Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Zusammenfassung

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Zusammenfassung

Zellen, die in Kollagen- und Fibringelen eingebettet sind, befestigen und üben Zugkräfte auf die Fasern des Gels aus. Diese Kräfte können zu einer lokalen und globalen Reorganisation und Neuausrichtung der Gelmikrostruktur führen. Dieser Prozess verläuft auf komplexe Weise, die zum Teil vom Zusammenspiel zwischen der Position der Zellen, der Geometrie des Gels und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängt. Um besser zu verstehen, wie diese Variablen globale Faserausrichtungsmuster erzeugen, verwenden wir die DIC-Mikroskopie (Time-lapse Differential Interference Contrast) in Verbindung mit einem umweltkontrollierten Bioreaktor, um den Verdichtungsprozess zwischen geometrisch verteilten Explants (Cluster von Fibroblasten) zu beobachten. Die Bilder werden dann mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus analysiert, um Karten der Sorte zu erhalten. Die aus dieser Technik gewonnenen Informationen können verwendet werden, um die Mechanobiologie verschiedener Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen, was wichtige Implikationen für das Verständnis von Prozessen in der Wundheilung, Krankheitsentwicklung und Gewebetechnik-Anwendungen hat.

Einleitung

Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen ist das zellbevölkerte Kollagengel^1,2. Das Gel bietet eine 3D-Umgebung, die näher am In-vivo-Charakter des Gewebes ist und besser zum Verständnis des Zellverhaltens geeignet ist, als es traditionelle 2D-Kulturen³bieten. Frühe Studien, in denen Fibroblasten homogen in einem Kollagengel verteilt wurden, ergaben, dass die Zellen die Kollagenfasern schnell konsolidieren und das Gel^{verdichten 4,5}. Die kontraktilen Fibroblasten in frei schwebenden Gelen übergehen dann in einen Ruhezustand, kurz nachdem das Gel die Verdichtung vollständig erreicht hat^1,6,7. Die Fibroblasten in Gelen, die an den Grenzen eingeschränkt sind, verbleiben in einem aktiven, synthetischen Zustand⁸ und erzeugen faseralignment in einer Weise, die von der Gelgeometrie und externen Abhängigkeiten abhängig ist^5,9. Unterschiede in der Zellaktivität scheinen eine Folge der inneren Spannung (oder des Fehlens davon) zu sein, die sich entwickelt, wenn die Zellen Zugkräfte über Integrine auf die Kollagenfasern im Gel ausüben.

Eine Variante dieser Technik besteht darin, Fibroblastenexplanten(d.h. Zellklumpen) einen Abstand innerhalb eines Kollagengels zu platzieren und Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu beobachten und die allmähliche Entwicklung der Faserausrichtung zwischen den Explants (manchmal auch bänderähnliche Riemen genannt)^10-12zu beobachten. Der Hauptvorteil des Explantationssystems besteht darin, dass es ermöglicht, die Zellen in einfache geometrische Muster anzuordnen, was es einfacher macht, die Mechanismen, die der zellgesteuerten Faserneuausrichtung zugrunde liegen, zu visualisieren und zu untersuchen. Diese Ausrichtungsmuster, die in erster Linie vom Zusammenspiel von Zellzugkräften, zellräumlicher Verteilung, Gelgeometrie und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängen, sind wichtig zu verstehen, da sie eine zentrale Rolle in der globalen Gewebeorganisation, der mechanischen Funktion und der lokalen mechanischen Umgebung¹³spielen.

Im Bereich der Tissue-Engineering, eine Strategie für die Herstellung von mechanisch funktionalen, technischen Geweben beinhaltet die Kontrolle der Faserausrichtung Muster, die aus der Zellverdichtung entwickelt, so dass das technische Gewebe besitzt Faserausrichtung, die die des nativen Gewebes^{imitiert 14,15}. Eine solche Ausrichtung wird für technische Gewebe als notwendig angesehen, um das komplexe mechanische Verhalten nativer Gewebe zu replizieren. Eine Änderung dieser Strategie ist es, das Kollagengel durch ein Fibrin-Gel zu ersetzen¹⁶. Das Fibrin-Gel entwickelt ein ähnliches Ausrichtungsmuster wie ein Kollagengel während der Verdichtung. Im Laufe der Zeit wird das Fibrin abgebaut und durch zellsynthetisiertes ECM ersetzt, das dem anfänglichen Fibrinfaserausrichtungsmuster folgt. Das resultierende konstruierte Konstrukt hat die mechanischen Eigenschaften im Vergleich zu Kollagen-Gel-abgeleiteten Konstrukten deutlich verbessert¹⁷.

