Methodenartikel
Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.
Zellen, die in Kollagen- und Fibringelen eingebettet sind, befestigen und üben Zugkräfte auf die Fasern des Gels aus. Diese Kräfte können zu einer lokalen und globalen Reorganisation und Neuausrichtung der Gelmikrostruktur führen. Dieser Prozess verläuft auf komplexe Weise, die zum Teil vom Zusammenspiel zwischen der Position der Zellen, der Geometrie des Gels und den mechanischen Einschränkungen des Gels abhängt. Um besser zu verstehen, wie diese Variablen globale Faserausrichtungsmuster erzeugen, verwenden wir die DIC-Mikroskopie (Time-lapse Differential Interference Contrast) in Verbindung mit einem umweltkontrollierten Bioreaktor, um den Verdichtungsprozess zwischen geometrisch verteilten Explants (Cluster von Fibroblasten) zu beobachten. Die Bilder werden dann mit einem benutzerdefinierten Bildverarbeitungsalgorithmus analysiert, um Karten der Sorte zu erhalten. Die aus dieser Technik gewonnenen Informationen können verwendet werden, um die Mechanobiologie verschiedener Zell-Matrix-Wechselwirkungen zu untersuchen, was wichtige Implikationen für das Verständnis von Prozessen in der Wundheilung, Krankheitsentwicklung und Gewebetechnik-Anwendungen hat.
Ein wichtiges Werkzeug zur Untersuchung von Zell-Matrix-Wechselwirkungen ist das zellbevölkerte Kollagengel1,2. Das Gel bietet eine 3D-Umgebung, die näher am In-vivo-Charakter des Gewebes ist und besser zum Verständnis des Zellverhaltens geeignet ist, als es traditionelle 2D-Kulturen3bieten. Frühe Studien, in denen Fibroblasten homogen in einem Kollagengel verteilt wurden, ergaben, dass die Zellen die Kollagenfasern schnell konsolidieren und das Gelverdichten 4,5. Die kontraktilen Fibroblasten in frei schwebenden Gelen übergehen dann in einen Ruhezustand, kurz nachdem das Gel die Verdichtung vollständig erreicht hat1,6,7<....
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1. Schablonenvorbereitung
Bereiten Sie eine Schablone auf Parafilm vor, um die Position jeder Explant nach der gewünschten Geometrie(Abbildungen 1A und 1B) zu erstellen. Raum jeder Explant ca. 1-2 mm auseinander. Dieser Abstand entspricht einem idealen Abstand zur Erzeugung der Faserausrichtung zwischen Explants. Befestigen Sie die Schablone unter dem Bereich des Deckglases, wo die Probe mit Klebeband vorbereitet wird.
2. Sterilisation
Reinigen Sie alle Komponenten des Bioreaktors mit 70% Ethanol gründlich und sterilisieren Sie vor dem Exp....
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Die Gewebeumgestaltung ist ein komplexer Prozess, der zum Teil durch reziproke physikalische Interaktionen zwischen Zellen und der umgebenden Matrix angetrieben wird. Die Zellen organisieren die umgebenden Fasern neu und erzeugen Spannung im Fasernetz. Die Ausrichtung von Fasern und mechanischer Umgebung steuert wiederum das Zellverhalten, sodass sowohl Zellen als auch Matrix global neu organisiert werden, um remodelliertes Gewebe zu erzeugen. In diesem Experiment begannen sich die Zellen der Explanten, zunächst in der M.......
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Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Mechanik des zellvermittelten ECM-Umbaus zu beobachten und zu quantifizieren. Solche Prozesse liegen einer Reihe von biologischen Phänomenen zugrunde und haben wichtige Auswirkungen auf das technische Gewebe2,22, die Verringerung der Narbe1,23und das Verständnis pathologischer Gewebeumgestaltung12,24. Der Einsatz der zeitrafferigen DIC-Mikroskopie ermöglicht es, die Verschiebung und Ausrichtung von Fibrinfasern, die als Folge von Zellzugkräften au.......
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Es wurden keine Interessenkonflikte angemeldet.
Wir danken George Giudice und Steven Eliason für die Unterstützung menschlicher dermaler Fibroblasten und Ramesh Raghupathy für die Hilfe beim Dehnungsverfolgungsalgorithmus. Unterstützung für diese Arbeit wurde von einem U.S. Department of Education Graduate Assistance in Areas of National Need Fellowship (GAANN P200A120071)bereitgestellt.
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| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Sigma-Aldrich | F8630 | ||
| Sigma-Aldrich | T4648 | ||
| Gibco | 11965-092 | ||
| Gibco | 15140-122 | ||
| Sigma-Aldrich | A2942 | ||
| Sigma-Aldrich | H0887 | ||
| Sigma-Aldrich | 223506 | ||
| Gibco | 25200-056 | ||
| Invitrogen | 3000 | ||
| Lonza | DE14-701F | ||
| Molekulare Sonden | F8858 | ||
| GIBCO | A10483-01 | ||
| GIBCO | 11430-030 | ||
| Fisher-Scientific | SS264-1 | ||
| Sigma-Aldrich | A3428-25MG | ||
| Biotense Bioreaktor | ADMET | ||
| Ti-Eclipe Mikroskop | Nikon | ||
| # 0 35 mm Petrischale mit Glasboden | MatTek | P35G-0-20-C | |
| # 0 35 mm Petrischale | MatTek | P35GTOP-0-20-C | |
| Luer-Fittings aus Kunststoff, PVC-Schlauch mit Luer-Enden | Cole-Parmer | 30600-65 |
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