verwenden Sie ein "Teilchen-Tracker"-Software, um Text-Dateien mit der Partikelpositionen in jedem Rahmen für all die Stapel von Bildern erworben, wie in Abschnitt 5 angedeutet erhalten. Arbeg die Bildstapel Erfassungsfrequenz, die Berechnung der Partikelverschiebung als Funktion der Zeit (z. B. Fig. 5 und Video 4).
  2. Mit der Kraft Kalibrierungsdatei, wandeln die Verschiebungskurven, um die Einhaltung Kurven (Gesamt Konformität des Materials - J (t) - in Abhängigkeit von der Zeit) nach der Einhaltung Formel:
    figure-protocol-1
    die das Verhältnis zwischen Materialdehnung ergibt und angelegten Spannung für eine Sonde Teilchen mit dem Radius R in einem nicht komprimierbaren, homogenen viskoelastische Medium eingebettet ist, wie zuvor von Schnurr et al 19 hergestellt.
  3. Stellen Sie die Zeitstandkurven der allgemeinen Burgers-Modell für viskoelastische Materialien und leiten die viskoelastischen Parameter, J 0, J 1, η 0, η 1 für jedes Teilchen ( Abbildung 6) nach dem Burgers 'Formel:
    figure-protocol-2
    Anmerkung: Diese phänomenologische Analyse vorher für eine Vielzahl von Materialien, einschließlich biologischer Materialien wie Biofilme zu makroskopischen Rheologie interpretieren 20-22 eingesetzt.

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Ergebnisse

Eine typische Analyse der räumlichen Verteilung der viskoelastischen Parameter im Mikrometerbereich auf einem Biofilm lebenden bereitzustellen, ohne seine ursprüngliche Anordnung stören. Die elastische Nachgiebigkeit - - in Abhängigkeit von der z-Achse entlang der Tiefe und der y-Achse entlang einer lateralen Abmessung des Biofilms gegeben Typische Ergebnisse sind in Figur 7, wo die Werte von J 0 gezeigt. Jeder Punkt entspricht einer Perle, die Kriech-Kurvenanalyse hat eine J 0-Wert

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Diskussion

Diese Magnetpartikel Säen und Ziehen Experiment in situ 3D-Mapping der viskoelastischen Parameter eines wachsenden Biofilm in seinen ursprünglichen Zustand aktiviert. Dieser Ansatz zeigte die mechanische Heterogenität der E. coli Biofilm hier aufgewachsen und gab Hinweise darauf hinweisen, die Biofilm-Komponenten unterstützen die Biofilm-physikalischen Eigenschaften, was stark darauf hindeutet eine fundamentale Implikation der extrazellulären Matrix und genauer den Grad der Vernetzung.

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Offenlegungen

Wir haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse von der Agence Nationale pour la Recherche, PIRIbio Programm Dynabiofilm und vom CNRS Interdisziplinäre Risiko Programm unterstützt. Wir danken Philippe Thomen für die kritische Durchsicht des Manuskripts und Christophe Beloin für die Bereitstellung der E. coli-Stamm in dieser Arbeit verwendet.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Tabelle 1: Reagenzien und
Zellen Magnetische PartikelLebenstechnologien14307DMikrometrische magnetische Partikel, 2.8 µ m Durchmesser
Ampicillin (Antibiotikum)Sigma-AldrichA9518
Tetracyclin (Antibiotikum)Sigma-Aldrich87128
Bakterienstamm MG1655gfpFUGB, Institut Pasteur, FrankreichProduziert an seiner Oberfläche F pili, resistent gegen Ampicilllin und Tetracyclin.
Tabelle 2: Kapillaren und Schläuche
Filter für die pädiatrische PerfusionProdimed-plastimed6932002
hohle quadratische KapillarenComposite Metal Scientific8280-100Hergestellt aus Borosilikatglas. Quadratisch 0,8 mm x 0,8 mm
Schlauch SilikonperoxidVWR international228-0512Durchmesser 1 mm
Schlauch SilikonperoxidVWR international228-0700Durchmesser 3 mm
Table 3: Biofilmwachstum
Lysogene Bouillon (LB) LösungAmresco-VWRJ106-10PKStandardmedium zur Züchtung von Bakterien.
M63B1-LösungHausgemachtesStandardmedium mit minimalem Mindestmaß für die Züchtung von Bakterien.
GlukoseSigma-AldrichG8270Wird verwendet, um M63B1 Medium mit 0,4 % Glukose herzustellen.
Tabelle 4: Elektronik
Kamera EMCCD   HamamatsuC9100-02
HeizungsreglerWorld precision instruments300354
FunktionsgeneratorAgilent technologies33210A
LeistungsverstärkerHausgemachtEs gibt ein Stromsignal mit Amplituden bis zu 4 A.
SpritzenpumpenKd ScientificKDS-220
ShutterVincent AssociatesUniblitz T132
Magnetische PinzetteHausgemachtZwei elektromagnetische Pole, jeweils bestehend aus einer Kupferspule mit 2.120 Windungen von 0,56 mm Durchmesser Kupferdraht und Kernen aus weichmagnetischer Legierung (Supra50-Arcelor Mittal, Frankreich), quadratisch geformt nach dem in Abbildung 10 gezeigten Bauplan. Die beiden Kerne sind mit dem Nordpol zum Südpol hin montiert, um eine magnetische Kraft in eine Richtung entlang der Länge der Kapillare zu erzeugen. Weitere Informationen zur Spulenverkabelung finden Sie in Abbildung 11.
Tabelle 5: Optik
Inverses Mikroskop NikonTE-300
S Fluor x40 Objektiv (NA 0.9, WD0.3)NikonDies ist ein Objektiv mit großem Arbeitsabstand, das die Beobachtung des Biofilms in der Tiefe ermöglicht.
Epifluoreszenzfilter: 1) für grüne Fluoreszenz: Exc 480/20 nm; 495 DM; Em 510/20  2) für rote Fluoreszenz: Exc 540/25 nm; 565 DM; Em 605/55Chroma1)#49020 2)#31002Die Partikelverschiebung bei Krafteinwirkung wird mit dem roten Fluoreszenzfilterblock aufgezeichnet.
Tabelle 6: Bildanalyse
ImageJNIH - Partikeltracker-Plugin

Referenzen

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