Der Ausrichtungsprozess und die anschließenden Umbauereignisse in Fibringelen verlaufen auf komplizierte und schlecht verstandene Weise. Um diese Wechselwirkungen und ihre Auswirkungen auf das Zellverhalten und die ECM-Umgestaltung besser zu charakterisieren, haben wir ein Verfahren entwickelt, das auf der Explant-Methode basiert. Bei dieser Methode werden Fibroblastenexplants auf einem Fibringel in verschiedenen geometrischen Mustern positioniert. Die Gele werden in einem umweltgesteuerten, mikroskopisch montierten Bioreaktor¹⁸gehalten und der Prozess der Verdichtung und Faserneuausrichtung wird mit der Zeitraffer-Differentialinterferenzkontrastmikroskopie (DIC) überwacht. Verschiebungsfelder werden mit benutzerdefinierten Algorithmen quantifiziert. Die aus diesen Experimenten gewonnenen Daten haben weitreichende Auswirkungen auf eine Reihe von Prozessen, einschließlich der Optimierung von Tissue-Engineering-Strategien, der Verbesserung der Wundheilung und der Behandlung pathologischer Gewebeumbauten.

Protokoll

1. Schablonenvorbereitung

Bereiten Sie eine Schablone auf Parafilm vor, um die Position jeder Explant nach der gewünschten Geometrie(Abbildungen 1A und 1B) zu erstellen. Raum jeder Explant ca. 1-2 mm auseinander. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand zur Erzeugung der Faserausrichtung zwischen Explants. Befestigen Sie die Schablone unter dem Bereich des Deckglases, wo die Probe mit Klebeband vorbereitet wird.

2. Sterilisation

Reinigen Sie alle Komponenten des Bioreaktors mit 70% Ethanol gründlich und sterilisieren Sie vor dem Experimentieren 2-3 Stunden unter UV-Licht. Wenn anstelle eines Bioreaktors ein alternatives Gefäß verwendet wird, sollten geeignete Sterilisationstechniken verwendet werden. Siehe Schritt 4.12 für Kommentare zur Verwendung einer Glasboden Petrischale.

3. Fibrin Gel Zubereitung

Nachdem die Komponenten des Bioreaktors sterilisiert wurden, werfen Sie eine dünne Schicht Fibringel auf die Oberfläche des Deckglases. Einzelheiten zur Herstellung von Fibrinogen- und Thrombin-Stocklösungen zur Herstellung von 6,6 mg/ml Fibringelen sind in Sander et al.beschrieben. ¹³ Ein ähnliches Protokoll von Ye et al. ¹⁹ zur Herstellung von 3,3 mg/ml Fibringelen können auch auf der JoVE-Website eingesehen werden.

1. Bereiten Sie eine Lösung von fluoreszierenden Mikroperlen in DMEM in einer Konzentration von 10 Millionen Perlen/ml vor. Die Perlen werden verwendet, um Gelverschiebungen zu verfolgen. Um diese Konzentration zu erreichen, kombinieren Sie 0,017 ml Mikroperlenlagerlösung und 0,149 ml DMEM in einem Mikrozentrifugenrohr.
2. Sonicate diese Suspension für 10 min, um die Perlen zu zerstreuen und die Lösung zu homogenisieren.
3. Fibrin Solution — In einem 15 ml c-Tube 0,22 ml Fibrinogen-Stammlösung mit 0,44 ml 20 mM HEPES-Puffer mischen. Fügen Sie die 0,1667 ml DMEM mit Mikroperlen in Schritt 3.1 erstellt.
4. Thrombinlösung — In einem separaten 15 ml c-Tube 0,0328 ml Thrombin-Lagerlösung, 0,131 ml 20 mM HEPES-Puffer und 0,00246 ml 2 M CaCl₂mischen.
5. Mischen Sie die Thrombinlösung (Schritt 3.4) vorsichtig mit der Fibrinogenlösung (Schritt 3.3), indem Sie 5-10x nach oben und unten pfeifen, bis die Lösung gleichmäßig verteilt ist. Vermeiden Sie das Einführen von Blasen so weit wie möglich. Um die Menge der produzierten Blasen zu reduzieren, achten Sie darauf, die Pipette beim Mischen nicht vollständig zu entladen.
6. Die Zugabe von Thrombin bewirkt, dass die Lösung schnell geliert wird (ca. 30 Sek.). Die Mischlösung so schnell wie möglich auf das Deckglas pfeifen. Lassen Sie das Gel bei RT polymerisieren.
7. Versiegeln Sie den Bioreaktor, setzen Sie die Heizblöcke ein und schließen Sie die Thermoelemente an den Temperaturregler an. Inkubieren Sie das Gel bei 37 °C für 15-30 min.

