Mit Cokultur zur Erkennung chemisch vermittelte Interspezies-Interaktionen

Zusammenfassung

Bakterien produzieren sezernierten Verbindungen, die das Potenzial, die Physiologie der Mikroorganismen ihre Nachbarn beeinflussen. Hier beschreiben wir eine Co-Kultur Bildschirm, der Nachweis solcher chemisch vermittelte Inter Wechselwirkungen durch Mischen von Bodenmikroben mit fluoreszierenden Reporter-Transkriptions Stämmen von Bacillus subtilis auf festen Medien ermöglicht.

Zusammenfassung

In der Natur, Bakterien existieren selten isoliert, sondern werden durch eine Vielfalt von anderen Mikroorganismen, die die lokale Umwelt zu verändern durch Sekretion von Metaboliten umgeben. Diese Metaboliten haben das Potenzial, die Physiologie und die Differenzierung ihrer mikrobielle Nachbarn modulieren und sind wahrscheinlich wichtige Faktoren bei der Errichtung und Instandhaltung von komplexen mikrobiellen Gemeinschaften. Wir haben eine Fluoreszenz-basierten Kokultur Bildschirm, um solche chemisch vermittelte mikrobielle Wechselwirkungen identifizieren. Der Bildschirm beinhaltet die Kombination eines fluoreszierenden Reporterstamm mit Transkriptionsumwelt Mikroben auf festen Medien und so die Kolonien in Co-Kultur wachsen. Die Leuchtstofftranskriptions Reporter ist so konzipiert, dass die gewählte Bakterienstamm fluoresziert, wenn es einen bestimmten Phänotyp von Interesse exprimieren (dh die Biofilmbildung, Sporenbildung, Virulenzfaktor Produktion, etc.) Screening ist unter Wachstumsbedingungen durchgeführt wheWieder dieser Phänotyp nicht exprimiert wird (und damit der Reporter-Stamm ist in der Regel nicht fluoreszierend). Wenn ein Umwelt Mikrobe sondert ein Metabolit, der diesen Phänotyp aktiviert, diffundiert es durch den Agar und aktiviert die fluoreszierenden Reporter-Konstrukt. Dies ermöglicht die Induzierung Metaboliten produzierenden Mikroben nachzuweisenden: sie sind nicht-fluoreszierenden Kolonien meisten proximal zu den fluoreszierenden Kolonien. Somit ermöglicht dieser Bildschirm die Ermittlung von Umwelt Mikroben, die diffusionsfähige Metaboliten, die eine bestimmte physiologische Reaktion in einem Reporterstamm aktivieren produzieren. Diese Publikation beschreibt, wie: a) wählen Sie die entsprechende Co-Kultur Screeningbedingungen, b) bereiten die Reporter und Umwelt Mikroben für Screening, c) führen die Co-Kultur-Bildschirm, d) zu isolieren mutmaßlichen Induktion Organismen, und e) bestätigen ihre Tätigkeit in einem zweiten Bildschirm. Wir haben diese Methode, um für Bodenorganismen, die Biofilmmatrix-Produktion in Bacillus subtilis aktivieren Bildschirm

Einleitung

Wir interessieren uns für das Verständnis, wie die Metaboliten, die Bakterien absondern, beeinflussen die Physiologie und die Entwicklung der Nachbar Mikroben. Viele Metaboliten wurden für ihre bioaktiven Effekte auf andere Mikroben gekennzeichnet. Zwei gut beschriebenen Beispiele sind Antibiotika, die das Wachstum anderer Mikroorganismen hemmen und Quorum Sensing-Moleküle, die die globale Genexpression von anderen Mikroben zu ändern. Allerdings Bakterien produzieren viele andere kleine Molekül natürlichen Produkten, die keine bekannten Bioaktivitäten ¹ haben. Wir vermuten, dass Bakterien entwickelt haben und erhalten die Möglichkeit, einige dieser Stoffwe....

Protokoll

1. Wählen Sie ein Reporter Gene und Konstruieren Sie eine Leuchtstofftranskriptions Reporter

Für B. subtilis:

1. Siehe den Artikel in JoVE Referenz ¹⁹ für ein Protokoll beschreibt die Konstruktion von fluoreszierenden Reporter-Transkriptions in Bacillus subtilis.

Für andere Bakterienarten:

1. Identifizieren ein Gen, das bei der physiologischen Reaktion von Interesse hochreguliert wird. Dies kann auf bestehende Literatur oder Transkriptionsanalyse der Mikrobe unter bestimmten Bedingungen basieren.
2. Konstruieren Sie einen fluoreszierenden Rep....

Ergebnisse

Dieser Bildschirm wurde verwendet, um Bodenorganismen zu identifizieren sezer Verbindungen, die die Physiologie von B. ändern subtilis. Die hier beschriebenen Ergebnisse konzentrieren sich auf die Matrix-produzierenden Zelltyp von B. subtilis, die das Protein und Exopolysaccharid, die für robuste Biofilmbildung in diesem Bakterium benötigt werden produziert. Wir haben uns für den Promotor des Tapa-sipW Tasa-Operon für unsere fluoreszierenden Reporter-Konstrukt (P _Tapa-YFP).

Diskussion

Eine der inhärenten Beschränkungen des Protokolls ist, dass es auf der Kultivierbarkeit von mikrobiellen Organismen beruht. Wie gut dokumentiert ^24, die meisten mikrobiellen Lebens auf dem Planeten kann (noch) nicht unter den Kulturbedingungen bis heute erforscht angebaut werden. So wird eine große Anzahl von Interaktionen zwischen Mikrobenarten, die in natürlicher Umgebung auftreten, unerkannt mit diesem Ansatz. Da unser Wunsch ist es, die Existenz solcher Wechselwirkungen nicht nur zu identifizieren, dann a.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Spektralphotometer			Jedes Spektralphotomer, das OD600 Absorptionswerte messen kann.
Luria Brühe, Lennox	VWR	80017-484	Alternative Medienquellen können notwendig sein.
Glasperlen, 3 mm	VWR	26396-508
Gelladespitzen, rund	VWR	29442-666
Glasstäbe	VWR	59060-069
Fluoreszenzpräparierstereoskop	Zeiss	N/A	Der Autor verwendete ein Präparierstereoskop Zeiss Stemi SV6 mit einer EXFO X-cite 120 Leuchtstofflichtquelle, einem Langpass-YFP-Filterwürfel, einem achromatischen 0,63X-Objektiv, 10X-Okularen und einem Axio HRC HR Digitalkamera. Der größte Teil der Abschirmung wurde mit der Fokussierbajonette bei 2,0-3,2X durchgeführt. Jedes Präparierstereoskop mit Fluoreszenzfähigkeit ist in Ordnung, vorausgesetzt, Sie haben die richtigen Filter für den FP, den Sie verwenden. Am besten ist es, wenn es einen Shutter gibt, mit dem Sie einfach zwischen Hellfeld und Fluoreszenz wechseln können, sowie einen Tisch, der eine Beleuchtung von oben und unten ermöglicht. Wenn Sie Bilder aufnehmen möchten, ist auch eine angeschlossene Kamera erforderlich.