4. Zellexplant-Vorbereitung

1. Entfernen Sie das Medium aus dem T-75-Kolben, der die menschlichen dermalen Fibroblastenzellen enthält.
2. Spülen Sie die Oberfläche vorsichtig mit ca. 5 ml Phosphatgepufferter Saline (PBS) ab, um Serumproteine zu entfernen. Fügen Sie 1 ml Trypsin-EDTA hinzu und brüten Sie 3 min, oder bis die Zellen angehoben haben.
3. Nachdem die Zellen angehoben wurden, drehen Sie die Suspension in einer Zentrifuge bei 200 x g für 5 min nach unten. Entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem Volumen von DMEM wieder aus, das eine Endkonzentration von 20 Millionen Zellen/ml ermöglicht.
4. Während sich die Zellen in der Zentrifuge drehen, trennen Sie den Bioreaktor von den Heizblöcken und den Thermoelementen. Übertragen Sie den Bioreaktor in einen Biosicherheitsschrank und entfernen Sie den Deckel nach asskeptischen Techniken vorsichtig.
5. Erstellen Sie Explants, indem Sie 0,3 l der Zellsuspension auf das polymerisierte Fibringel pipetieren, und folgen Sie dem Muster auf der Schablone. Jede Explantation sollte etwa 6.000 Zellen enthalten. Stellen Sie sicher, dass Mikropipettespitzen mit geringem Volumen verwendet werden (0,1-10 l).
6. Zellen absetzen lassen und 1 Stunde bei 37 °C an der Fibrinmatrix anheften.
7. Wenn der Bioreaktor noch geöffnet ist, fügen Sie ca. 5 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 0,1% Amphotericin B und 10 mg/ml Aprotinin direkt in die Bioreaktorkammer. DMEM ist bicarbonatgepuffert und benötigt 5%_CO2, um einen neutralen pH-Wert zu halten. Da der Bioreaktor nicht mit_CO2versorgt wird, konditionieren Sie das Medium in einem Inkubator mit 5%_CO2 für 2-3 Stunden vor Gebrauch. Aprotinin ist ein Serin-Protease-Inhibitor, der weit verbreitet ist, um die Rate des Fibrinabbaus zu reduzieren²⁰.
8. Den Bioreaktor wieder versiegeln. Verwenden Sie eine Spritze, um zusätzlich 5 ml CO2-konditioniertes Medium über die Stachelbefestigung am Einlassanschluss zu liefern. Geben Sie das Medium langsam ab und stellen Sie sicher, dass das gesamte Volumen der Bioreaktorkammer gefüllt ist. Entfernen Sie vorsichtig Blasen, die sich im Bioreaktor bilden.
9. Versorgung des Bioreaktors mit frischem, um 5 %_{CO2-konditioniertem} Medium während des gesamten Experiments, um den pH-Wert zu erhalten, Nährstoffe zu liefern und Abfallprodukte zu entfernen. Richten Sie eine Spritzenpumpe mit einer 10 ml oder 30 ml Spritze auf, die mit 5% CO2-Konditioniertem Medium gefüllt ist. Schließen Sie die Spritze direkt an den Einlassanschluss am Bioreaktordeckel mit Luer-lock-montierten sterilen Schläuchen an. Entfernen Sie die männliche Armatur und befestigen Sie den Schlauch am Stachelbeschlag am Bioreaktor (siehe Abbildung 1C).
10. Stellen Sie die Perfusionsrate auf 0,01 ml/min ein. Verbinden Sie modifizierte Schläuche an beiden Auslassöffnungen und legen Sie die Enden in ein 100 ml Becherglas, um Abfall zu sammeln.
11. Verwenden Sie eine Laborbuchse, um die Höhen der Ein- und Auslasszuführungen so einzustellen, dass sich im Bioreaktor kein Druckdifferenzial entwickelt (siehe Abbildung 1D als Referenz).
12. Wenn kein Bioreaktor verfügbar ist, bereiten Sie Proben in 35 mm Glasboden Petrischalen mit Glasplatten vor. Verwenden Sie eine mit einer Deckbedeckungsgröße, die für den spezifischen Satz von zu verwendenden Zielen optimiert ist. Proben, die in Petrischalen zubereitet werden, sollten in einem Inkubator bei 37 °C und 5%_CO2gehalten werden.
    Hinweis: Polystyrol depolarisiert Licht und stört die DIC-Bildgebung, so dass Glasplatten verwendet werden sollten, wenn DIC-Bildgebung durchgeführt wird. Phasenkontrast ist eine geeignete alternative Bildgebungsmodalität. Die Übertragung von Geschirr zwischen Inkubator und Mikroskop erschwert die Bildregistrierung. Wenn Bilder nicht ordnungsgemäß registriert sind, ist die in Abschnitt 6 berechnete Belastung nicht korrekt.

5. Zeitraffer-Bildgebung

1. Nachdem die Probe vorbereitet ist, den Bioreaktor wieder versiegeln, die Heizblöcke und die Thermoelemente wieder anschließen und die Temperatur des Bioreaktors auf 37 °C einstellen.
2. Stellen Sie den Bioreaktor auf die vom Mikroskop montierte motorisierte Stufe. Positionieren Sie das 20X DIC-Ziel unter dem View-Port. Ein niedrigeres Vergrößerungsziel ist akzeptabel, insbesondere wenn keine präzisionsmotorisierte Stufe zur Verfügung steht. Stellen Sie sicher, dass Polarisator, Analysator und Prisma alle vorhanden sind. Alternativ können Samples auch mit Phasenkontrast abgebildet werden.
3. Öffnen Sie die Bildverarbeitungssoftware.
4. Konzentrieren Sie das Ziel auf den Bereich zwischen den drei Explants.
5. Speichern Sie die Koordinaten (x, y und z) dieser Position in der Bildverarbeitungssoftware.
6. Um den gesamten Bereich zwischen und um die Explants abzubilden, wählen Sie die Option zum Abrufen eines großen Bildes und angeben der Größe der Fläche. Dies ermöglicht die Erfassung mehrerer Bilder um den angegebenen Bereich und erstellt ein gekacheltes Bild, das einen größeren Bereich des Beispiels darstellt.
7. Stellen Sie die Belichtungszeit und die Lichtintensität auf die niedrigsten Werte fest, um den zelltoxischen Zelltod zu vermeiden, während gleichzeitig eine ausreichende Auflösung für die Unterscheidung zwischen Zellen, Mikroperlen und Fibrinfasern zur Verfügung steht.

6. Strain Tracking

Einzelheiten und Anweisungen zur verwendeten Dehnungsverfolgungssoftware (Abbildung 2) finden Sie unter Raghupathy et al. ²¹ Der Algorithmus ist ein benutzerdefinierter MATLAB-Code, der von http://www.license.umn.edu/default.aspxheruntergeladen werden kann. Beachten Sie, dass DIC-Bilder oft genügend Textur für die Dehnungsverfolgung haben. Die Mikroperlen werden als Kontrolle der berechneten Dehnungsfelder einbezogen. Wenn die Dehnungsverfolgung durchgeführt wird, ist es wichtig, dass die erhaltenen Bilder genau am selben Ort aufgenommen werden, so dass die Bilder registriert werden. Nicht registrierte Bilder erzeugen falsche Belastungen.

Ergebnisse

Die Gewebeumgestaltung ist ein komplexer Prozess, der zum Teil durch reziproke physikalische Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Matrix angetrieben wird. Die Zellen organisieren die umgebenden Fasern neu und erzeugen Spannung im Fasernetz. Die Ausrichtung von Fasern und mechanischer Umgebung steuert wiederum das Zellverhalten, sodass sowohl Zellen als auch Matrix global neu organisiert werden, um remodelliertes Gewebe zu erzeugen. In diesem Experiment begannen sich die Zellen der Explanten, zunächst in der M...

Diskussion

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Mechanik des zellvermittelten ECM-Umbaus zu beobachten und zu quantifizieren. Solche Prozesse liegen einer Reihe von biologischen Phänomenen zugrunde und haben wichtige Auswirkungen auf das technische Gewebe^2,22, die Verringerung der Narbe^1,23und das Verständnis pathologischer Gewebeumgestaltung^12,24. Der Einsatz der zeitrafferigen DIC-Mikroskopie ermöglicht es, die Verschiebung und Ausrichtung von Fibrinfasern, die als Folge von Zellzugkräften au...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Sigma-Aldrich	F8630
Sigma-Aldrich	T4648
Gibco	11965-092
Gibco	15140-122
Sigma-Aldrich	A2942
Sigma-Aldrich	H0887
Sigma-Aldrich	223506
Gibco	25200-056
Invitrogen	3000
Lonza	DE14-701F
Molekulare Sonden	F8858
GIBCO	A10483-01
GIBCO	11430-030
Fisher-Scientific	SS264-1
Sigma-Aldrich	A3428-25MG
Biotense Bioreaktor	ADMET
Ti-Eclipe Mikroskop	Nikon
# 0 35 mm Petrischale mit Glasboden	MatTek	P35G-0-20-C
# 0 35 mm Petrischale	MatTek	P35GTOP-0-20-C
Luer-Fittings aus Kunststoff, PVC-Schlauch mit Luer-Enden	Cole-Parmer	30600-65